动物细胞表达制备药用蛋白
动物细胞工程制药的研究进展
动物细胞工程制药的研究进展动物细胞工程制药的研究进展1161001413167 刘星星摘要：动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。
本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其进展，包括动物细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等，在此基础上探讨了动物细胞工程制药的发展趋势。
关键词：动物细胞工程；生物制药；细胞融合；转基因动物；细胞培养2.传代细胞系(continuous cell lines,CCL)原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株称为CCL。
许多CCL 建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。
但 C C L 在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许 C C L 用于生产。
7 0 年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性, WI-38 是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。
二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养 5 0 代，且无致瘤性，现在C C L 已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。
表 1 列出了一些常用的生产用动物细胞系。
3.工程细胞系工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。
用于构建工程细胞的动物细胞有BHK-21、CHO-dhfr、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等细胞系[1-2]。
SP2/0 - A g 1 4 工程细胞系是通过融合的方法，从抗羊红细胞活性的 B A L B / c 的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P 3 X 6 3 A g 8 融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，可用于生产单克隆抗体[2]。
转基因动物制药PPT课件
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• 以下是科学家“制造” 出的最神奇、最古怪 的10种转基因动物。
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1、荧光鼠
• 2007年末，荧光鼠脑细胞的图片 传遍世界各地，从“福利客”超 市的宣传海报到“自然”杂志的 封面。这些五彩斑斓的脑细胞是 单个的神经元，鲜艳的色彩帮助 科学家将它们区分开来。英国哈 佛大学的杰夫-里奇曼为首的科 研小组在实验鼠的基因组中导入 水母的绿色荧光蛋白基因，使其 在紫色光线的照射下呈现出绿色 荧光。这种绿色荧光基因对小鼠 无害，只起到标记作用。
•
研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶
(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运
动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量
乳酸。乳酸可导致肌肉痉挛，即使耐力最强的运动员
也会发生肌肉痉挛。
•
科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化
能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也
能跑4到5个小时。这种老鼠最多能以每分钟20米的速
被疟原虫感染不会杀死普通蚊子，但是会降低其繁殖率。
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7、超级老鼠
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• 一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、 拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重……美国 科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人 们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，
改善人类的能力？第一只超级老鼠诞生于大约4年前。 如今，科学家已经培育出500只超级老鼠。
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6. 转基因蚊子
• 伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具 有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。研究者称，可以将 大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的 产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能 力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势蛋白质是生命机体中最重要的组成部分之一，在生物学、医学和工业领域都具有广泛的应用。
蛋白质表达则是将基因信息转化为蛋白质的过程，这一过程对于基础研究和工业化生产都具有重要作用。
在动物细胞中，蛋白质表达利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质具有一系列优势。
一、哺乳动物细胞表达的优势哺乳动物细胞是表达重组蛋白质的理想载体，其优势主要有以下几点：1.真核生物中的哺乳动物细胞能够在所有重组蛋白质修饰过程中提供最高水平的质量。
由于哺乳动物细胞在体内合成蛋白质时，可以发生多种复杂的修饰过程，例如酰化、糖基化和磷酸化等。
这些修饰可以提高蛋白质的稳定性、可溶性和生物活性，使重组蛋白质更加适合用于医学和工业方面。
相比之下，原核生物（如大肠杆菌）表达的蛋白质缺乏这些修饰过程，因此其生物活性和稳定性较低。
此外，哺乳动物细胞中的重组蛋白质也很少产生抗原性，因此更适合用于医学应用。
2.哺乳动物细胞中的蛋白质折叠和修饰过程更加类似于人类和其他哺乳动物中蛋白质合成的过程。
由于哺乳动物细胞与人类和其他哺乳动物有很大相似性，因此表达的重组蛋白质更符合人类进化历史和生物学功能。
这也意味着可以更好地预测重组蛋白质在生理环境下的稳定性和效力，缩短临床试验的时间和成本。
3.哺乳动物细胞表达的重组蛋白质能够以天然状态的形式分泌到培养基中。
重组蛋白质如果能够以天然状态的形式分泌到培养基中，可以节省纯化步骤和工艺流程，降低生产成本，提高重组蛋白质的产量和纯度。
而哺乳动物细胞中的重组蛋白质通常能够实现这一点。
此外，哺乳动物细胞的培养和维护工艺已经比较成熟，使用更加方便。
二、哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法有多种，主要有以下几种：1.哺乳动物细胞内表达哺乳动物细胞内表达是将重组质粒导入哺乳动物细胞内部，利用细胞自身的基因转录、转译和修饰等机制，表达出重组蛋白质。
动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展
动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展学院：专业：姓名：学号：动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展【摘要】近年来，由于哺乳动物细胞具有对重组蛋白质进行正确折叠、装配和翻译后修饰的优点，利用哺乳动物细胞生产医用蛋白质已成为生物制药产业的重要组成部分。
应用哺乳动物工程细胞系统生产药用蛋白显示了越来越重要的地位。
本文对动物细胞培养技术和提高蛋白质的产量进行了简述。
【关键词】动物细胞；药用蛋白；生产工艺近年来，动物细胞培养技术的快速发展极大地推动了现代生物医药产业的发展。
这一技术已广泛应用于蛋白质药物研发、疫苗制造、干细胞移植、人造组织器官培养等各个领域，日益成为当今生命科学研究和生物医药开发的强力工具。
目前，国内外一些科研机构和高新技术企业正专注于这一领域的研究与开发，并不断获得新的科研成果和技术产品。
这些新成果和产品的推广应用正引导着细胞培养工程技术走向当今生物医药领域的技术前沿［1］。
重组要用蛋白的翻译后修饰是充分发挥其药理活性、药代动力学行为以及体内稳定性所必需的。
这些翻译后修饰包括蛋白的正确折叠、二硫键的形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化以及充分糖基化，是在内质网和高尔基体内进行的。
因此，有必要用哺乳动物细胞表达形容生产治疗用重组活性蛋白，特别是对与结构复杂、分子量巨大，或是二硫键数目多，或糖基化程度高的蛋白。
有些天然结构的药用蛋白只能用哺乳动物细胞培养生产。
目前，投放市场以及临床中试中的重组蛋白有70%来自哺乳动物细胞培养。
随着哺乳动物细胞培养技术的发展和重组药用蛋白的需求，哺乳动物细胞培养生产的药用蛋白正在不断增加[2]。
以下就目前动物细胞大规模培养工艺以及提高药用蛋白质量的方法作一简述。
