PCR技术原理及其应用PPT课件

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PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
3’
子链延长
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3’ 解旋酶 解链酶
5’
3
PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
子链延长
5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
RNA引物
5‘引A物UC酶GCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
3’
GGAUCG引物酶5‘
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer
extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物结 合物在TaqDNA聚 合酶的作用下，以 dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按 碱基配对与半保留 复制原理，合成一 条新的与模板 DNA 链。
PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
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Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发 明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺 贝尔化学奖。
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana提出：经过DNA变性， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物， 并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难，以及70 年代基因工程技术的发明使克隆基因成 为可能，所以，Khorana的设想被人们遗 忘了……
No. Amplicon Cycles Copies of Target
2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
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三、PCR反应
标准的PCR反应条件：
10X缓冲液
10 μL
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物
各10～100pmol
模板DNA
0.1～2μg
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PCR Cycle - Step 2 –
Temperature
is
lowered target
(sTemq)ueanncdesprimers
anneal
to
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DN202A1 单链的互补序列配对结合； 14
Taq DNA聚合酶 2.5U
Mg2+
1.5mmol/L
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• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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PCR仪
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PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
子链延伸 DNA加倍
1
2
3
4
2021 时间（min）
第四章 PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
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一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合 酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，
使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后
RNA引物
5’
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PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链 3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚TD合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
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Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
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Hale Waihona Puke Baidu 94℃
55℃
72℃
PCR循环
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二、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加 热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温 度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火， 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得 以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一 个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环 的不断重复。
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
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No. of
1 2 3 4 5 6 20 30
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End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一个 循环需2～4 分钟， 2～3 小时就能将 待扩目的基 因扩增放大 几百万倍。
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Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon