实验五过氧化物同工酶PAGE分析
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶植物098 原硕0901080808摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶一、研究背景及目的：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、研究依据及原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 A液（30%Acr-0.8%Bis） B液（Tris+EDTA） C液（TEMED） D液（10% AP）
含量 2.65mL 4.75mL
10μL 50μL
作用 交联剂 缓冲液 加速剂 催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵
内，加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中 研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上 以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正
极)。打开电源开关，调节电压，以 10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴 酚蓝下行至距胶板末端1-2 厘米处，即可 停止电泳。
实验五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝
胶电泳（PAGE）分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶temp
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素
1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g水稻种子置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
6、剥胶、染色
1种利用SDS_PAGE检测过氧化物酶同工酶的分析方法
表 ２ ５ 种菖蒲的 ＰＡＧＥ 同工酶电泳结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｌｅｃｔｒ ｏｐｈｏｒ ｅｓｉｓ ｒ ｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＡＧＥ ｉｓｏｚｙｍｅ ｆｒ ｏｍ ｆｉｖｅ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ａｃｏｒｕｓ Ｌ．
同工酶带 Ｉｓｏｚｙｍｅ ｂａｎｄ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ
藏菖蒲 香叶菖蒲
Ａｃｏｒｕｓ ｃａｌａｍｕｓ Ｌ．
过氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）同工酶作为一种重要的 遗传标记被广泛应用于生物学研究的各个领域，ＰＯＤ 同工 酶能够在很大程度上反映植物个体之间的遗传差异，是探 测基因差异和遗传变异的一种重要手段［１－３］。ＰＯＤ 同工酶作为 遗传标记，可为农作物、药用植物与药材品种鉴定提供重要 依据［１－３］。传统的 ＰＯＤ 同工酶检测方法是先用聚丙烯酰胺凝 胶电泳（ＰＡＧＥ）分离蛋白质样品，再用醋酸联苯胺染色检测 ＰＯＤ 同工酶。笔者建立了 １ 种检测 ＰＯＤ 同工酶的新方法， 基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ） 分离样品，ＳＤＳ 使 ＰＯＤ 同工酶暂时变性，电泳完毕后，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ!１００ 使 ＰＯＤ 同工酶复性，最后用醋酸联苯胺染色检测ＰＯＤ 同工酶；并利用新建立的方法分析了 ５ 种菖蒲属植物叶子的 ＰＯＤ 同工酶，旨在为菖蒲的科学分类和鉴定提供新的生化 指标。 １ 材料与方法 １．１ 材料 ５ 种菖蒲属植物均采自西南交通大学药学院药 用植物园，由西南交通大学药学院宋良科教授鉴定分别为 藏菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｃａｌａｍｕｓ Ｌ．）、香叶菖蒲（（Ａｃｏｒｕｓ ｘｉｎｇｙｅｕｓ Ｚ． Ｙ．Ｚｈ）、石菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｔａｔａｒｉｎｏｗｉｉ Ｓｃｈｏｔｔ）、金钱菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓ Ｓｏｌａｎｄ．）和宽叶菖蒲（Ａｃｏｒｕｓ ｌａｔｉｆｏｌｉｕｓ Ｚ．Ｙ．Ｚｈ）。
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
分离过氧化物同工酶
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶 蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同 工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的 遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一 定关系，因此作为基因表达的产物，测定同 工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具， 在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有 重要的意义。
4、电泳 加样，连接电极线，电泳。 5、剥胶，染色，记录结果
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联 剂N，N‘-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚 合而成的 聚合:化学法—过硫酸铵-TEMED 光化学法—核黄素-TEMED 光聚合形成的凝胶孔径较大 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决 定
2、分别制备分离胶、浓缩胶
在玻璃板做记号，取专用小烧杯，按分离胶取样表加试剂，混匀后沿长玻 璃板小心加到玻璃板之间（避免产生气泡），加至记号处，立即覆盖 2～3mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面出现时表 明胶已聚合。按浓缩胶取样表加试剂，倒掉分离胶上的水层，立即加入 浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀 释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品 槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
