磷酸化蛋白的western blot

做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？

做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？本人的研究生实验被western blot承包了，尤其是做磷酸化蛋白上摸爬滚打了这么多年，所以总结下自己的经验，希望能助同道中人一臂之力，少走点弯路，早日出结果发paper, 迎娶白富美，走向人生巅峰那首先先思考几个问题，什么是蛋白质磷酸化？在哪些位点发生蛋白质的磷酸化呢？发生磷酸化有什么作用呢？下面我们来一一揭晓蛋白质磷酸化的神奇面纱：Q1: 什么是蛋白质磷酸化呢？蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。

Q2: 什么是蛋白质的去磷酸化呢？上述磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下去磷酸化，这个过程是可逆的图所示Q3: 蛋白质磷酸化主要发生的氨基酸残基是谁呢？蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸Q4: 蛋白质磷酸化的作用？蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

好啦，知道蛋白质磷酸化是怎么一回事，那通过什么手段检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平呢？那常用到的方法就是western blot啦，有人会说western blot还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的western blot就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。

好了下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。

收蛋白样：1、收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解；2、蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF（抑制酸性磷酸酶），所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;3、如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂（氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM）；4、蛋白裂解后4℃离心后，最好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。

wb检测磷酸化蛋白原理

wb检测磷酸化蛋白原理一、前言WB（Western Blot）是一种非常常用的蛋白质检测方法，其原理是利用特异性抗体与目标蛋白发生特异性反应，然后通过化学方法对反应产物进行可视化检测。

磷酸化是细胞信号转导中非常重要的一种修饰方式，因此WB检测磷酸化蛋白也成为了很多研究者的关注点。

二、WB检测磷酸化蛋白原理1. 磷酸化的基本原理在细胞内，磷酸化是一种非常重要的后转录后修饰方式。

它可以通过激活或抑制某些蛋白质的功能来调节细胞代谢、增殖、分化等生物学过程。

在细胞内，磷酸化通常由激酶催化，而去磷酸化则由磷酸酶催化。

因此，在WB检测中，我们通常会使用特异性抗体来检测目标蛋白是否被磷酸化。

2. WB检测的基本流程WB检测通常包括以下几个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、阻断、一抗孵育、二抗孵育和可视化。

其中，样品制备和SDS-PAGE电泳的步骤与普通WB检测并无区别，这里不再赘述。

在转膜后，我们需要对膜进行阻断处理，以避免非特异性结合。

常用的阻断方法包括使用5%的非脂奶粉或3%的BSA（Bovine Serum Albumin）。

接下来，我们需要用一抗孵育膜上的目标蛋白。

一般情况下，我们会选择特异性抗体来进行磷酸化位点检测。

在一抗孵育后，我们需要对膜进行洗涤以去除未结合的一抗。

之后，我们再用二抗与一抗结合，并通过化学方法对反应产物进行可视化。

3. 磷酸化位点检测磷酸化位点检测是WB检测磷酸化蛋白的核心步骤之一。

目前常用的磷酸化位点检测方法主要有三种：Phos-tag SDS-PAGE、Pro-Q Diamond染色和Anti-phosphoamino acid抗体。

（1）Phos-tag SDS-PAGEPhos-tag SDS-PAGE是一种基于Phos-tag的SDS-PAGE电泳技术。

Phos-tag是一种含有多个磷酸酯结合位点的配体，可以选择性地捕获磷酸化蛋白。

在Phos-tag SDS-PAGE电泳中，我们会将Phos-tag添加到聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳分离。

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白

免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白免疫印迹（Western blot，WB）是利用抗原抗体特异性结合的原理，基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术，也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。

蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品，随后将电泳条带转移到固相载体膜上（如PVDF或尼龙膜），再利用磷酸化特异的抗体（一抗）来鉴定目的蛋白，能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白，最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置，即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。

免疫印迹法不适用放射性32P标记，避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。

此外，磷酸化抗体的灵敏性较强，可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白，对样品的用量要求不算严格。

WB除了能定性检测磷酸化蛋白外，还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平，由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响，通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。

