2019年二维电泳技术介绍.ppt

固定：染色：脱色


固定：取出塑料片，放入固定液中15min 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染 色，直至条带出现 可脱色至背景消除后干燥保存。
注意事项
1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含 量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、 过硫酸铵一定要新配置。 4、 所有水用重蒸水。 5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走 歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在 8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移， 造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断

2. Bradford法测蛋白含量
2D-电泳实验步骤：

3. 双向电泳第一向—IEF（双向电泳中一律使 用超纯水） 3.1 水化液的制备 称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后, 加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v） IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离 心15min 除杂质，取上清。 在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加 入水化液，至终体积为340ul， 振荡器上振荡 混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
2D-电泳实验步骤：

4.3 转移 剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入 SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的 IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂 糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分 钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水 处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶 条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5% 的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。
目前研究现状

在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板 （16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测 的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比 还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服 了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非 常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立 很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可 在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分 辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双 向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上 的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电 泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子 量的蛋白质。
2D-电泳实验相关试剂：


4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g Tris—HCl 1.5M 45.4275g 5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml SDS 0.4% 0.4g Tris—HCl 0.5M 6.07g
2D-电泳实验相关试剂：
蛋白质组研究平台

蛋白组学的发展依赖于双相电泳技 术的发展、电喷雾质谱（ESI-MS） 和基质辅助激光解吸飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MS）技术的发明以及 在蛋白质分析中的应用和蛋白组信 息学的兴起。
二维电泳及其重要性
1、定义：二维电泳是将不同种类的蛋白质按照 等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分 析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行
二维电泳技术介绍
广州大学生命科学学院 柯德森
主要内容
一、蛋白质组学研究意义与面临的困难 二、二维电泳及其重要性 三、二维电泳的方法与存在的问题 四、二维电泳的进展 五、展望
蛋白质组学研究的意义
1、定义：
蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的
所有种类的蛋白质
蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所
2D-电泳实验步骤：


4.4 跑胶 浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小 时 5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别 注意用超纯水）
2D-电泳实验相关试剂：

1． Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮 兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至 500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保 存（Bradford不稳定，一周内有效）
生物学问题 的提出
实验模型 的设计 感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋白质组研究平台
得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定与 疾病的关系。
2、意义 蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽 带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有 重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生 命现象的本质奠定基础。
蛋白质组学研究所面临的困难 之一
1、细胞种类的多样性 2、细胞的生命周期 3、蛋白质生成的时效性（30万－300万种） 4、蛋白质的结构与变异 5、研究方法
2D-电泳实验步骤：

4.2 灌胶 将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳 槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂 上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶 后(这时会出现三条线),用注射器吸去正 丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒 入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器 吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水, 用保险膜封好。


6. 凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml Acr 29.2% 73g Bis 0.8% 2g 7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g 超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml
2D-电泳实验相关试剂：

当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此 电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷 为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦 在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等 电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到 正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这 些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中， 在pI处得以“聚焦”
2D-电泳实验步骤：

1. 样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul 裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上 振荡10min左右，共处理一个小时。其中 每隔10～15分钟振荡一次，然后 13200rpm离心15min除杂质，取上清分 装，每管70ul，—80℃保存。
2D-电泳实验步骤：
仪器与试剂



聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、 NP-40、triton-100 电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液） 固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml， 定容为1000ml 染色液：0.35g考马斯亮蓝R－250溶于300ml脱色液中， 加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。 脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水 样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿 素
2D-电泳实验步骤：

4. 双向电泳第二向—SDS-PAGE 4.1 配胶(两根胶条所用剂量) 分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再 加APS和TEMED 30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml 分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul 双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8% 10ml） 30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml 浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul 双蒸水 5.9ml
电泳：

等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将 塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。 在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的 电极条。在胶面上任意位置上放上小擦 镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横 功率25W电泳，约10min后，暂停电泳， 取下纸片，继续电泳约30min，待电流达 4mA以下，停止电泳。
2D-电泳实验步骤：

3.2 点样，上胶 分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极 的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10) 胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触 加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中 平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气 泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应 正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样 多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线 齐平。
2D-电泳实验相关试剂：

2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 40 mM（如果有条件可以添 加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）
2D-电泳实验相关试剂：

3. 水化液储液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% Tris—bas源自文库 40 mM
分离
①、等电聚焦：电荷 ②、SDS凝胶电泳：分子大小
二维电泳方法与问题

方法的主要步骤：
1、 样品准备 2、第一维：形成pH梯度进行等电聚焦 3、第二维：SDS凝胶电泳 4、染色： 考马氏亮兰或银染 5、图像分析：肉眼或自动扫描
过程演示

双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白 质的等电点不同用等电聚焦分离，第二 向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平 面上分开。


8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液 6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml， 3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9． 平衡液储液 脲（即尿素） 36g 甘油 30% 30ml SDS 1% 1g 0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至 100ml
样品制备：

用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其 他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻 干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶 解后，离心去除不溶杂质。
配胶：

胶液组成：6ml胶母液（10％） 6－8％尿素 1ml Ampholine (pH3.5-10) 60-80ul 10%AP 5 ul TEMED 灌胶：配好的胶迅速灌入模具
2D-电泳实验步骤：

3.4 平衡 用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面， 即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条 要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次 冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端 （即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入 用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留 有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡 15min。 注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触 平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样 大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸 取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密 贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。
等电点聚焦（IEF)

等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白 质技术的一个重要发展，等电聚焦是在 稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两 性大分子的平衡电泳方法。
稳定的pH梯度形成

在电场中充有两性载体和抗对流介质， 当加上电场后，由于两性载体移动的结 果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度
蛋白质等电聚焦过程
2D-电泳实验步骤：

3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为 20℃） S1 (30v, 12hr, 360vhs, step) S2 (500v, 1hr, 500vhs, step) S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad) S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计 44110vhs, 19.5小时 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离 子，S4和S5用于聚焦