人肺腺癌细胞A549耐药细胞系的建立及意义
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1. 2. 4 A549 顺铂耐药细胞基因检测 检测多药耐药基因特 异序列（ 167 bp） 的表达，用 PCR 扩增法。引物设计： 上游 CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG，下游 GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。PCR 扩增： 在 离 心 管 内 加 入 下 列 内 容 物： 10 倍 缓 冲 液， 2. 5 μl； MgCl2 ，2. 5 μl； dNTP（ 2 mmol / L） ，2. 5 μl； 引物，1. 0 μl； DDW，14. 0 μl； Target，2. 0 μl； 95℃ ，5 min 后 加 Tag，0. 5 μl。 94℃ ，30 s； 55℃ ，60 s； 72℃ ，70 s； 共 30 个 循 环，72℃ 延 伸 10 min。用 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测多药耐药基因特异片段 （ 167 bp） 。
〔关键词〕 肺腺癌细胞； 顺铂； 多药耐药 〔中图分类号〕 R734 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（ 2012） 21-4705-03； doi： 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 21. 044
尽管少数早期肺癌患者可以通过手术治疗达到根治的效 果，但 70% 的非小细胞肺癌（ NSCLC） 患者确诊时已属临床晚 期，无法通过手术治愈。含铂类双药化疗方案是晚期 NSCLC 标准的一线化疗方案，其中顺铂（ cDDP） 是使用广泛的化疗药 物之一〔1〕。但是随着治疗的进行，肿瘤细胞会对化疗药物产生 耐药，这是造成化疗疗效不佳及失败的主要原因之一〔2〕。如何 保持肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是广大肿瘤工作者研究的 课题。本实验拟建立人肺腺癌 A549 耐药细胞系，为药物逆转 细胞耐药提供实验基础。
人肺腺癌细胞 A549 耐药细胞系的建立及意义
刘利则 夏 莉 段北野1 刘玉侠1 （ 吉林省人民医院，吉林 长春 130021）
〔摘 要〕 目的 建立人肺腺癌细胞 A549 耐药细胞系，为药物逆转细胞耐药提供实验基础。方法 培养人肺腺癌细胞 A549，用不同浓度顺铂 （ cDDP） 反复冲击，建立稳定表 达 耐药 基因 的 耐药 细胞。结 果 经 过 10 次、12 次 反 复 冲 击 后，A549 细 胞 对 具 有 较 强 的 耐 受 力，IC50 分 别 达 到 65. 65 μmol / L和 81. 58 μmol / L，而对照组分别为 24. 33 μmol / L 和 19. 61 μmol / L，耐药细胞内有耐药基因（ MDR） 的表达。结论 用不同浓度 cDDP 反 复冲击肺腺癌细胞 A549，可以建立高表达耐药基因及高耐药指数的耐药细胞。
究工作。
百度文库
Sigma 产品； 胎牛血清： 天津 TB 公司； 二甲基亚砜（ DMSO） ： Sigma 产品； 顺铂： 购于江苏豪森药业股份有限公司； 琼脂糖、DNA 标准品： 宝泰克公司产品。 1. 1. 2 人肺腺癌细胞系 A549 购于上海生命科学研究院。 1. 1. 3 主要设备及器材 低温低速离心机，SORVALL RTT， USA； 全 自 动 酶 标 仪，Labsystems Dragon； 万 能 视 频 成 像 系 统 （ LY-WN-HPCCD） 都励扬精密机电有限公司。 1. 2 实验方法 . 1. 2. 1 细胞复苏与培养 将 A549 细胞从液氮罐中取出复苏 后，加入含 10% FCS 的 IMDM 培 养 液 接 种 于 培 养 瓶 中，置 于 CO2 培养箱中，37℃ 、5% CO2 、饱和湿度条件下静止培养。次日 更换培养液，继续培养。 1. 2. 2 耐药细胞株 A549 / cDDP 建立 当细胞处于指数生长 期且已铺满瓶底 80% 以上时，弃去原来培养液，加入含顺铂培 养液（ 终浓度为 100 μmol / L） ，培养 1 h 后弃去含顺铂培养基， 更换为新鲜配制的含 10% FCS 的 IMDM 培养液，置于 CO2 培养 箱中继续培 养。观 察 细 胞 生 长 状 态，拍 照。待 细 胞 长 满 瓶 时， 用 0. 25% 胰酶消化传代。再长满瓶底时再用同样浓度同样方 法冲击，再培养 并 观 察 细 胞 生 长 状 态，拍 照，再 传 代。 如 此，体 外连续培养、冲 击、传 代，并 同 时 进 行 抗 药 性 检 测。反 复 冻 存，