百泰派克生物科技拥有纯熟的免疫印迹技术，专业的技术分析团队，为您提供一站式磷酸化蛋白免疫印迹鉴定服务，可以根据您的需求定制实验，并对可能影响结果的潜在因素进行评估。

我们承诺给出的数据可靠，且可重复性高。

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相关服务：Far-Western Blot分析。

翻译后修饰蛋白组分析。

磷酸化定量蛋白组学研究。

免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析。

蛋白质相互作用分析。

蛋白质相互作用质谱分析。

SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作分析。

交联法蛋白相互作用分析。

标记转移法蛋白相互作用分析。

Pull-down靶蛋白质谱鉴定。

蛋白磷酸化实验方法

蛋白磷酸化实验方法蛋白磷酸化实验方法主要包括以下几种：1. Western blot：这是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。

2. 放射性标记法：先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，最后通过放射自显影进行检测。

3. 免疫印迹法：基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。

在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。

4. 荧光染色法：利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。

5. 质谱法：首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，最后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。

6. ELISA：ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。

这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。

随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。

加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。

这些分析通常设计为显色或荧光检测。

产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。

与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。

首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。

其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。

第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。

最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。

蛋白质印迹法westernblot应用介绍

高通量Western Blot技术的应用范围广泛，包括药物筛选、疾病诊断和治疗、蛋白质功能研究等领域。
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的特异性，确保抗体只针对目标蛋白进行反应，而不与其他非目标蛋白发生交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质的功能和作用机制提供有力支持。

WB检测磷酸化蛋白

百泰派克生物科技
WB检测磷酸化蛋白
蛋白印迹（Western Blot，WB）是基于免疫学原理的一种蛋白质分析技术，常用于检测组织匀浆提取物中特定蛋白质的存在、大小、含量以及相互作用等。

WB已广泛用于蛋白质-DNA相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰等分析。

WB同样可以检测特定样品中磷酸化蛋白的存在、含量以及大小等，只是需要选择能特异识别磷酸化蛋白的一抗。

其基本原理是通过一级抗体识别并结合经电泳分离并转移到PV膜上的磷酸化蛋白，再利用二级抗体特异识别一级抗体，形成磷酸化蛋白-一抗-二抗复合体，二抗可以通过染色和免疫荧光等技术进行检测，从而间接检测到磷酸化蛋白。

百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供快速准确的磷酸化蛋白质分析服务技术包裹，包括磷酸化蛋白质定性定量鉴定等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。

磷酸化wb灰度值

磷酸化wb灰度值磷酸化WB灰度值是一种常用的分析方法，用于研究蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，能够调控蛋白质的结构和功能。

通过测量蛋白质磷酸化水平的变化，可以揭示其在细胞信号转导、代谢调控和疾病发生发展中的作用。

磷酸化WB灰度值是通过Western blotting（简称WB）技术来测量蛋白质磷酸化水平的一种方法。

WB是一种常用的蛋白质分析方法，可以检测目标蛋白质的存在和表达水平。

通过WB技术，可以将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并通过特异性抗体进行检测。

磷酸化WB灰度值则是通过将目标蛋白质的磷酸化状态与非磷酸化状态进行比较，利用灰度值来反映磷酸化水平的变化。

在进行磷酸化WB实验时，首先需要提取细胞或组织中的蛋白质，并进行电泳分离。

然后，将蛋白质转移到膜上，并进行特异性抗体的孵育。

特异性抗体将与目标蛋白质结合，并形成免疫复合物。

接下来，使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗进行检测。

最后，使用化学发光或染色法来可视化目标蛋白质，并通过成像仪或胶片进行记录。

磷酸化WB灰度值是通过分析成像结果得到的。

成像结果可以定量化为灰度值，灰度值越高表示蛋白质的表达水平越高。

在磷酸化WB实验中，我们通常会比较磷酸化状态和非磷酸化状态的灰度值差异。

如果磷酸化状态的灰度值明显高于非磷酸化状态，说明目标蛋白质在该细胞或组织中存在磷酸化修饰。

磷酸化WB灰度值的分析可以提供重要的研究信息。

首先，它可以帮助我们了解蛋白质的磷酸化调控机制。

磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，参与多种细胞信号传导通路的调控。

通过比较不同条件下的磷酸化WB灰度值，我们可以了解磷酸化的动态变化，揭示蛋白质在信号通路中的作用。

磷酸化WB灰度值的分析可以帮助我们研究疾病的发生和发展。

磷酸化异常与多种疾病的发生有关，如癌症、神经系统疾病等。

通过比较疾病组织与正常组织的磷酸化WB灰度值，我们可以发现与疾病相关的蛋白质磷酸化异常，为疾病诊断和治疗提供新的靶点。

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项

western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。

下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。

实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。

2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。

3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。

通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。

注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。

使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。

2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。

同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。

3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。

转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。

4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。

需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。

5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。

人血浆外泌体磷酸化蛋白检测方法

人血浆外泌体磷酸化蛋白检测方法说实话人血浆外泌体磷酸化蛋白检测方法这事，我一开始也是瞎摸索。

我最开始就想着把血浆里的外泌体先分离出来，这可费了我好大的劲儿。

我试过那种超速离心法，我的天呐，就好像你在一大堆沙子里找特别小的钻石，得一遍又一遍地转，而且转速还得掌握得很精准。

我失败了好几次，有时候转速不对，得到的外泌体就不纯，里面可能混着别的东西。

然后我想那用试剂盒吧。

我买了一种号称很好用的外泌体分离试剂盒。

按照说明书一步一步来，就像你照着菜谱做菜一样，但是结果还是不那么理想。

我觉得好像它不能完全把血浆样本里的外泌体都分离出来。

等外泌体分离得差不多了，就该检测磷酸化蛋白了。

这个时候我就尝试用Western blot。

但是这个也有很多麻烦的地方。

比如上样量很难掌握，就像你往碗里倒水一样，倒少了看不到，倒多了又会影响结果。

制备样品的时候，磷酸化蛋白特别容易降解，就像一个很脆弱的小物件，稍微不小心就坏掉了。

我后来才知道，得加磷酸酶抑制剂，这一点很关键我之前就不知道啊，少了这个步骤，结果完全不对。

我还试过酶联免疫吸附测定，这个方法呢相对简单点，但是对磷酸化蛋白的特异性不是那么好，容易有假阳性。

后来啊我又尝试了液相色谱- 质谱联用技术。

这个可高级了，但是要调整各种参数啊，就像你玩那种很复杂的电子游戏，要调各种键位设置一样。

这时候我就多查了很多资料，还咨询了一些专家。

他们告诉我比如说液相流速啊、质谱扫描范围这些参数得根据样本的特点好好设定。

经过这么多折腾，我总结了一些经验。

如果用超速离心法分离外泌体，一定要确定好最佳的离心转速和时间。

用Western blot检测的时候，磷酸酶抑制剂千万不能忘。

对于液相色谱- 质谱联用技术，多研究样本特性来设定参数很重要。

虽然到现在我还不能说完全精通人血浆外泌体磷酸化蛋白检测方法，但是这些自己摸索出来的和从别人那学来的东西，真的帮了大忙。

还有啊对等离子标记相对和绝对定量技术我也有点好奇，但是还没开始尝试。

western检测磷酸化蛋白实验步骤

western检测磷酸化蛋白实验步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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磷酸化wb灰度值 -回复

磷酸化wb灰度值-回复磷酸化(Phosphorylation) 是生物体内一种常见的化学修饰过程，通过在蛋白质、酶和其他细胞内分子上添加磷酸基团，以控制它们的活性、功能和相互作用。

在细胞信号转导、代谢调节、细胞周期调控以及细胞凋亡等过程中，磷酸化都发挥着关键的作用。

WB (Western Blot) 是一种常用的免疫学技术，用于检测特定蛋白质的存在、表达量和化学修饰状态。

灰度值是指在数字图像处理中，表示像素亮度级别的数值。

本文将详细介绍磷酸化在WB 实验中灰度值的解读方法和意义。

步骤一：WB 实验WB 实验是一种常用的蛋白质定性和定量分析方法。

首先，将要研究的细胞或组织样本进行蛋白质提取，并用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 将蛋白质按分子量分离。