■ 凝胶的聚合：
聚合反应
free radical
Bis Bis
顶点自由基 可再延续
自由基形成
催化系统
聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化 诱发剂系统产生自由基 化学聚合 过硫酸铵—TEMED（四甲基乙二胺） 孔径较小，用于制备分离胶 影响聚合：低pH，氧分子，一些金属离子，低温 光聚合 核黄素—TEMED 需要有痕量氧存在 ，直接日光或室内强散射光 孔径较大，用于制备浓缩胶胶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比： a:b<10 脆硬乳白交联度： a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析
五,操作
1,贮液配制(已完成) ,贮液配制(已完成) 2,安装电泳槽(安装,封底) ,安装电泳槽(安装,封底)
3,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) ,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 4,过氧化物酶的提取 , 按下列比例称取果蔬: 按下列比例称取果蔬: 冬 枣 , 柚 子 , 梨 : 1:2 ; 萝 卜 , 盘 菜 : 1:10 ( W:V) , 剪碎 , 放入研钵中 , 加适量石英砂及 ) 剪碎, 放入研钵中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆, 置于离心管中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆 , 置于离心管中 , 研钵用少量提取液清洗,洗液并入离心管,以 14000r/min的转速离心 / 的转速离心15min,取上清液贮存于低 的转速离心 , 温冰箱备用. 温冰箱备用.
三,实验步骤
1,取上述样品提取液 , 取上述样品提取液2.5mL,定容至 刻度, , 定容至50mL刻度, 备 刻度 用(仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释). 仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释) 2, 取光径 , 取光径1cm比色皿 只 , 于 1只中加入反应混合液 比色皿2只 比色皿 只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液 和磷酸缓冲液1mL, 作为对照 , 另 1只中加入反 和磷酸缓冲液 , 作为对照, 只中加入反 应混合液3mL和上述酶液 和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释 应混合液 和上述酶液 ( 立即开启秒表记录时间, 之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量 波长470nm下吸光度值 , 每隔 下吸光度值, 每隔1min读数一次 ( 连读 读数一次( 波长 下吸光度值 读数一次 5min,取平均值). ,取平均值)
四,试剂与材料
A(分离胶缓冲液) 1mol/L HCL (分离胶缓冲液) / /100mL Tris TEMED B(浓缩胶缓冲液) 1mol/L HCL (浓缩胶缓冲液) / /100mL C(分离胶贮液) (分离胶贮液) 贮液 /100mL D(浓缩胶贮液) (浓缩胶贮液) 贮液 /100mL Tris TEMED 丙烯酰胺 丙烯酰胺 48mL 36g 24L 48mL 5.9g 48L 30g pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9
过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。
2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
实验步骤
（一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向
各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的 浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
表 绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与
蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
实验原理 实验材料与器材 实验试剂coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
实验五过氧化物酶酶活性的测定
三、实验材料
菠菜、油菜、树叶、草、
四、仪器用品与试剂
分光光度计，研钵，移液管，吸管 愈创木酚，30％过氧化氢，磷酸缓冲液
五、实验步骤
1、称取植物材料 0.5g ，剪碎，放入研钵中，加入 1 ml 磷酸缓冲液 （ 0.05mol/L）研磨成匀浆，以 12000 rpm 离心 15 min ，上清液即为粗 酶液。 对照管 测定管 试剂 0.01mol/L磷酸缓冲液，ml 0.02mol/L 愈创木酚，ml
此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重 要作用也正在受到重视。
二、实验原理
RH2+ H2O2→2H2O + R 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能 使邻甲氧基苯酚（愈创木酚）氧化，生成茶 褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收， 可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变 化速率来测定过氧化物酶活性。
植物组织中过氧化物Biblioteka 活性的测定——愈创木酚比色法
一、实验目的
熟悉测定过氧化物酶活性的常用方法及其测 定原理。
过氧化物酶（POD)
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活 性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及 生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过 程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中 活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过 氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转 化成木质素，增加木质化程度。