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中国老年学杂志 2012 年 11 月第 32 卷
复苏，观察细胞株生长稳定性。
1. 2. 3 MTT 法检测细胞抗药性 复苏人肺腺癌细胞株 A549 和经过顺铂冲击处理的 A549 / cDDP 细胞，用含 10% FCS 的 IMDM 培养液重悬，置于 CO2 培养箱中，37℃ ，5% CO2 ，饱和湿度 条件下静止培养。次日更换培养液，继续培养。当细胞生长至 指数生长期时，0. 25% 胰酶消化，生理盐水洗涤，计数。用含 10% FCS 的 IMDM 培养液重悬，调整细胞密度为 5 × 104 / ml，加 入 96 孔培养板，100 μl / 孔，置于 CO2 培养箱中，37℃ ，5% CO2 ， 饱和湿度条件下静止培养过夜，细胞贴壁后加入受试药物 cDDP，终浓度分别是 200、100、50、25、12. 5、6. 25 μmol / L，同时设 阴性对照（ 以等体积的生理盐水代之） 和空白对照（ 无细胞） 。 各组设 6 复孔。37℃ 、5% CO2 ，饱和湿度条件下静止培养 72 h 后加入 MTT（ 5 mg / ml） ，20 μl / 孔，继续培养 4 h，小心吸弃培养 上清。加入 DMSO，150 μl / 孔，振荡 10 min，使结晶物全部溶解 后，用全自动酶标仪检测各孔吸光度值 （ A） ，波长为492 nm。 求出不同浓度 cDDP 对两种细胞的 抑 制 率。计 算 公 式： 抑 制 率 =〔1 － （ 实验组均值 / 阴性对照组均值） 〕× 100% ； 计算 50% 细胞生长抑制所需的药物浓度（ IC50） 和耐药指数（ RI） 。RI = 耐药细胞 IC50 / 亲本细胞 IC50。
1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 主要试剂 IMDM 培养基： Gibco 产品； 噻唑蓝（ MTT） ：
基金项目： 吉林省科技发展计划资助项目（ No. 200805124） 1 吉林省肿瘤防治研究所 通讯作者： 夏 莉（ 1960-） ，女，硕士，硕士生导师，主任医师，主要从事
肺癌和肝癌研究。 第一作者： 刘利则（ 1959-） ，女，硕士生导师，主任医师，主要从事肺癌研
〔关键词〕 肺腺癌细胞； 顺铂； 多药耐药 〔中图分类号〕 R734 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（ 2012） 21-4705-03； doi： 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2012. 21. 044
尽管少数早期肺癌患者可以通过手术治疗达到根治的效 果，但 70% 的非小细胞肺癌（ NSCLC） 患者确诊时已属临床晚 期，无法通过手术治愈。含铂类双药化疗方案是晚期 NSCLC 标准的一线化疗方案，其中顺铂（ cDDP） 是使用广泛的化疗药 物之一〔1〕。但是随着治疗的进行，肿瘤细胞会对化疗药物产生 耐药，这是造成化疗疗效不佳及失败的主要原因之一〔2〕。如何 保持肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是广大肿瘤工作者研究的 课题。本实验拟建立人肺腺癌 A549 耐药细胞系，为药物逆转 细胞耐药提供实验基础。
人肺腺癌细胞 A549 耐药细胞系的建立及意义
刘利则 夏 莉 段北野1 刘玉侠1 （ 吉林省人民医院，吉林 长春 130021）