1.目前公开发表工艺的研究蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin，免疫球蛋白肿瘤坏死因子(TNF) 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta等。
动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。
哺乳动物细胞表达重组蛋白
哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处
表达载体 改进表达载体，提高表达水平和产量 分泌表达 下游纯化
宿主细胞 新型细胞株的建立
培养工艺
一、 真核表达载体
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含： 原核DNA序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备。 转录相关元件：哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件，以及终止子和加polyA信号序列。。 翻译相关元件：有效的mRNA翻译信号 其它：视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。
利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本
采用无血清／无蛋白培养基(SFM／PFM)来降低细胞培养和产 品纯化的成本。双无培养基
但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其 他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中细胞常表现出活力降 低、贴壁性差等现象，进而导致分泌目的蛋白的能力下降。
通过将生长刺激因子、黏附因子基因导入CHO细胞中，让 CHO细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在SFM／ PFM中生长良好。
抑制细胞凋亡，延长培养周期
细胞在大规模培养初期， 目的蛋白的表达和细胞的增殖速率呈正 相关。
但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分 和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐 凋亡，重组蛋白表达量逐渐降低。
哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中， 常用的细胞系有 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 人胚肾细胞HEK293
中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
11-10动物细胞表达制备药用蛋白
是直接取自动物组织器官,经过 消化分离而获得
的细胞悬液（109/g）。
需要大量动物，费钱费劳力。
常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、
淋巴细胞。
（2）二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的 组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞 株。
二倍体细胞有正常细胞的特点：
10.4 基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各
种工程细胞。
被用构建工程细胞的动 物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
10.4.1 真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 1） 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 2） 质粒载体
9.2.1 细胞死亡与凋亡
大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有 挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由 于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物 反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。 用基因工程方法将bcl—2基因这种细胞凋亡抑制 基因导入细胞，bcl—2基因的过量表达能抑制细胞凋 亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。
能产生胶原，培养基用BME （Eagle’ Basal medium）。10%小牛血清，pH7.2,
倍增时间为24h，有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。
MRC-5：从正常男性肺组织
中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。
用培养基加小牛血清。 同工酶G6PD B型。 有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不 良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。 用于生产疫苗。
哺乳动物细胞生产药用蛋白研究进展
哺乳动物细胞生产药用蛋白研究进展利用哺乳动物细胞大规模培养来生产重组蛋白技术已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。
专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10 年或20 年会有一个更为快速的发展。
蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力。
哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，开始常用的细胞系有CHO和HEK293两大类细胞。
使用较多的COS细胞，由于其强烈的贴壁作用，曾经限制了大规模悬浮细胞培养生产的实际应用。
随着生物技术的发展，CHO细胞可以贴壁培养，也可以经过驯化悬浮培养，是生产包括基因工程抗体药物（人源化或人源抗体）在内的重组糖蛋白的首选工具细胞。
HEK293细胞主要用于蛋白瞬时表达及腺病毒生产，尚未见以HEK293表达的药物获得批准。
目前，正在进行大规模培养生产的研发中的哺乳动物细胞株还有猿细胞衍生的Vero，Vero细胞是依赖于贴壁培养的细胞，主要用于病毒疫苗的生产；SP2/0和NS0主要用于制备杂交瘤细胞，生产鼠单抗，也有用来生产人源化单抗的报道；以及人的胚胎干细胞等。
建立和优化高效的表达载体系统是重组蛋白在哺乳动物细胞生产的关键，是抗体产业化的前提和瓶颈，是提高重组蛋白在单细胞中的表达量的基础。
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有原核基因序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因等，这样便于载体在原核细胞中扩增和大量制备。
另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列。
目前常见的哺乳动物细胞表达系统主要有二氢叶酸还原酶基因扩增系统及GS基因拷贝扩增系统，但是这两种扩增系统所需时间为6~12個月，蛋白的表达不能在早期得以预测，是此表达系统的限速步骤。
造成限速的原因是由于基因的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。
导致基因沉默的主要原因是目的基因所插入位点染色体的结构。
哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析
天然蛋 白质相似的特性而取得 了重要应用。从蛋 白质药物制造技 术发展来看， 考虑到哺乳动物细胞培养制备的蛋 白质药物质量 较 高， 并且制备过程难度低、 制备成本不高， 由此决定了哺乳动物细胞培 养制备充足蛋 白质药物将在未来的制药领域取得全 面发 展和应用。基于这一认识 ， 我们应认真总结哺乳动物 细胞培养制备 充足蛋白质药物取得 的进展 ， 并深入探讨哺乳动物细胞培养制 备 充足 蛋 白质 药物技 术 的 发展 前 景 ， 做好 哺 乳 动物 细 胞培 养 制备 充 足蛋 白质 药物 的 研制 工作 。 关键词 ： 哺乳动物细胞； 培养制备 ； 充足蛋 白质药物 ； 进展分析