酶液，ml
0 2.92 0.05 0
1 2.9 0.05 0.02
2 2.9 0.05 0.02
3 2.9 0.05 0.02
加好反应物，摇匀，立即加新配制的H2O2 (0.01 ml)，即刻摇 匀并计时，每隔 30s 读数1次，共计6个数值。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。
它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。
根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶（实验报告）
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶（实验报告）⽣物化学实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶⼀、研究背景及⽬的电泳现象就是带电粒⼦在电场中向与其⾃⾝带相反电荷的电极泳动。
电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，⾃此⽣物⼤分⼦的分离纯化便进⼊了电泳技术的新纪元。
电泳技术的发明是⼈们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上⼜⼀次伟⼤的飞跃。
⼈们清楚地意识到，要想使⽬标物得到分离，⽬标物与杂质之间的性质差异必须⾜够⼤，这⼜与某些性质差异⼩的物质的分离相⽭盾，⽽⼈为放⼤这些差异⼩的性质必然会破坏⽬标物的原有结构，因此需要借助第三者进⾏差异转化，即以其⾃⾝的性质为基础，转化为其他⽅⾯差异⼤的性质。
电泳技术就是利⽤⼀些⽣物⼤分⼦的电性特点，在⼀定的条件下使被分离物之间很⼩的差异转化为⾃⾝所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作⽤下便会体现出迁移⽅向及速度上的差异，通过时间上的积累进⽽体现为迁移距离的差异。
最初的电泳技术是在溶液中进⾏的⾃由电泳，后来⼈们想到，由于待分离物的⼤⼩、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻⼒，这种阻⼒的差异⼜转化为了电场中迁移速度的差异，所以⼈们便发明了各种⽤于电泳的载体（⽀持介质），使分⼦的⼤⼩及形状差异得以转化和体现，⼤⼤提⾼了分辨率。
⾄此，电泳技术的基本理论就建⽴了。
此后，在实际操作中，⼈们不断进⾏探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为⼀项⽣物⼤分⼦分离纯化中令⼈瞩⽬的研究技术。
本实验基于电泳的基本原理对⼩麦过氧化物酶同⼯酶进⾏分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解⼀项新技术在实际应⽤中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两⼤技术各⾃的特点和优势。
⼆、原理[1]1.过氧化物酶同⼯酶同⼯酶是催化同⼀种化学反应，但其酶蛋⽩本⾝的分⼦结构组成却有所不同的⼀组酶。
同工酶分析自材料
一、植物过氧化物酶同工酶的测定：
【实验原理】
以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
PAGE 兼有电荷效应和分子筛效应。
被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。
利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2联苯胺的溶液染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多余有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。
二、
三/
，过氧化氢酶（CAT）是由一条肽链组成的同四聚体酶。
同工酶的分析是根据同工酶分子结构的
差异，通常用电泳技术加以分离后，再根据
它们的催化作用相同因而可能使用同一显色
法测定其酶活性的原理获得同工酶谱。
一个基因的产物也可能形成一个
以上的同工酶带。
这可能是由于多肤合成之
后的分解(形成大小不同的酶分子)或极性修
饰或分子构型发生改变而产生多条酶带。
基础生物化学实验课件PPT-植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析
➢化学聚合：使用AP作催化剂，常用于制备分离胶（小孔胶）。 过量氧会影响链的延长和聚合，所以过硫酸铵(AP)催化的化学
聚合要水封以隔O2。 ➢光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照， 适用于制备 浓缩胶(大孔胶)。
应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全 为宜。
2.2.2 凝胶孔径的可调性及其有关性质
实验原理图
1 样品浓缩效应
(1)凝胶孔径不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性
(1)凝胶孔径不连续性:
浓缩胶 T=3%
孔径大
分离胶T=7%或7.5% 孔径小
在2层凝胶交界处，由于凝胶 孔径的不连续性使样品迁移受 阻而压缩成很窄的区带。
(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性:
3 电荷效应
进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所 带净电荷不同，而有不同的迁移率。
表面电荷多，则迁移快；反之，则慢
各种蛋白质按电荷多少、分子量及形 状，以一定顺序排成一个个条型的区 带，从而达到分离的目的。
2.4 植物过氧化物酶同工酶的测定原理
(1)植物同工酶
凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同 工酶。
植物组织中的同工酶（isoenzyme）是基因表达的产物。 每一种植物都有相同的遗传信息，其表达产物与植物的发育和所处的环 境有十分密切的关系，植物不同组织和器官有不同的形态特征和化学组 成，从而合成不同的酶蛋白。
在研究植物基因调控与生长发育、与环境条件的关系以及许多生理生化 和遗传问题时，常常需要分析同工酶谱的差异。
20～30 15～20 10～15 5～10 2～5
核酸（RNA） 〈104
实验五 过氧化物酶活性的测定
实验五过氧化物酶活性的测定——比色法实验目的：熟悉测定过氧化物酶活性的常用比色法及灵敏度较高的化学发光法及其测定原理。
实验原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470 nm 处有最大光吸收值，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。
器材与试剂：1.实验仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、天平2. 实验试剂（1）100mmol/L 磷酸缓冲液（pH=6.0）：[0.2M的Na2HPO412.3mL和NaH2PO487.7mL混合后稀释2倍]（2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。
3. 实验材料任何植物材料实验步骤：（1）粗酶液的提取称取植物材料1g, 加20mmol/LKH2PO4 5mL, 于研钵中研磨成匀浆, 以4000r/min离心15min, 收集上清液保存在冷处, 所得残渣再用5mLKH2PO4 溶液提取一次, 合并两次上清液。
（2）酶活性的测定取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL（或加热煮沸5 min 的酶液），作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上在波长470nm下测量吸光度值，每隔0.5min（30S）读数一次，连续读数3次。
结果计算：以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；W——植物鲜重（g）；t——反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。
注意事项酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。
生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析
电泳槽系列DYCZ-24D
• 产品名称：迷你双垂直电泳槽 • 产品型号：DYCZ-24D • 产品售价: 1200元
产品说明： 高透明度聚碳酸脂注塑成型，品 质与进口产品相同。使用极其方便 可靠，绝不漏胶漏缓冲液。凝胶板 净面积82×82（mm），双板，可作 0.75、1、1.5（mm）胶（任选两 种），试样格10、15齿。 试样格（梳子） 1mm 10齿 2把 1mm 15齿 2把 1.5mm 10齿 2把 1.5mm 15齿 2把
10g
/100mL
亚甲基双丙烯酰胺 2.5g
pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9 pH 6.7
E 核黄素/100mL
核黄素 4mg
F 蔗糖/100mL
蔗糖
40g
电极缓冲液/100mL （用时稀释10倍）
Tris 甘氨酸
6g 28.8g
封板胶 （加热煮沸）
琼脂粉 电极液
1g 100mL
样品提取液
电泳开始后，由于快离子的泳动率最大， 在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域， 即低电导区。电导与电势梯度是成反比的，低 电导区就产生了较高的电势梯度，这种高电势 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动， 因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成 一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效 泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚 集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的 样品薄层。
样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快 速移动到小孔径的下层分离胶时，由于凝 胶孔径突然变小而移动速度大大减慢，使 之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一 狭窄的区带，一齐进入分离胶，然后再进 行与连续凝胶电泳类似的电泳分离。
1种利用SDS-PAGE检测过氧化物酶同工酶的分析方法
一
＿。
。
０
一
过 氧化 物 酶 （ ｅ０ｉａｅ Ｐ Ｄ） Ｐ ｒｘｄ ｓ ， Ｏ 同工 酶 作 为 一种 重要 的
Ｂａ ｒ 方法凹 以牛 血清白蛋白为标准ｏＯ ｒ ｏｄ ｆ ， Ｐ Ｄ活性测定采用
愈创木 酚方 法圈 。
遗传 标记 被 广 泛应 用 于 生物 学 研 究 的各 个 领 域 ，Ｏ Ｐ Ｄ同工 酶能 够 在很 大 程度 上 反 映植 物 个 体 之 间 的遗 传 差异 ， 探 是 测基 因差 异和遗 传变 异的一种 重要 手段［］ Ｏ ｉ。 Ｄ同工酶 作为 －Ｐ ３ 遗传标 记 ， 为农 作物 、 可 药用 植物 与 药材 品种 鉴 定提 供 重要 依据 。 统 的 Ｐ Ｄ同工 酶检 测方 法 是先 用 聚丙 烯 酰胺 凝 传 Ｏ 胶 电泳 （Ａ Ｅ 分 离蛋 白质 样 品 ， 用醋 酸联 苯 胺染 色检 测 ＰＧ ） 再 Ｐ Ｄ同工 酶 。 者 建立 了 １ Ｏ 笔 种检 测 Ｐ Ｄ同工 酶 的新 方 法 ， Ｏ 基 本原 理 为 ： 聚丙 烯酰 胺凝 胶 中加入 十二 烷基 磺 酸钠 （Ｄ ） Ｓ Ｓ 分 离样 品 ，Ｄ 使 Ｐ Ｄ同工 酶暂 时变 性 ， ＳＳ Ｏ 电泳 完毕 后 ，ｉ０ Ｔｔ ｌ ｎ Ｘ １０ Ｐ Ｄ同工酶复 性 ， 一 使 Ｏ ０ 最后用 醋 酸联苯 胺染色 检测 Ｐ Ｄ ０ 同工酶 ； 并利用 新建立 的方 法分 析 了 ５ 种菖蒲 属植 物 叶子的 Ｐ Ｄ同工 酶 ， Ｏ 旨在 为 菖蒲 的科 学 分 类 和鉴 定 提供 新 的生化 指标。
Ａ ｔ ｃｉ ｇＭ ｅ ｈｏ ｏｒＡｎａｙｓｓｏｆ ｒ ｘ ｄ ｓ ｓ ｅ ｙ ｅ ｉ Ｄ Ｓ ＡＧ Ｅ Ｄｅｅ ｔｎ ｔ ｄ ｆ ｌ ｉ ｏ ｉ ａ ｅＩ ｏ ｎｚ ｍ ｓＵｓｎｇＳ Ｐｅ
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医学ppt
20
五、结果与分析
结果 电泳图或模式图
分析 过氧化物同工酶的医学种ppt 类及活力大小 21
六、讨论与心得
实验注意事项 心得收获
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22
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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7
反应过程
TEMED催化AP生成硫酸自由基
S2O82－
2SO4·¯
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体 长链：
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8
Bis将单体长链间连成网状结构：
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9
PAGE法分离蛋白质的三种效应
电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在 同一电场中泳动率不同；
