创新实验申请书
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然而，脐带血中HSPCs的数量有限，无法 满足临床移植的需要。近年来不断发展的造血 细胞体外扩增技术，希望能通过在短时间内扩 增细胞，来满足这一需求。但研究发现，添加 大量细胞因子所扩增的HSPCs常发生过度分化， 输入体内后的移植效果不能令人满意。因此， 寻找更加合理的体外扩增手段，使造血细胞在 体外大量扩增的同时，又能保持其干/祖细胞 的特性，是研究中要解决的关键问题。
指导教师签字： 年 月 日
10
所在 院系 意见
负责人签字：
（公章） 年 月 日
学校 评审 意见
年 月 日
签章：
11
3）脐带血 CD34+细胞的微囊化培养 a. 首先进行载 CD34+细胞 GAC 微囊的制备。将 已经分离的 CD34+细胞进行传代培养以使其细 胞数满足实验需求。然后取生长状态良好的 CD34+细胞进行消化离心，加入明胶溶液(2.0% w/v，溶于 DMEM 培养基中)使细胞重悬，调整 细胞密度为 2×106cellsmL1。在培养箱中孵 育 30 min，使 CD34+细胞与明胶充分接触。按 海藻酸钠:明胶=3:1 的比例加入海藻酸钠溶液 (2.0% w/v)，混合均匀后，加入到注射器中， 此时细胞密度为 5×105 cellsmL1。开动微囊 制备装置，在电压 6kV，流速 40mLh1 条件下， 滴加 1 mL 细胞混合液到 30 mL CaCl2(1.1 % w/v) 溶液中进行凝胶化反应，形成载细胞明胶海藻 酸钠微胶珠。然后将胶珠加到壳聚糖溶液 (0.5% w/v)中覆膜反应 10 min，形成载细胞 GAC 微胶囊。用 PBS 洗涤三次，再用无血清 IMEM 洗涤一次。 b. CD34+细胞的微囊化培养。将制备好的微囊 加到 6 孔板的一个孔中，并添加适量 IMEM 培 养基。共制备 6 组微囊，分别在常氧(20%氧浓 度)培养箱和低氧(5%氧浓度)培养箱中培养过 夜，每种条件下设置 3 组进行平行实验。将微 囊化 CD34+细胞接种于 6 孔板中，每孔添加 3 mL，平行 3 孔。低氧组记为 a’，常氧组记为 a。培养基采用无血清 IMEM，添加少量生长因 子，包括 2.4 ngmL1 IL-3，10 ngmL1 FL，20 ngmL1 SCF，2.0 ngmL1 GM-SCF，3.2 ngmL1 TPO。一共培养 7 d，每天取样前轻轻吹散细胞， 使 CD34+细胞分泌的信号因子和造血生长因子 等分散均匀，每孔取 0.2mL 细胞悬液进行各种 检测，取样后补加相同体积的新鲜培养液。另
9
（从项目学科性、前沿性、可行性、研究性、 可操作性和成效性加以评价） 本项目针对当前国际造血干细胞领域的热点， 在体外分离培养脐带血造血干/祖细胞的基础 上，将细胞微囊化的体外扩增技术与造血干/ 祖细胞的相关研究内容有效结合，具有很好的 前沿性、创新性和可行性。此外，本课题研究 思路清晰、新颖，目标明确，可操作性强，具 指导 有较好的基础研究价值，可为体外收获充足的 教师 造血干/祖细胞以尽快应用于临床治疗相关的 意见 血液类疾病打好坚实的基础。
研
HSPCS) 是体内各种成熟血细胞的唯一来源，它 主要存在于脐带血、骨髓和外周血中。HSPCs
究意
在治疗贫血等血液疾病、白血病等癌症病人高 剂量放化疗后的造血重建、基因治疗和免疫治
义 疗以及制备成熟血液产品等方面有极重要的
1
临床应用价值，因此多年来一直得到科研工作 者和临床医生的高度重视和关注。
有关微囊化基质细胞与造血干细胞共培 养的研究，刘洋等在旋转壁式反应器中进行了
2
微囊化骨髓间充质干细胞支持脐血造血干/祖 细胞体外扩增研究。但是到目前尚没有在低氧 环境中采用微囊化的方法包埋CD34+ 细胞进行 体外扩增的报道。本研究正是基于目前对CD34+ 细胞和造血生态位区的最新认识，从工程学的 角度设计出一种利用微囊化的CD34+ 细胞在低 氧环境下培养的策略，实现造血干/祖细胞的 有效体外扩增。