１前 言 重复序列。 近年来新发现 的强启动子如人编在蛋 ￣ ｔ （ ｕ ｂ ｉ ｑ ｕ ｉ ｔ ｉ ｎ ） Ｃ基 因 在 近 年生 物 制药 发 展 中 ， 利 用 哺乳 动 物 细 胞 培养 制 备 充 足蛋 白 启动子 以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高 的活性 ， 而且具 质 已经 成 为 了重 要 的发 展 方 向。研 究 表 明 ， 哺 乳 动物 细 胞 培养 制备 有 更广 阔的 宿主 细胞 范 围 。 的 蛋 白质 ， 无 论是 在 制 备质 量 上 ， 还 是 在 蛋 白质 含 量 上 ， 都 达 到 了药 上述研究表 明， 不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化 用标 准 ， 并 且 在性 能 上 也 与 天然 蛋 白质较 为接 近 。基 于这 一 优 势和 表达载体 、提高蛋 白质药物在哺乳动物细胞中表 达量 的不变 的方 特点， 关于哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物的研究得到 了有效开 向 。 展， 并 取得 了积极 的研 究效 果 。结 合 目前 关 于 哺 乳 动物 细 胞 培 养制 ４ 哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物在生物制备过程 中取得 备充足蛋 白质药物的现状 ， 该 研究 在重组细胞系 、 重组表达载体和 的进 展 生 物 制备 过 程 中取 得 了积 极 进 展 。 哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在 生 ２哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物在重组细胞系 中取得的 物反应器中进行的单细胞悬浮式培养 ， 反应罐的体积可达 ２ Ｏ 吨。 为 进 展 了节 约成本 ， 减少动物血清对产 品的污染 ， 现在主要采用无血清培 Ｃ Ｏ Ｓ 细 胞 曾是 进行 外 源 基 因表 达研 究 中用 途 最广 的宿 主 ， 但由 养基 ， 目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的 于 其 严重 的贴 壁作 用 ， 限制 了大 规模 悬 浮 培 养 的实 际应 用 。 目前 哺 无血清培养基 ， 如Ｕ ｌ ｔ ｒ ａ Ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ， Ｐ ｍＣ Ｈ Ｏ， Ｐ ｒ ｏ ２ ９ ３ 等。 乳 动 物 细 胞生 产 重 组 蛋 白中 ，常 用 的 细胞 系有 Ｃ Ｈ Ｏ和 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３两 考虑到制药过程的现实需要 ， 提高生物制备能力是保证蛋 白质 大类细胞 。 Ｃ Ｈ Ｏ是 目前生物工程上广泛使用的细胞 。 该细胞属于成 药物制备取得实效的关键 。从 目前的研究过程来看 ， 提高生物制备 纤维细胞 ， 本 身 很 少 分 泌 内源 蛋 白 ， 因此 对 目标 蛋 白分 离 纯 化 工 作 能 力 的研 究 成果 主要 表 现在 以下 几个 方 面 ： 十分 有利 ， 是 表 达 复 杂生 物 大 分 子 的理 想 宿 主 。工 业 生 产 上应 用 较 ４ ． １培养方式可以为单细胞悬浮式培养 。 这样可以减少培养基， 多 的是 Ｃ ＨＯ — Ｋ１ 细胞 及 Ｃ Ｈ Ｏ ／ ｄ ｈ ｆ ｒ 一 细胞 ， 被 广 泛 地用 于 重 组 Ｄ Ｎ Ａ蛋 提高培养效果， 降低培养过程成本。 白的稳定表达生产。 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３细胞是转染腺病毒 Ｅ １ Ａ基因的人肾上 ４ ． ２反应罐的体积可以达到 ２ ０ 吨以上。 现有的培养实验将反应 皮 细胞 系 ， 它易于转染 ， 是 一 个 很 常 用 的 表 达研 究 外 源基 因 的 细 胞 罐的体积设定在 ２ Ｏ 吨， 并取得 了良好的培养效果。因此在蛋 白质制 株。利用瞬时基因表达方法 ， 采用悬浮培养系统 ， 可以快速 、 方便地 备过程 中， 可以根据实际需要扩大反应罐 的体积 ， 满足蛋白质制备 获 得 ｍｇ 级蛋 白。 需要 。 目前 还 有 一 些 哺 乳 动 物 细胞 株 正 在进 行 大 规模 培 养 生 产 的 研 ４ ＿ ３培养中使用无血清培养基 。 既降低培养基成本 ， 又减少了血 发中 ， 如来源于 Ｍａ ｄ Ｉ ｉ ｎ — Ｄ ａ ｒ ｂ ｙ 犬 肾的高分化 内皮 细胞株（ Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ １ 、 红 清中动物成分的污染可能。 系细胞株 、 以及人的胚胎干细胞等 。由于不同重组细胞系表达 的重 ５ 结束 语 组蛋白其稳定性和糖基化类型不同 ， 需要根据 目的蛋 白选择最佳的 通过本文的分析可知 ， 结合生物制药 的研究与发展形势 ， 哺乳 重 组 细胞 系 。 动物细胞培养制备充足蛋白质药物已经成为了可能 ， 从目 前 的研究 从上述研究成果来看 ， 哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药 物在重 来看 ， 哺乳动物细胞培养制备充足蛋 白质药物取得了积极进展 ， 在 组细胞 系中取得了积极进展 ，其产生的影 响主要表现在两个方面 ： 重组细胞系、 重组表达载体和生物制备过程中都取得了进展和突 哺乳动物细胞系 的分类越来越清晰 ， 主要分为 Ｃ Ｈ Ｏ和 Ｉ － Ｉ Ｅ Ｋ ２ ９ ３ 破 。为此 ， 我们应积极推动哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物
第十一章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白(1)
细胞质 细胞壁
代表生物
除核糖体外，无其它的细胞器。 有各种细胞器。 有。主要是肽聚糖。
放线菌、细菌、蓝藻、衣原体
植物细胞、真菌有，动 物细胞无。
真菌、植物、动物
第二节 动物细胞的形态与生理特性
1. 贴壁细胞的生长特征
成纤维细胞
人胃腺癌细胞
2. 悬浮细胞的生长特征
白细胞细胞：K562
腹水瘤细胞：Ehrlich腹水瘤细胞EAC
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
维生素：
主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12 都是培养基常有的成分。
无机离子与微量元素
细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微
量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
一、培养基的基本要求
2. 促生长因子及激素
3. 兼性贴壁细胞
CHO-K1
CHO－K1
动物细胞的化学组成与代谢
大分子： 蛋白质 核酸 糖 脂质
大分子代谢的三个阶段
1.三大营养素水解为单体 2.中间产物的生成 3.三羧酸循环
产能代谢：三羧酸循环
葡萄糖产能对比
供氧不足：糖酵解途径 2 ATP; 供氧充分：三羧酸循环 36～38 ATP； 动物细胞大规模培养：供氧成为生物反应器设 计的最重要的因素之一！
1. 营养成分
氨基酸
氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸： 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。
此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是
核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所 需要的基本物质。
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗摘要动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。
动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。
对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。
传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。
本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。
研究背景动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。
1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。
法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。
流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。
由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。
20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。
进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。
2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。
哺乳动物蛋白表达系统.docx
哺乳动物细胞表达系统背景简介哺乳动物细胞表达系统以哺乳动物细胞作为宿主进行蛋白表达生产，具有转录后修饰、蛋白 正确折叠与装配等功能，表达的蛋白更接近天然状态，并且很多蛋白可以经哺乳动物细胞分泌到 细胞外，这利于蛋白的别离。
如果缺少正确的转录后修饰，可能影响蛋白质的稳定和配体结合, 进而增加免疫原性，因此正确的转录后修饰对于治疗蛋白的生产非常重要。
但是哺乳动物表达系 统也具有细胞系生长缓慢、生长环境要求严格、易污染、费用高昂等缺点。
哺乳动物细胞已经成 为治疗蛋白生产的主力军，生产的治疗蛋白有上百种。
非洲绿猴肾细胞（COS ）适合于小规模的 单抗制备，如果要大规模地生产，最常用的是中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）细胞。
图1、哺乳动物细胞表达系统生产重组蛋白的流程示意图。
转染哺乳动物细胞的转染有瞬时转染和稳定转染两种。
瞬时转染不会将载体整合到宿主基因组 中，可以快速生产少量的蛋白，瞬时转染还可以帮助测试比拟不同的载体，这对建立稳定表达细 胞系非常有必要。
