植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师

植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导

一、实验目的；

通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了

解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备

方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。

二、实验原理：

根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。

三、实验内容实验包括以下3部分内容:

实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存

实验1-2、MS培养基的配制与灭菌

实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导

实验1-1植物组织培养基母液的配制和保存

1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制

做准备。

2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配

制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的

配制。

MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。

3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具

分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、

1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量

筒、移液抢、微波炉等。

3.2试剂

（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

（2）MS培养基成分：

①大量元素（母液I ）: NHNO、KNO CaCb2H2O MgSO7mO KHPO;

②微量元素（母液口）: KI、HBQ MnSQ4H2O ZnSQ.7H2O NQM0Q.2H2O CuSQ5H2O C0CI2.6H2Q；③铁盐（母液川）:FeSQ.7H2Q NQ.EDTA.2H2Q；

④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&）、烟

酸（V pp）、盐酸硫胺素（维生素B i）、甘氨酸；

（3）植物生长调节物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）o

4、操作步骤

（1）MS大量元素母液的配制

按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表1中的次序

分别准确称量后，分别用50ml烧杯，加入蒸馏水30 ml溶解（可以加热至60C〜70C,促其溶解）。溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

表1 MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量

(2)微量兀素母液的配制

按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物(除去铁盐)扩大100倍(表2)，用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。

将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、

配制人姓名，置于4 C冰箱中保存备用。

表2 MS培养基微量元素母液(100倍)的配制剂量

*、** :因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g , 溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。

（3）铁盐母液的配制

常用的铁盐是FeSQ7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。配制时，按照扩大后的用量（表3）,分别称取FeSq7H2Q和Na?-EDTA

分别溶解后，将FeSQ溶液缓缓倒入Na?-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

表3 MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量

(4) 有机物母液的配制

按照表4中各成分浓度扩大后的用量，用感量O.OOOIg天平分别称量各有机物。可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。一般有机物都溶于水，但叶酸(VBc)先用少量稀氨水或1mol/L NaOH溶液溶解；VH (生物素) 先用1mol/L NaOH溶液溶解；VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

表4 MS培养基有机物母液(100倍)的配制剂量

(5)激素母液的配制

激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般

是0.1〜2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。称量激素要用感量为万分

之一天平。本实验选用激素2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)。

2,4-D母液的配制方法为：准确称取10mg 2,4-D,称量后先用少量(1-3ml) 95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml,即得到0.1mg/ml的2,4-D 贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4C冰箱中保存备用。

(6)在配制母液时注意事项：

①培养基各试剂应使用分析纯。

②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。

③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配

制日期，并存放在4C冰箱中。使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。

5、结果记录与分析

(1)记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。

(2)仔细观察在配制