脐带血是目前临床上HSPCs的重要来源， 其富含更早期的HSPCs、免疫原性弱、对异源 性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采 集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损 伤及副作用、CD34+ CD38 与CD34+ CD33的比例 较高等一系列优点，使得与脐带血有关的造血 干/祖细胞的研究成为热点。
6
2009 年 9 月 1 日~2010 年 2 月 29 日：查阅资 料、选 题、自 主设计 项目研 究方案、 开题报 告、实 验研究； 进行人 源脐血 造血干 / 祖细 胞的体 外分离 和培养 以及 CD34+ 细胞的 分离和 培养;
7Fra Baidu bibliotek
2010 年 3 月 1 日~2010 年 8 月 31 日：进行 CD34+ 细胞的 微囊化 培养， 并完成 扩增后 造血干 / 祖细 胞的生 物学鉴 定；填 写结题 表、撰 写研究 论文和 总结报 告、参 加结题 答辩。
研究内容： 1） 人源脐血造血干/祖细胞（HSPCs）的体
外分离和培养 将从健康足月分娩产妇采集到的脐带血(含抗 研究 凝剂)缓慢叠加到 Ficoll 淋巴分离液上，两者 内容 体积比为 1:1~2:1。然后，进行密度梯度离心 和拟 (2500rmin1，25 min)，吸取中间白膜层。将 解决 吸 取 到 的 细 胞 用 含 有 10% 胎 牛 血 清 的 的关 D-Hank’s 平 衡 盐 溶 液 离 心 洗 涤 两 次 (1000 键问 rmin1，5 min)，之后调整密度接种到培养瓶 题 中备用。
8
（如材料费、资料费、版面费、专利费、调研 费等） 材料费：4000 元 资料费：1500 元 项目 版面费：1500 元 经费 专利费：1500 元 预算 调研费：1500 元 经费预算总计：10000 元 （如项目鉴定、学术论文、申请专利、获奖、 推广应用等） 预期 研究 成果 预期发表 SCI 论文 1-2 篇。
创新实验申请书
项目编 号
大连理工大学大学生创新性实验计划项目
申报书
项目名称： 人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增
项目负责人：
所在院系： 化工学院化学工程系
指导教师：
申请时间：
2009 年 6 月 29 日
教务处制表
项目名称 申请经费
人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增
10000 元
起止时 2009.9.1-2010 .8.3
2)脐带血 CD34+细胞的分离和培养 用免疫磁珠筛选分离法（magnetic activated
3
cell sorting, MACS）分选 CD34+细胞。 然后将分离出的 CD34+细胞接种到培养瓶中。 在接种到 6 孔板共培养以前，CD34+细胞在 T 形 瓶中培养过夜，以适应体外生长条件。
自干细胞的增殖发育存在于微环境的假 说被提出，大量研究证明了干细胞生态位区的 存在。低氧浓度也是骨髓造血niche区域的特 征之一，因此在HSPCs体外培养过程中，低氧 环境也起到非常重要的作用。Smith和Koller 等应用3%-7%的低氧环境进行造血细胞的体外 培养，发现这些中度的低氧环境均能增加各系 祖细胞的产率，且不影响它们的分化与成熟。 并推测是因为其氧浓度接近于体内造血环境 的氧含量，比在常氧条件下的培养体系能减少 氧自由基的形成或增加细胞因子的生成。孙冰 等进行了低氧和常氧条件下单核细胞和CD34+ 细胞的半固体和液体培养，计细胞总数和集落 产率，发现体外低氧环境能显著增加CD34+ 造 血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率，且使其 对细胞因子的依赖性降低，并对早期红系祖细 胞的维持有增强作用。体内造血过程是一个非 常复杂而周密的调节系统, 低氧所致造血细胞 增殖、分化和凋亡的改变是由一系列细胞内信 号转导、各种生物化学反应及相关基因表达改 变的综合结果。
5
G-CSF 20 ngmL1 和 EPO 3 UmL1，于 37℃、5% CO2 、饱和湿度下培养 7 d 和 14 d 后计数 CFU-Cs。
d．数据统计分析：实验中统计数据以 mean ±SD 表示，两组间比较采用 t 检验，四组间比 较选用双因素方差分析，用 Origin7.5 软件进 行统计分析。