瞬时转染方法有氮化钙法、磷酸钙法、DEAE —葡聚糖法、PEI 法和电穿孔法 等。
瞬时转染适用的细胞系有COS （非洲绿猴肾细胞）、BHK （叙利亚仓鼠肾细胞）、HEK 293 （人胚肾细胞293）等等。
这几个细胞系能进行快速转染，可以悬浮培养，还能在不含血清的培 养基中生长，这有助于表达蛋白的纯化并减少污染的可能性。
当用PEI 法对HEK293细胞系进Host cell lineTransfectionRepeat with increasing drug concentrationsExpression vector TTTTTTT lllllll©Single Cell Cloning or ILimiting Dilution fPreliminary clone evaluation and Expansion of selected clones行瞬时转染，可以得到50-80%成功表达GFP (绿色荧光蛋白)的重组子。
哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物研究进展
区较松驰，转录活跃。染色体的这两种状态与组蛋白的修饰（乙酰化、甲基化、 磷酸化）有关，蛋白修饰控制了染色体的浓缩和转录活性。大约有５０％的重组细 胞在选择性压力移去后的数天内就会发生快速沉默，而大约有３０％的细胞会选择 性压力移去后的６个月内就会逐渐减少目的基因的表达，称为慢沉默。最后大约
开发了自己的哺乳动物表达载体，主要添加了一些其它的元件以增加目的基凼的
表达水平，如ｐＳＳｌ８５质粒引入ＨＩＶ病毒的转录活性元件ＴＡＴ／ＴＡＲ，ｐＴＴ质粒则引 入腺病毒的内含子剪接元件以增加ｍＲＮＡ稳定性和蛋白质翻译速度。 ～旦克隆细胞系获得后，必须对其蛋白质表达的稳定性作出评价。由于基因 的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。导致基因沉默的主要原因是目的
８０年代，哺乳动物细胞生产罩组蛋白质的研究｝要在旋转培养瓶中进行，
由于这些容器体积较小，仪有约５０毫升，另外这种容器的液相体积传质系数 （Ｋｌａ）约为２－３／ｈ，最大的细胞密度仅为２＂３Ｘ１０６
ｃｅｌ ｌｓ／ｍｌ。因此，旋转式小
瓶细胞培养不适用于大规模培养。轨道式振摇瓶，约５０ｍｌ体积的通气瓶，作为 一种小规模哺乳动物细胞培养装置，细胞密度达到１０７细胞／ｍｌ，在适当的搅动 速度下，Ｋｌａ可以达到１０—２０／ｈ。由于具有良好的传质系数，可以有效地克服氧 对高密度细胞培养的限制，这种装置可作为实验室规模的前期研究。 目前大规模哺乳动物细胞培养绝大数是在不锈钢搅拌式反应罐中进行的，现
在过去的２０多年中，哺乳动物细胞制备重组蛋白技术发生了巨大的变化。主
要表现在（１）细胞培养时间延长，由过去的７天延长至２１天；
（２）细胞密度
（３）
增加，由过去的卜２Ｘ１０６细胞／毫升，增加到现在的卜１．５Ｘ１０ ７细胞／毫升；
11 动物细胞培养与表达制备药用蛋白
（二）动物细胞培养类型与形态
体外生长的动物细胞一般具有贴附性、细胞接触 抑制性、密度抑制性的特点。 1、类型： 贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在 固体或半固体表面才能生长，另外也包括细胞 间相互接触。 悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同，动物 细胞中只有极少数细胞体外生长可在培养液 中悬浮生长，培养密度高、效率高。血液白细 胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。 P98
（3）生长周期：一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从 组织块四周长出，24小时后可再补充培养液，3-5天即可形成 单层细胞再更换培养液即首次传代培养 ，若5-7天组织块中央 的组织细胞逐渐坏死脱落。
2.2 组织消化原代培养法
（1）取材与消化—酶解法制备单细胞 根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动 物细胞团或单个细胞，然后进行培养。 最常用的有胰蛋白酶和胶原酶，此外链霉蛋白酶、粘 蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。 消化传代细胞常用EDTA与胰蛋白酶一起使用。
3、动物培养基
对于营养要求非常苛刻，包括必需氨基酸、维生素、
碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子、血 清等。 分为：天然、合成、无血清培养基三种。
（1）天然培养基
常用动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液 、鸡胚胎汁等。 优点：营养价值高，培养效果好 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高
血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝 或去纤维蛋白法)的血浆。
（3）无血清培养基
血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的 成分 血清培养基缺点： （1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用
. （2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过 程不易检测控制。 （3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养 产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。
重组人血白蛋白在哺乳动物细胞培养中的应用
重组人血白蛋白在哺乳动物细胞培养中的应用关键词：重组人血白蛋白；细胞培养目前，哺乳动物细胞大规模培养技术已经成为生物技术制药中不可缺少的一部分，利用动物细胞培养技术生产的生物制品越来越多，这些生物制品主要包括人用疫苗、基因工程药物、基因治疗药物、抗体药物以及动物疫苗等，而组织工程和干细胞疗法拓宽了细胞培养技术的应用范围。
人血白蛋白作为动物细胞培养基中的重要组分之一，在动物细胞培养中已经应用了很多年。
本文就重组人血白蛋白（Recombinant Human serum Albumin，rHSA）在哺乳动物细胞培养中的应用情况作一综述。
1 人血白蛋白的结构特征人血白蛋白（Human serum Albumin，HSA）是人血浆中含量最丰富的蛋白质（42±3.5g/l），也是血浆蛋白质中少有的非糖基化蛋白之一，占血浆总蛋白的40~60%，在细胞生理活动中起着重要的作用。
其单链多肽由585个氨基酸组成，相对分子质量(Mr) 约为66500。
X射线晶体结构揭示了其是一个80×80×30Å的心形分子，含67%α-螺旋，没有β-折叠〔1〕。
白蛋白结构的显著特征是有三个同源区域：I、II 和III。
每个结构域又分别由2个由4~6个α-螺旋组成的亚结构域A、B组成，以高度不对称的方式装配成分子（见图1）。
HSA 有35 个半胱氨酸残基，其中34个组成17对分子内二硫键，另有一个自由的半胱氨酸残基Cys34，从而确保了其亚结构域的刚性结构。
这个Cys34在白蛋白的氧化还原反应中起着至关重要的作用。
结构研究表明，重组人血白蛋白与血源人血白蛋白结构完全相同，替代血源人血白蛋白进行细胞培养时，其作用功能完全相同。
图1 人血白蛋白结构示意图2 重组人血白蛋白在细胞培养中的作用人血白蛋白在细胞培养中有多种生理功能，可概括为：重金属螯合剂；自由基清除剂；渗透压和pH值的调节剂；稳定剂；生长因子的运载体；表面活性剂以及营养剂〔2〕。
哺乳动物细胞高效表达系统研究进展
第34卷总第89期2013年3月西北民族大学学报(自然科学版)J ournal of N or t hw es t U ni ve r si t y f or N at i o nal i t i es(N at ur al Sci enc e)V oI．34．N o．1M ar ch，2013哺乳动物细胞高效表达系统研究进展柏家林1，2(1．甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)[摘要]哺乳动物细胞高效表达系统是生物制药工业中十分关键的环节，而表达载体和宿主细胞又是哺乳动物细胞表达系统的两个重要组成部分．文章较详细综述了通过目的基因整合位点的优化、增加目的基因拷贝数、提高目的基因的转录和翻译水平等构建哺乳动物细胞高效表达载体的研究进展．同时。