然后，将分离得到的蛋白质迁移至氮化纤维膜，形成蛋白质点斑。

接下来，通过特定的抗体标记物结合到目标蛋白质上，并用化学荧光或酶的催化作用产生信号。

最后，使用显影方法获取图像，观察和分析蛋白质的表达和化学修饰状态。

步骤二：灰度值测定在WB 实验中，获取到的图像通常是黑白的，像素的亮度级别通过灰度值来表示。

灰度值一般在0-255范围内，0表示黑色，255表示白色。

要测定特定蛋白质的磷酸化程度，通常需要用特定的抗体来探测该蛋白质及其磷酸化状态。

抗体结合的位置会在图像上产生一个明显的点斑。

使用图像分析软件，比如ImageJ，可以对图像进行灰度值的测定和分析。

首先，在软件中打开WB图像，通过调整对比度和亮度来使图像清晰，并将尺寸标定为已知的像素距离。

然后，使用者可以用光标选择感兴趣的区域（ROI），通常是蛋白质点斑的位置。

在软件上，将鼠标点击的点斑区域标记，并获取该区域的灰度值。

步骤三：磷酸化的灰度值解读磷酸化的程度可以通过磷酸化蛋白质的灰度值来表示。

灰度值越高，表明磷酸化程度越高，蛋白质的活性可能受到更强的调控。

比较不同样本之间的磷酸化程度时，可以计算相对灰度值（Normalized Gray Value），通过除以一个对照样本的灰度值来纠正可能的变异性。

跑磷酸化蛋白的注意事项

跑磷酸化蛋白的注意事项跑磷酸化蛋白是一类具有磷酸化修饰的蛋白质，在细胞信号传导、基因转录和细胞增殖等生物学过程中起着重要作用。

跑磷酸化蛋白的研究对于深入了解细胞的生理和病理过程具有重要意义。

然而，在进行跑磷酸化蛋白的相关研究时，有一些注意事项需要我们注意。

要准备好适当的实验材料和设备。

跑磷酸化蛋白的研究通常需要提取细胞蛋白，并使用电泳技术进行分离。

因此，我们需要准备好细胞培养物、细胞裂解液、电泳胶和电泳仪等实验材料和设备。

确保这些材料和设备的质量和适用性，以保证实验的准确性和可靠性。

要选择合适的实验方法和技术。

跑磷酸化蛋白的检测通常采用免疫印迹法，即Western blotting。

在进行Western blotting实验时，我们需要对跑磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白进行区分。

这需要选择合适的抗体，如抗体可以特异性地与磷酸化蛋白结合，并进行检测。

此外，在Western blotting实验中，还需要注意蛋白质的迁移速度和转印效率，以保证实验结果的准确性。

第三，要注意实验条件的控制。

在进行跑磷酸化蛋白的实验时，需要严格控制实验条件，以避免误差的产生。

比如，要控制细胞的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。

此外，还要注意细胞的采集和处理方式，以保证实验结果的可靠性。

同时，在进行Western blotting实验时，要注意电泳条件的控制，如电压、电流和电泳时间等，以避免蛋白质的降解和损失。

第四，要进行数据分析和结果解释。

在获得实验数据后，我们需要对数据进行分析和统计，以获得可靠的结果。

常用的数据分析方法包括图像分析软件和统计学方法等。

此外，在解释实验结果时，要注意对实验结果的客观性和科学性，避免主观臆断和错误推测。

要进行相关文献的查阅和总结。

跑磷酸化蛋白的研究是一个前沿的领域，有许多相关的文献和研究成果可供参考。

在进行跑磷酸化蛋白的实验前，要对相关的文献进行查阅，了解最新的研究进展和方法。

此外，还要对实验结果进行总结和归纳，以便于进一步的研究和应用。

Western blot 实验技巧精要

Western blot 实验技巧精要Western blot 方法在SCI 文章中出现的频率非常高，漂亮的WB 电泳图可以给文章增色不少。

但是WB 实验的步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。

一、样品准备部分我们不应该太过重视WB 电泳部分的操作技巧，样品准备才是整个WB 实验中最重要的一个环节（没有之一）。

否则WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。

小编认为以下3 点值得大家重点关注：1. 注意孵育、终止时间如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕1 秒也不要提前或耽搁。