〔摘 要〕 目的 建立人肺腺癌细胞 A549 耐药细胞系，为药物逆转细胞耐药提供实验基础。方法 培养人肺腺癌细胞 A549，用不同浓度顺铂 （ cDDP） 反复冲击，建立稳定表 达 耐药 基因 的 耐药 细胞。结 果 经 过 10 次、12 次 反 复 冲 击 后，A549 细 胞 对 具 有 较 强 的 耐 受 力，IC50 分 别 达 到 65. 65 μmol / L和 81. 58 μmol / L，而对照组分别为 24. 33 μmol / L 和 19. 61 μmol / L，耐药细胞内有耐药基因（ MDR） 的表达。结论 用不同浓度 cDDP 反 复冲击肺腺癌细胞 A549，可以建立高表达耐药基因及高耐药指数的耐药细胞。
究工作。
百度文库
Sigma 产品； 胎牛血清： 天津 TB 公司； 二甲基亚砜（ DMSO） ： Sigma 产品； 顺铂： 购于江苏豪森药业股份有限公司； 琼脂糖、DNA 标准品： 宝泰克公司产品。 1. 1. 2 人肺腺癌细胞系 A549 购于上海生命科学研究院。 1. 1. 3 主要设备及器材 低温低速离心机，SORVALL RTT， USA； 全 自 动 酶 标 仪，Labsystems Dragon； 万 能 视 频 成 像 系 统 （ LY-WN-HPCCD） 都励扬精密机电有限公司。 1. 2 实验方法 . 1. 2. 1 细胞复苏与培养 将 A549 细胞从液氮罐中取出复苏 后，加入含 10% FCS 的 IMDM 培 养 液 接 种 于 培 养 瓶 中，置 于 CO2 培养箱中，37℃ 、5% CO2 、饱和湿度条件下静止培养。次日 更换培养液，继续培养。 1. 2. 2 耐药细胞株 A549 / cDDP 建立 当细胞处于指数生长 期且已铺满瓶底 80% 以上时，弃去原来培养液，加入含顺铂培 养液（ 终浓度为 100 μmol / L） ，培养 1 h 后弃去含顺铂培养基， 更换为新鲜配制的含 10% FCS 的 IMDM 培养液，置于 CO2 培养 箱中继续培 养。观 察 细 胞 生 长 状 态，拍 照。待 细 胞 长 满 瓶 时， 用 0. 25% 胰酶消化传代。再长满瓶底时再用同样浓度同样方 法冲击，再培养 并 观 察 细 胞 生 长 状 态，拍 照，再 传 代。 如 此，体 外连续培养、冲 击、传 代，并 同 时 进 行 抗 药 性 检 测。反 复 冻 存，
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中国老年学杂志 2012 年 11 月第 32 卷
复苏，观察细胞株生长稳定性。
1. 2. 3 MTT 法检测细胞抗药性 复苏人肺腺癌细胞株 A549 和经过顺铂冲击处理的 A549 / cDDP 细胞，用含 10% FCS 的 IMDM 培养液重悬，置于 CO2 培养箱中，37℃ ，5% CO2 ，饱和湿度 条件下静止培养。次日更换培养液，继续培养。当细胞生长至 指数生长期时，0. 25% 胰酶消化，生理盐水洗涤，计数。用含 10% FCS 的 IMDM 培养液重悬，调整细胞密度为 5 × 104 / ml，加 入 96 孔培养板，100 μl / 孔，置于 CO2 培养箱中，37℃ ，5% CO2 ， 饱和湿度条件下静止培养过夜，细胞贴壁后加入受试药物 cDDP，终浓度分别是 200、100、50、25、12. 5、6. 25 μmol / L，同时设 阴性对照（ 以等体积的生理盐水代之） 和空白对照（ 无细胞） 。 各组设 6 复孔。37℃ 、5% CO2 ，饱和湿度条件下静止培养 72 h 后加入 MTT（ 5 mg / ml） ，20 μl / 孔，继续培养 4 h，小心吸弃培养 上清。加入 DMSO，150 μl / 孔，振荡 10 min，使结晶物全部溶解 后，用全自动酶标仪检测各孔吸光度值 （ A） ，波长为492 nm。 求出不同浓度 cDDP 对两种细胞的 抑 制 率。计 算 公 式： 抑 制 率 =〔1 － （ 实验组均值 / 阴性对照组均值） 〕× 100% ； 计算 50% 细胞生长抑制所需的药物浓度（ IC50） 和耐药指数（ RI） 。RI = 耐药细胞 IC50 / 亲本细胞 IC50。
1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 主要试剂 IMDM 培养基： Gibco 产品； 噻唑蓝（ MTT） ：
基金项目： 吉林省科技发展计划资助项目（ No. 200805124） 1 吉林省肿瘤防治研究所 通讯作者： 夏 莉（ 1960-） ，女，硕士，硕士生导师，主任医师，主要从事
肺癌和肝癌研究。 第一作者： 刘利则（ 1959-） ，女，硕士生导师，主任医师，主要从事肺癌研