为使宿主细胞更好地适应工业化大规模培养要求，对通过抗凋亡、细胞周期调控、糖基化、细胞增殖控制技术和多基因代谢等细胞代谢工程对其进行改造的研究进展也作了介绍．[关键词]哺乳动物细胞；高效表达载体；细胞代谢工程；生物工程制药[中图分类号】Q811．4[文献标识码]A[文章编号]1009—2102{2013)01—0043—09利用哺乳动物表达系统生产药用蛋白是21世纪生物制药工业的主要发展方向．用于制备基因工程药用蛋白的表达系统有原核和真核表达系统．原核表达系统主要是大肠杆菌表达系统，它具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度发酵生产、成本低等优点，成为表达产物不需要修饰的小分子蛋白类药物的首选表达系统．而对于糖蛋白和全抗体类生物药物来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化的有无以及糖基化的类型常常影响表达产物的合成分泌、生物活性、药代动力学行为、体内稳定性以及免疫原性等特性．由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等进行糖基化的细胞器，所表达的产物是非糖基化的，且常以包涵体的形式存在．而酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞又不一样，表达产物寡糖链末端多为甘露糖(m ar i nose，M an)、N一羟乙酰神经氨酸(N—gl ycol yneur am i ni c aci d，G l cN A c)和半乳糖(gal act os e，G al)，它们均容易被肝细胞、巨噬细胞表面的受体识别而清除…．特别是G l cN A c寡糖链，除在人的胚胎期体内存在外，成人一般都不表达，因此对人可能有免疫原性．目的基因在哺乳动物细胞中的表达产物不但能正确组装成多亚基蛋白，而且与天然蛋白的结构、糖基化的类型和方式几乎一致．常用于药用蛋白生产的哺乳动物细胞有3T3、C H O、B H K、H e l a和H epG2，约70％药用蛋白用C H O细胞生产【2J，而且C H O细胞能在10000L以上生物反应器中高密度、无血清悬浮培养【3,4J．经过近30年的努力，已有报遭单个细胞每天表达蛋白量达20Pg的工程细胞株【5】，分批补料式生物反应器悬浮培养细胞密度达2000万细胞／m L 以上，蛋白产量高达10g／L[3,6,7】．但与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平仍较低、获得高表达工程细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高．因此，建立哺乳动物细胞高效表达体系包括高表达载体构建、高表达工程细胞株的获得、生物反应器无[收稿日期】2012—12—20【基金项目]中央高校基本科研业务费专项资金项目(zyz2011074)，校企合作项目(h2011—19)．[作者简介]柏家林(1966一)，男，甘肃天水人，理学博士，博士后，教授，主要从事功能基因组学、动物分子育种及生物技术相关面的研究．一43—血清高密度培养工艺以及目标蛋白的分离纯化工艺，是生物制药工业研究和生产的关键技术．本文就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞改造的研究进展作一介绍．1哺乳动物细胞高效表达载体的构建目的基因在哺乳动物细胞中的表达受目的基因所整合染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率的影响．构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化、转录与翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑．1．1整合位点的优化目的基因在C H O细胞染色体上整合位点的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性作用．只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因．因此，保证将表达载体整合在C H O细胞染色体上转录活跃位点的细胞克隆挑选出来是提高C H O细胞表达水平的关键步骤之一．1．1．1利用选择基因的弱化表达提高转基因表达水平选择基因(如neo、dhf r)的弱化表达，可使大量整合在低表达位点的细胞由于选择标记基因表达量不足而在选择培养基条件下中毒死亡，只有那些少量整合在转录活跃区的细胞由于表达足够的选择基因产物而存活下来形成克隆．通过在转录水平、翻译水平和构建活性降低的选择基因突变体可实现选择基因的弱化，如将选择基因置于缺失增强子的SV40启动子控制下或内含子中、改变K ozak序列、在选择基因起始密码子A TG前加不同读框的A T G等．B r i an将(1996)选择基因dhf r置于目的基因前一个人工内含子中构建了双顺反子表达载体C M V—D I—t PA，通过筛选表达dhf r基因的克隆，将目的基因的表达量提高了11倍【8]．W em er等(1998)在neO的内部插入一个人工内含子，使用这种载体筛选到的阳性克隆经基因扩增后C D20单克隆抗体的表达量高达2r ag／m L[91．1．1．2利用核基质附着区提高转基因表达水平在载体上添加染色体上的某些特定序列如核骨架附着区(scaf f ol d a t t ac hm e nt r egi on，SA R s)或核基质附着区(m at r i x at t achm ent r egi on，M A Rs)，可使表达载体整合到宿主细胞染色体后能模拟染色体的高转录活跃区，从而使形成的阳性克隆较均一地高效表达目的基因．K odur i(2001)用反义遗传学方法克隆了表达载体在高表达C H O细胞株染色体上整合位点两侧的侧翼序列H I R PE(hot sp ot f or i nc r eased r ecom bi nant pr ot ei n expr essi on)，发现这些序列富含转录活跃区的类A l u序列、基质附着区等元件．他们用H I R PE构建了pTV l载体，使C TLA4～I g在C H O细胞中的基础表达水平提高了10倍【10|．E m er y (1998)用由p一球蛋白基因的位点控制区(10ci cont r ol r egi on，LC R)的超敏感位点(hyper s ens i t i ve s it es)第2、3和4的核心元件构成了一段序列，它能使鼠红白血病细胞(m ur i ne er yt hr ol e ukem i a，M E L)的克隆形成率提高94倍，且能明显提高a一球蛋白的表达量【11]．K i m等(2004)用人J3一球蛋白基因M A R s 构建的载体转染细胞后的表达水平比对照组提高了7倍，并且在每次用叶酸类似物氨甲喋呤(am et hopt er i n，M T X)加压后不用挑选单克隆，大大缩短了获得高表达细胞株的周期[12|．1．1．3利用位点特异性重组提高目的基因表达水平一种方法是通过位点特异性重组将目的基因整合到细胞基因组中的转录活跃区，即先将含有定点重组位点的选择标记基因整合到染色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系，在重组酶介导下，表达载体通过位点特异性重组定点整合在染色体高表达区，如C r e—k】(P和Fl p—Fr t位点特异性重组系统．K i t o等用带有dhf r扩增基因及融合了Lo】【P 位点的绿色荧光蛋白融合基因的质粒转染C H O—dhf r一细胞株，经过筛选并用M TX加压扩增后得到了可进行基因扩增的定点整合C H O细胞系【131．I nvi t r ogen公司则用Fl p—Fr t位点特异性重组系统建成了多种商品化的定点整合系统，包括293细胞、B H K细胞和正常C H O细胞．但这些细胞的整合位点没有经过系统的优化筛选，而且不能很好地与常用的加压系统(如M TX加压扩增系统等)配合，定点整合一44—的外源基因的表达水平通常都较低．刘志刚等(2004)借助于位点特异性重组和高效筛选，实现了FRT 位点在C H O—dhf r一细胞基因组中转录活跃区的整合，单链抗体一尿激酶融合基因表达量达5t,g／(106细胞24h)¨4|．另一种方法是利用体细胞同源重组即基因打靶技术，实现目的基因定点整合在宿主细胞染色体转录活跃区，但由于体细胞基因打靶比较困难，目前只有少量成功报道【l0I．目前关于真核细胞在染色体水平上调控基因表达的机制还不完全明了，染色体高转录活跃区的鉴定及分离费时费力而且不能保证所获得的就是转录的最活跃区．相比较而言，通过选择基因的弱化，利用位置效应来提高转录效率从而达到目的基因的高表达是一种更为有效的方法．1．2增加目的基因拷贝数单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都是有限的．因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的C H O工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的重要环节．目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法，如二氢叶酸还原酶(dhfr)和／或谷氨酰胺合成酶(G S)是常用的扩增基因[15，16]．C H O—dhf r扩增系统常采用dhf r基因缺陷的细胞株(C H0一dhf r一)，可使目的基因的拷贝数扩增至1000余倍．W em er 等(1998)在nEo基因的内部人工内含子中放置目的基因和dhf r基因偶连的表达单元，通过用M TX对阳性克隆dhf r扩增，C D20单克隆抗体的表达量高达2g／L[9|．与dhf r扩增基因相比，G s扩增基因是一种显性基因扩增选择标志，应用G S基因扩增系统常只需l～2轮蛋氨酸黄酰胺(m et hi oni ne sul phoxi m i ne，M SX)加压筛选即可获得高表达细胞株，扩增效率较高，并且在含有G S基因的细胞株中也可得到有效的基因扩增．在C H O细胞中，G S经1轮扩增，基质金属蛋白酶组织抑制因子(t i s sue i nhi bi t o r of m et al l opr ot ei nas es，TI M P)的表达量能从每106细胞9弘g／d提高至110扯g／dt22|．B ebbi ngt on 等用1株以G S作为扩增基因的鼠骨髓瘤细胞(N So)表达人一鼠嵌合抗体，经l轮扩增后，其表达水平为每106细胞10～15gg／d[17I．1．3转录水平在目的基因拷贝数一定、整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建来说显得尤为重要．启动子及其相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及m R N A的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素．因此人们希望通过寻找转录起始效率高、适用范围广的启动子、增强子来提高目的基因转录水平的表达效率．