分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同， 在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各 不相同，泳动率也不相同；
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三、材料、仪-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
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1.电泳概念
电泳：带电粒子在电场中向与其电性 相反的电极移动的现象。
—
○+
○-
+
○-
○+
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4
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
2.电泳分类
显微电泳
自由界面电泳
区带电泳
– 纸电泳
– 醋酸薄膜电泳
– 琼脂糖凝胶电泳
– 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
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5
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过 硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺 凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
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17
四、操作步骤
装槽、上样
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30-50μL
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四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
实验五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝
胶电泳（PAGE）分析
（P98）
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1
一、目的
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术 的原理和操作方法
掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理 和方法
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2
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 过氧化物同工酶及活性染色
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3
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） P20
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，
测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某
一时期植物体内代谢的变化。
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（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、 电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个 极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条 带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应）
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（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的 分子结构及其理化性质不同的一组酶。
3.电泳法原理
在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的 电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素：
颗粒性质：
– 净电荷数目 – 颗粒大小 – 颗粒形状
电场强度：V/cm 溶液性质：
– 缓冲液的pH – 离子强度 – 溶液黏度 – 电渗：液体对固体支持物的相对移动
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6
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
15
四、操作步骤
凝胶制备
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
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四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物 酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方 法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化 物酶同工酶。
H2O2
过氧化物+过氧化物酶 → 复合物
复合物+DH2 → 过氧化物酶 +H2O+联D苯胺
棕色物质
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三、材料、仪器和试剂
材料：小麦幼苗
仪器：电泳仪、 电泳槽、高速离 心机、量筒、烧 杯、微量注射器、 研钵、染色盒
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
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四、操作步骤
剥胶、染色
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取 下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地 将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染 色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。