2. 抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。

抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：(1) 使用蛋白酶抑制剂罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂Cocktail 片剂，效果不错。

再与PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。

(2) 全程低温操作提前预冷PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。

除了使用冰盒，大多数操作都是在4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。

3. 裂解液用量将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。

裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。

如果加入的裂解液不足，蛋白浓度太高，会造成与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好。

做磷酸化蛋白检测时为了在每个胶孔中尽可能多上样，所以用体积较少的裂解液制备了浓度很高的蛋白，结果就得不偿失了（见下图）。

这种情况的补救方法是给样品继续补加上样缓冲液，煮样，再跑胶。

直接给已经煮过样的样品补加上样缓冲液再煮样，跑胶后的效果也会好很多（见下图）。

如果加入的裂解液过多，蛋白浓度太低，会导致在胶孔中的上样量不足，条带不清晰。

磷酸化蛋白的wb

1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。

（磷酸酶抑制剂中，钒酸钠（Na3VO4）的使用浓度为1mM，氟化钠（NaF）的使用浓度为1mM；分别来自文献：（1）Robert M. Law et al Functional Regulation of g-Aminobutyric Acid Transporters by Direct Tyrosine Phosphorylation THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2000（2）Joel G et al Manganese exposure alters extracellular GABA, GABA receptor and transporter protein and mRNA levels in the developing rat brain NeuroToxicology 2008 ）2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。

因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。

4度也可使一抗重复使用多次。

毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。

二抗则室温1小时即可。

3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。

个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。

4.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。

如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。

5.抗体的稀释倍数也要适当。

不同厂商也会有不同要求。

6.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。

如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。

实验记录-Western-Blot之蛋白的提取与定量

细胞蛋白的提取与测定一、蛋白提取原理: 蛋白质是一切生命活动的承担者, 为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究, 进一步阐明众多疾病的机制, 同时为疾病治疗提供理论依据, 因此需要提取目的蛋白, 由于蛋白质种类繁多, 结构复杂, 需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。

贴壁细胞蛋白的提取: （所有操作均在冰上进行）准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用裂解液制备: 每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白, 使其免于被蛋白酶降解）, 配好后冰上备用；2.此处以6孔板为例, 吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液, 清洗 2-3次, 吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；3.加入适当体积的裂解液, 让裂解液与细胞充分混匀, 冰上裂解30min；4.裂解完成后, 用细胞刮刀将细胞刮下, 将细胞及裂解液吸入离心管, 放离心机4℃12000rpm 离心30min（离心机提前预冷）, 上清即为蛋白溶液, 细胞碎片沉降于底部；5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot, 需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同, 例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。

二、组织中总蛋白的提取：1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中, 用研杵快速研磨组织, （有的需要加入液氮）, 直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；2.裂解液制备: 取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；3.取适量研磨的匀浆放入离心管, 加入配好的裂解液, 冰上孵育40min；4.离心: 4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。