目前常用病毒源性和细胞源性的强启动子，如m C M V、hC M V、hE Fl a、人C—f os、鸡胞浆8一肌动蛋白等启动子．Bi等发现在含有人C—l os启动子和绿色荧光蛋白(G FP)的报告基因系统中，C —f os启动子控制下G F P的平均表达量比C M V启动子下的更高[18]．研究表明C M V启动子在细胞处于S期、细胞生长迅速时，转录活性最高．但在大规模生产的中、后期，多数细胞生长不旺盛时，可显著影响外源基因的表达水平．与之相比，hE Fl a启动子的转录起始效率更强，并且其转录活性不受细胞周期影响，更适合大规模生产重组蛋白．除寻找强启动子、强增强子之外，用含有不同启动子、增强子的组成元件构建转录效率更高的杂合启动子或杂合增强子也不失为提高转录效率的一个好方法．M a sayuki 等(1997)发现C M V增强子能提高hEF—l a启动子控制下目的基因表达量4～9倍[19]．K i m等发现将hE Fl a启动子的第1个内含子置于m C M V启动子与荧光素酶之间能极大地提高目的基因在C H O细胞中的表达，使荧光素酶的表达量提高了8．2倍【20I．xu等(2001)对CM V和B一肌动蛋白的启动子和增强子、内含子及SV40、B G H和m R B G的pol y(A)等不同转录调控元件的多种组合在H eL a、H epG2和E C V304细胞中进行了系统比较后发现，m R B G的pol y(A)比SV40和B G H的pol y(A)的适用范围更广，能更有效地提高目的基因的表达【21J．在转录过程中，转录因子通过D N A结合结构域特异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启始基因的转录和表达．因此，提高宿主细胞转录因子的表达水平也能增强目的基因的表达．C ocket t(1990)将反式作用于C M V启动子的腺病毒E I A蛋白基因整合到C H O细胞中，通过提高C H O细胞E I A的表达水平，使C M V启动子控制下的一45—TI M P基因表达水平提高了10倍[22|．另有研究表明，EG F和H RG一91(H e r egul i n be t a1)能提高E FI a m R N A的转录量和蛋白质的表达[23|．R eza等(2002)将用作结合D N A的锌指结构和V Pt6蛋白的转录激活结构域融合构建了人工转录激活因子．通过表达人工转录激活因子，将C M V启动子的转录效率提高了2倍多[24|．随着真核细胞在转录水平调控机制的进一步研究，杂合或人工启动子以及人工转录激活因子的构建将是更为有效的提高转录效率的方法．1．4翻译水平除了转录水平的调控外，翻译水平的调控(如m R N A寿命、m R N A的翻译起始效率)和翻译产物加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要影响．pol y(A)的存在不但能影响m R N A稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高m R N A翻译水平．内部核糖体进入位点(i nt er nal r i bosom e ent r y si t e，I R E S)能使同一m R N A中除第1个基因之外的其他基因得到有效表达．翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率．Jacks on首先从细小R N A病毒中发现了I R ES．I R ES下游的开放阅读框采取不依赖帽子结构的方式，直接起始翻译．同时，I RES有效介导的内部起始翻译要求起始密码子处有一个有利的翻译环境，当第一个A U G周围序列不利于翻译起始时，I R ES可增强下游A U G的翻译起始[25]．如在V EG F的5’端非翻译区包含1个有功能的I R ES，当eI F4复合物成为限制因素时，I R ES介导的内部起始翻译与其他m R N A竞争时存在优势，它能在依赖帽子结构翻译受损时提供一种有翻译能力的m R N A[26]．此后，Paul ous等(2003)依据IRE S的初级序列和二级结构的保守性以及在离体情况下它们对内部起始翻译要求的条件，将小核糖核酸病毒的IRES分为3类：肠遭病毒(ent erovi r us)和鼻病毒(rhi novi rus)的I R ES，它们在兔网状细胞裂解液(r abbi t r et i cul ar ce l l l ysa t e，R R L)中缺乏特殊的细胞蛋白时不能有效起始翻译；脑心肌炎病毒(EM C V)和口蹄疫病毒(FM D V)的I R ES在不补充R R L时也能有效起始翻译．盐浓度的波动和2A或LB蛋白酶介导的el F4G切割对这类IR ES介导的起始翻译的影响不显著．甲肝病毒的I RE S，它在RR L中高度有效，但在R RL中添加细胞的粗提物时不能刺激它，在eI F4G受2A 或L B蛋白酶切割时受抑制[271．由于第2类IR ES具有对细胞微环境的广泛适应性和内部起始翻译效率高的特点，它已经广泛应用于双顺反子或多顺反子的哺乳动物细胞表达载体的构建．K auf m an等(1991)通过在双顺反子内加入EM C V的内部核糖体进入位点实现了提高目的基因在双顺反子表达载体中的表达效率‘28f．翻译增强子是具有与IR ES不同二级结构的另一类提高翻译起始效率的顺式调控元件．St ei n等(1998)发现在组织缺氧情况下，V E G F m R N A寿命大为提高，V EG F翻译增强的程度可高达40倍，由此发现了具有翻译增强子和IR ES双重功能的V EG F163片断[26]．C hr i st i an在纤维细胞原生长因子2 (F G F一2)的3’端非翻译区发现了2个能使C A T的翻译效率提高9倍的独立元件TE l和TE2,它们之间具有累积效应，能与FG F一2m RN A的5’端非翻译区协同作用，增强翻译效率达12倍[29]．V i vi nus (2001)在H sp70m R N A的5’端非翻译区发现了一个能作为m R N A通用翻译增强子的元件．H sp70 m R N A的翻译增强子没有I R ES结构，它在C A T编码区上游能提高C A T的表达效率10倍，并且能在依赖于帽子结构的翻译过程中起到增强翻译效率的作用【30】．用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因密码进行优化是另一种提高翻译效率的方法．K i m等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人EPO基因，再以酵母偏爱的密码子编码人E PO基因作对照来比较优化，结果人优化E PO基因密码子比非优化人E PO基因密码子的表达效率高2～3倍[31]．2宿主细胞的改造随着对细胞代谢途径和调控机理的深入了解，越来越多的研究集中在对细胞本身进行改造的代谢工程来达到优化细胞生长状态，提高产品产量和质量，延长生产周期的目的．目前哺乳动物细胞的代谢工程包括抗凋亡工程、细胞周期调控工程、糖基化工程、细胞增殖控制技术和多基因代谢工程等．2．1抗凋亡工程——46——细胞在大规模培养初期，目的蛋白的表达与细胞的增殖速率呈正相关．但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐凋亡(apopt osi s)，重组蛋白表达量逐渐降低．细胞凋亡是一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡，生物反应器中大多数细胞的死亡都是因细胞凋亡引起的．为防止细胞培养过程中的细胞凋亡，一般可采用如下三种重要措施：①通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏．②用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程．③采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞．由于细胞凋亡是由一系列蛋白质控制的过程[32I，因此在目的细胞中引入某些特定基因有可能抑制细胞凋亡的发生．抗细胞凋亡的原癌基因bc l一2(B淋巴瘤／自血病蛋白一2)是被研究得最多的细胞凋亡基因，它在细胞凋亡级联反应中处于重要环节．通过遗传工程使哺乳动物细胞表达抗凋亡基因bc l一2，在大多数情况下虽不能防止细胞死亡，但能延长细胞寿命，增加产物产量【33|．Si m ps on等(1997)将bcl 一2稳定转染TB／C3细胞后，细胞活力增强，抗体滴度上升【341．I t oh等(1995)也同样发现转染了bc卜2的2E3细胞，其抗体生产能力比未转染细胞提高了4倍【351．bc l一2家族中的另外一些成员可能也有与bcl一2一样甚至更强的抑制细胞凋亡的作用．如bc l—X L在许多哺乳动物细胞中得到表达后，可对有些诱导因素如营养物缺乏、辐射和糖皮质激素等引起的细胞凋亡有抑制作用[36,37】．另外有实验表明，当共表达bag一1和bcl-2基因时，可产生有相同或协同抗细胞凋亡作用[38|．L e e等(1996)在提高bcl-2表达水平的同时降低凋亡的最终执行者C as pase一3的表达水平，能明显提高细胞的抗凋亡能力[39I．近年来，人们将抗凋亡基因bc卜2应用于动物细胞培养做了大量工作[40|．另外，对bcl—X L或bcl—2的突变体研究表明，抗凋亡基因的出现可对抗营养及血清限制、有毒物质和代谢废物积累、氧消耗、流体力学应激等引起的凋亡，提高细胞活性，延长培养周期，增加最终细胞密度和产物浓度．Fi guer oa等(2004)在C H O细胞内同时表达抗凋亡基因aven和bcl一2家族成员bcl—X L，同时表达比单独表达ave n或bcl—X L具有更强的抗凋亡能力，在无血清培养基中的各重组细胞的活力分别为85％，50％和30％[41]．另外，采用反义技术将前凋亡基因c—j H n转染细胞也可获得具有抗凋亡以及增殖受控的细胞系，亦是抗凋亡的一种策略【42|．2．2细胞周期调控工程理想的生产过程必需同时维持细胞活性状态以及产物蛋白的表达，即首先使细胞快速增殖到高密度，在细胞凋亡发生之前，控制细胞增殖速率并诱导其进入一个增殖静止期，即产物形成期，此时细胞将获得的代谢能量从用于细胞增殖转为用于产物分泌，细胞维持在活性相对较低的存活状态．通过控制细胞增殖速率，产物分泌量得以大大提高．随着对细胞周期调节机制研究的深入，研究人员已将细胞周期调控基因应用于规模化培养的细胞增殖控制．Fuss enegger等(1998)在C H O细胞中分别表达了p21、p27和肿瘤抑制基因p53三种细胞周期G1／S抑制蛋白，通过抑制cycl i n—E—C D K2复合物的磷酸化活性，阻止细胞进入s期．其中，p21基因转染后细胞获得了生长抑制．其生长静止可持续几周之久，报告蛋白分泌碱性磷酸酶(secr et ed al kal i ne phospha t ase，SE A P)的单位产量增加10--15倍；p27转染后的细胞生长静止但并不发生凋亡，产物表达量增加15倍．由三种蛋白组成的三顺反子元件转染C H O后，SE A P产量比对照提高30倍[433．2．3糖基化工程蛋白质有两种糖基化方式：N一糖基化和O～糖基化．一般来说，0一糖链对蛋白质的特性影响不大，而N一糖链的不同对产品可产生较大影响．N一糖链通常都有一个五糖核心，即M a n al一6(M an Q1)一3(M an81)--，4G1cN A c81-，4G1cN A c．根据外层链的不同，可分为：高甘露糖型、杂合型与复合型[55]．三种因素决定糖链类型不同：①合成肽链的不同．②细胞内糖基化酶的不同．③细胞培养环境的影响．用C H O细胞表达的糖蛋白，其类型与人的尽管近似，但也不尽完全相同．C H O细胞缺少Q一2，6～唾液酸转移酶的功能，因此缺少唾液酸化的糖基．为此，一面人们正尽量寻找能用以生产糖蛋白类药一47—物的人类细胞，如用N a m al w a细胞表达t—pA[44l、pr o—U K[45]和EP O[46|，它们的糖基化和人的自然产品一致．另一方面，人们正打算采用“糖基化工程”(gl ycos yl at i on engi neer i ng)，即应用基因工程手段，人为地改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的．如在t—PA基因中进行点突变，改变了一个氨基酸，使之增加一个糖基化位点，使t—PA在血浆中的清除率比原来减少了10多倍【471．又如M i neh等(1995)将t—PA与Q一2，6一唾液酸转移酶基因共转染C H O 细胞，结果表达的t—PA的糖基化情况与人类的更接近【48】．Lam ot t e等(1999)将丫一干扰素基因与a一2，6一唾液酸转移酶基因共转染C H O细胞，结果了一干扰素中a一2，6一唾液酸化程度比对照提高了68％(不加丁酸钠)和82％(加丁酸钠)．此外，控制和改变细胞的培养环境对N一糖基化也可产生一定影响【491．H os oi等(1996)研究表明，通过添加地塞米松、改变培养基糖的成分、使培养温度突然下降等，都可使pr o—U K的糖基化形式从含岩藻糖的2分枝复杂型寡糖链，转变为含岩藻糖的3或4分枝复杂型寡糖链，从而使生产的重组蛋白质糖基化形式与人类的一致[s0]．2．4多基因调控代谢工程由于细胞内部调控网络在空间和时间上的复杂性，一个性状并不完全由某一个基因控制．最新的代谢工程策略提出在细胞内进行可分别调控表达的多个基因，以期形成一个模拟细胞调控网络的人造调控系统，最简单的是双调控表达技术．Cor nel i a等(2001)通过链阳菌素和四环素双诱导表达体系构建了重组C H O细胞株，能分别表达p27基因和它的反义链．当诱导p27基因表达时实现了细胞生长的停滞，处于G l期细胞增加了40％，而表达p27基因的反义链，则使细胞内自身p27蛋白表达下降，使细胞增殖的速度提高了一倍，促进了细胞的生长[51,52】．2．5细胞增殖控制工程工业化大规模细胞培养中，常采用无血清／无蛋白培养基(Ser um f ree m edi um，SFM／Pr ot ei n f r ee m e di um，PFM)来降低细胞培养和产品纯化的成本．但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、粘附因子、扩展因子以及其他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中常表现出细胞活力降低、贴壁性差等现象，细胞增殖能力下降，进而导致分泌目的蛋白的能力下降．在培养基中添加胰岛素和成纤维细胞生长因子可使细胞恢复增殖能力，同时，细胞内的细胞周期调控因子C ycl i n—E的表达也增加．C ycl i n—E能使细胞周期的G1期延长，s期缩短，提示人们可通过表达C ye l i n—E的方法来增加细胞的增殖能力．人们还通过将生长刺激因子、粘附因子基因导入C H O细胞中，让C H O细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在S FM／P FM中良好生长．G andor等(1999)将介导C H O细胞在SF M中贴壁和扩展的玻表粘连蛋白(vi t r onec t i n)基因置于M M T V启动子控制下导入Cl I O细胞，使其获得了在PFM中j!占壁生长和扩展的能力[53]．另外，同时表达胰岛素样生长因子(I G F一1)和转铁蛋白(t r ansf er r i n)的所谓“超级C H O细胞”在PFM上也能生长良好【54J．随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、扩展因子、抗凋亡因子、转录与翻译的反式作用因子以及其他细胞生长存活所必需成分的基因和顺式表达调控元件转入宿主细胞，以提高其表达．与此同时把不利于目的基因表达的基因从宿主细胞中敲除或下调其在宿主细胞中的表达，从而把细胞改造为能在SFM／PFM中培养、培养前期细胞增殖快、当细胞密度达到理想值时细胞长时间不增殖、抗凋亡能力强、高表达目的基因的宿主细胞，最终大幅度降低哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本．参考文献：[1]涂宣林，宋后燕．寡糖链的研究进展【J]．药物生物技术，1998，5：55—59．[2]Ja yapal K P，W l as ehi n K F，H u W S，Y a p H G S．R ec om bi nant prot ei n t he rape ut i c s f r om C H O c el l s一20yea r s and cou nt i ng [J J．C he m Eng Pi ng，2007，103：40—47．[3]Li F，N at araj an V，Shen A，R o ber t K，A m anuU ah A．C e i l cul t ur e proc es se s f or m onocl onal ant i bo dy pr oduct i on[J]．Lande-———48．．——。
哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析
哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析作者：杨茜来源：《科技创新与应用》2014年第10期摘要：在目前制药领域，利用哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物取得了积极进展，哺乳动物细胞制备的蛋白质药物以其具有与天然蛋白质相似的特性而取得了重要应用。
从蛋白质药物制造技术发展来看，考虑到哺乳动物细胞培养制备的蛋白质药物质量较高，并且制备过程难度低、制备成本不高，由此决定了哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物将在未来的制药领域取得全面发展和应用。
基于这一认识，我们应认真总结哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展，并深入探讨哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物技术的发展前景，做好哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的研制工作。
关键词：哺乳动物细胞；培养制备；充足蛋白质药物；进展分析1 前言在近年生物制药发展中，利用哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质已经成为了重要的发展方向。
研究表明，哺乳动物细胞培养制备的蛋白质，无论是在制备质量上，还是在蛋白质含量上，都达到了药用标准，并且在性能上也与天然蛋白质较为接近。
基于这一优势和特点，关于哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物的研究得到了有效开展，并取得了积极的研究效果。
结合目前关于哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的现状，该研究在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中取得了积极进展。
2 哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得的进展COS细胞曾是进行外源基因表达研究中用途最广的宿主，但由于其严重的贴壁作用，限制了大规模悬浮培养的实际应用。
目前哺乳动物细胞生产重组蛋白中，常用的细胞系有CHO 和HEK293两大类细胞。
CHO是目前生物工程上广泛使用的细胞。
该细胞属于成纤维细胞，本身很少分泌内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是表达复杂生物大分子的理想宿主。
工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞及CHO/dhfr-细胞，被广泛地用于重组DNA 蛋白的稳定表达生产。