磷酸化蛋白磷酸化位点确定

磷酸化蛋白磷酸化位点确定
磷酸化蛋白的磷酸化位点确定通常涉及以下几个步骤：
1.样本准备：需要对磷酸化蛋白进行纯化，确保蛋白质尽可能均一。

这是为了
减少后续分析中的干扰物质，提高磷酸化位点检测的准确性。

2.质谱分析：质谱是确定磷酸化位点的重要手段。

通过质谱分析，可以识别出
磷酸化多肽的存在，并进一步根据氨基酸序列确定磷酸化的具体位置。

3.Western Blot：Western blot是一种常用的评估蛋白磷酸化状态的方法。

在这
种方法中，使用能够特异性识别磷酸化位点的抗体进行孵育，从而检测特定蛋白的磷酸化状态。

4.生物信息学预测：还可以使用生物信息学方法来预测蛋白质的磷酸化位点。

这些方法通常基于已知的磷酸化位点和蛋白质序列的特征，通过算法来预测可能的磷酸化位点。

5.实验验证：通过实验验证预测结果是非常重要的。

这可能包括使用突变技术
来改变预测的磷酸化位点，然后观察这种改变对蛋白质功能的影响。

6.数据分析：收集到的数据需要进行详细的分析，以确定磷酸化位点的准确性
和功能性。

总的来说，在实际操作中，可能需要结合多种技术和方法来确定磷酸化蛋白的磷酸化位点。

这些方法的选择和应用取决于具体的研究目的和实验条件。

此外，实验过程中应注意避免可能影响结果准确性的因素，如样本污染、操作不当等。

Western-Blot-原理和操作方法(全)要点

Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

磷酸化检测原理

磷酸化检测原理1. 背景介绍磷酸化是生物体内一种常见的蛋白质修饰方式，能够调控蛋白质的结构、功能和相互作用。

磷酸化在细胞信号传导、代谢调控、细胞周期等生物过程中起着重要作用。

因此，研究磷酸化对于理解生物学过程和疾病机制具有重要意义。

2. 磷酸化检测方法为了检测蛋白质的磷酸化状态，科学家们开发了多种方法。

以下是几种常用的磷酸化检测方法：2.1 免疫印迹（Western Blot）免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，也可以用于检测蛋白质的磷酸化状态。

其基本原理是将待检测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶（PVDF）或硝基纤维素膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合。

随后，使用与特异性抗体结合的二抗进行检测，二抗一般标记有荧光物质或酶，可以通过荧光或化学发光等方式进行检测。

对于磷酸化检测，首先需要使用特异性的磷酸化抗体与目标蛋白质结合。

这些磷酸化抗体通常能够识别磷酸基团在蛋白质上的特定位置。

然后，使用与磷酸化抗体结合的二抗进行检测。

通过比较待检测样品与对照样品的信号强度，可以确定蛋白质是否被磷酸化。

2.2 免疫组织化学染色免疫组织化学染色是一种常用的细胞或组织中蛋白质表达和定位的方法，也可以用于检测蛋白质的磷酸化状态。

其基本原理是将待检测样品固定在载玻片上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合。

然后，使用与特异性抗体结合的二抗进行染色。

对于磷酸化检测，需要使用特异性的磷酸化抗体与目标蛋白质结合。

然后，使用与磷酸化抗体结合的二抗进行染色。

通过观察染色结果，可以确定蛋白质是否被磷酸化以及其在细胞或组织中的定位。

2.3 质谱分析质谱分析是一种高灵敏度、高分辨率的蛋白质分析方法，也可以用于检测蛋白质的磷酸化状态。

其基本原理是将待检测样品进行离子化，并通过质谱仪进行质量/电荷比（m/z）的测量。

对于磷酸化检测，需要首先将待检测样品进行消化，产生肽段。

随后，使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对肽段进行分离和测量。

western-blot的原理及应用

Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。

通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。

2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。

2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。

2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。

2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。

一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。

2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。

2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。

3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。

3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。

3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。

3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。

磷酸化蛋白做WB的小妙招

磷酸化蛋白做WB的小妙招
磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。

然而，有时会出错，本文在此向各位介绍磷酸化蛋白做WB的一些小妙招。

●一定要在Lysis Buffer中加入蛋白酶
抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否
则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。

（磷酸酶抑制剂中，钒酸钠（Na3VO4）的使
用浓度为1mM，氟化钠（NaF）的使用浓度
为1mM）
●加一抗后最好4度过夜，保证抗体有
充分的结合时间，因为磷酸化的蛋白只占总蛋
白量的极少部分；二抗则室温1小时即可。

●磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，
所以要选择好的厂商。

●抗体的稀释倍数要优化，可以根据厂
商建议进行优化。

●用含5% BSA的TBST稀释抗体，不
要用常见的5% -Fat Milk的TBST。

●磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，
所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长
则背景太深盖住想要的那条条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅.。

● 磷酸化蛋白WB时，用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗5min3次即可，宁愿背景深一些,总比做不出来强得多。

另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。