利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例
随着科学技术的不断发展，生物制药领域也迎来了前所未有的发展机遇。
哺乳动物工程细胞生产重组蛋白成为了一种重要的生产方式，其中包括利用转基因技术和细胞培养工艺等先进技术。
下面，我们将以一些实际实例为例，探讨利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的过程和意义。
一、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的意义1.加速药物的研发和生产过程利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白能够加速药物的研发和生产过程。
相比于传统的生产方式，利用工程细胞生产的蛋白更容易纯化并且具有更高的活性，这就可以有效减少药物研发和生产的时间和成本。
2.提高蛋白的稳定性和纯度哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白具有更高的稳定性和纯度，这些特性对于进一步的药物研发和临床治疗都至关重要。
3.满足市场需求随着人们对于治疗效果和药物品质要求的提高，利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白能够更好地满足市场需求，为广大患者提供更有效、更安全的药物。
二、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例1.单克隆抗体的生产单克隆抗体是当前生物制药领域中最重要的药物之一，在癌症、自身免疫性疾病等领域具有广泛的应用前景。
利用哺乳动物工程细胞生产的单克隆抗体，不仅能够保证其稳定性和活性，还可以满足大规模的生产需求。
2.重组蛋白药物的生产目前，许多重要的生物制药品种，如重组人胰岛素、重组干扰素等，都是利用哺乳动物工程细胞生产的。
这些重组蛋白药物在治疗糖尿病、肿瘤等疾病方面具有重要的应用价值。
3.疫苗的生产利用哺乳动物工程细胞生产疫苗是目前疫苗工业的主流生产方式之一。
哺乳动物工程细胞生产的疫苗具有更高的纯度和活性，可以更好地保证其安全性和有效性。
三、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的挑战与发展方向1.技术挑战目前，利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白仍然面临着诸多挑战，如细胞培养工艺的优化、蛋白表达水平的提高、蛋白结构的稳定性等。
这些技术挑战需要科研人员持续努力和创新。
2.发展方向未来，随着生物制药领域的不断发展，利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的研究也将迎来新的机遇和挑战。
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思考：
在动物细胞生产药用蛋白中， 哪些 类型的细胞更有前景？
在动物细胞生产药用蛋白中， 哪些
类型的细胞更有前景？ 更有前景的是融合细胞及采用基因
工程构建的各种工程细胞。
NO.3
基因工程细胞构建和筛选
真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 1） 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 2） 质粒载体
1） 病毒载体
牛痘病毒：用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 杆状病毒：用于外源基因表达。
2）质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
谷氨酰胺合成酶（GS）系统
•
谷氨酰胺合成酶在 ATP 水解提供能量时 ,利用细胞内的氨和谷 氨酸合成谷氨酰胺 ,在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下 ,加 入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜(methionine sulphoximine ,MSX) ,可使GS基因及与之相连的目的基因扩增 ,达到提高目的基因表达水平的目的。 由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不 必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常MSX浓度下就能筛选到 含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX 系统优越之处。主要哺乳细胞株为NS0细胞及CHOK1细胞。
（2）二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细 胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
（3）转化细胞系
常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而 获得无限增殖能力。 自发 人工诱变
基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选
1） 基因载体的导入 基因载体导入动物细胞最常用方法是：
磷酸钙沉淀法 电穿孔法
磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷 酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则 通过细胞吞噬作用而将DNA导入。
2）高效表达工程细胞株的筛选
主要采用DHFR系统和GS 系统 二氢叶酸还原酶系统DHFR 由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶 （dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了 次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine） 和甘氨酸的培养液中才能得以存活。二氢叶酸还原酶能 够被叶酸类似物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)所抑制 ,用含有目的基因及与之相连的DHFR基因的重组质粒转 化CHO dhfr细胞 ,利用浓度不断提高的 MTX选择抗MTX 的细胞系 ,其中 DHFR基因及与之相连的目的基因一起 扩增 ,从而使目的基因高水平表达。
动物细胞表达 制 备 药 用 蛋 白
思 考
要制备出我们想要的蛋白，需要 了解些什么，做些什么？
生产用动物细胞的要求和获得 常用生产用动物细胞的特性 基因工程细胞构建和筛选
NO.1
生产用动物细胞的要求和获得
（1） 原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过消化分离而获得。
用量大，浪费时间。
常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。
NO.2
常用生产用动物细胞的特性
W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME （Eagle’ Basal medium）。10%小牛血清，pH7.2, 倍增时间为24h，有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。
MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。 有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较 W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。
BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细 胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫 苗，现已用于工程细胞构建。
Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤 维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清； 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。
电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。
真核生物细胞生产药用蛋白优点： ①具有准确的转录后修饰功能，分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养， 表达水平较高； ⑤CHO（注射用重组人促红素 ）细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白， 利于外源蛋白的分离。 因此，可以针对性的筛选细胞株
DHFR扩增仅仅发生在二个等位基因中的一个。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为 它们位于染色体上DHFR基因座上（均匀染色区），而其等位基仍保持正常的单拷 贝。而在不稳定系中当选择压力消除时，扩增的基因至少会部分丢失，但未丢失 的是以染色体外的方式（双微体）存在。
每个双微体带有2-4 DHFR基因，双微体可以复制，但它们没有着丝粒，结果它们 不能附着在有丝分裂的纺锤丝上，因此不能均等分离进入子细胞，是染色体外的 微小染色体。