间1
负 姓 院（系） 专业 班 学号 联系电话
责名
级
人
化工 化工英
学院 强
化工 化工英 参
学院 强 加
成
员
姓名
职 讲师 学 工学
指导
称
位 博士
教师 单位 大连理工大 联系方
学化工学院 式
项目 （同类研究工作国内外研究现状与存在的问
背 题等）
景及
数量稀少 (Hematopoietic
的造血干/祖细胞 stem/progenitor cells,
4
外，分别在常氧和低氧条件下进行 CD34+细胞 单独培养作为对照，低氧组记为 b’，常氧组为 b。 培养和检测方法与微囊化培养组相同。
4）扩增后造血干/祖细胞的生物学鉴定 a.细胞计数：使用血球细胞计数板和台 盼兰拒染法进行总有核细胞计数。 b. CD34+细胞检测：使用 CellQuest Pro 流式细胞仪对新分离以及培养后的造血 细胞(细胞数大于 1.0×106 个/组)进行表面抗 原检测。首先，用含有 1%胎牛血清的 PBS 溶液 将细胞离心洗涤一次 (1000 rmin1，5 min)。 之后，加入 CD34+抗体，并在 4℃下避光孵育 30 min 。然后，再使用 PBS 离心洗涤一次细胞 (1000 rmin1，5 min)，最后上机进行检测。 c.集落形成检测：将扩增前的单个核细 胞和扩增后的细胞分别以 1×105 cellsmL1 的 密度接种于甲基纤维素半固体培养基 (MethoCultTM GF H4435. Stem Cell Technologies 公司产品)中，内含 30% FBS、10 gL1 牛血清白蛋白、104 molL1 2-巯基乙醇、 2 mmolL1 L-谷氨酰胺、SCF 50 ngmL1、IL-3 20 ngmL1 、IL-6 20 ngmL1 、GM-CSF 20 ngmL1、
拟解决的关键问题 1） 人源脐血造血干/祖细胞包囊的最佳接种
密度； 2） 细胞生长因子的最佳使用浓度。
项目 使用微囊化方法包埋造血干/祖细胞（CD34＋细 创新 胞）进行体外扩增 之处
（查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、 项目 开题报告、实验研究、数据统计、处理与分析、 进度 研制开发、填写结题表、撰写研究论文和总结 安排 报告、参加结题答辩和成果推广等）
指导教师签字： 年 月 日
10
所在 院系 意见
负责人签字：
（公章） 年 月 日
学校 评审 意见
年 月 日
签章：
11
3）脐带血 CD34+细胞的微囊化培养 a. 首先进行载 CD34+细胞 GAC 微囊的制备。将 已经分离的 CD34+细胞进行传代培养以使其细 胞数满足实验需求。然后取生长状态良好的 CD34+细胞进行消化离心，加入明胶溶液(2.0% w/v，溶于 DMEM 培养基中)使细胞重悬，调整 细胞密度为 2×106cellsmL1。在培养箱中孵 育 30 min，使 CD34+细胞与明胶充分接触。按 海藻酸钠:明胶=3:1 的比例加入海藻酸钠溶液 (2.0% w/v)，混合均匀后，加入到注射器中， 此时细胞密度为 5×105 cellsmL1。开动微囊 制备装置，在电压 6kV，流速 40mLh1 条件下， 滴加 1 mL 细胞混合液到 30 mL CaCl2(1.1 % w/v) 溶液中进行凝胶化反应，形成载细胞明胶海藻 酸钠微胶珠。然后将胶珠加到壳聚糖溶液 (0.5% w/v)中覆膜反应 10 min，形成载细胞 GAC 微胶囊。用 PBS 洗涤三次，再用无血清 IMEM 洗涤一次。 b. CD34+细胞的微囊化培养。将制备好的微囊 加到 6 孔板的一个孔中，并添加适量 IMEM 培 养基。共制备 6 组微囊，分别在常氧(20%氧浓 度)培养箱和低氧(5%氧浓度)培养箱中培养过 夜，每种条件下设置 3 组进行平行实验。将微 囊化 CD34+细胞接种于 6 孔板中，每孔添加 3 mL，平行 3 孔。低氧组记为 a’，常氧组记为 a。培养基采用无血清 IMEM，添加少量生长因 子，包括 2.4 ngmL1 IL-3，10 ngmL1 FL，20 ngmL1 SCF，2.0 ngmL1 GM-SCF，3.2 ngmL1 TPO。一共培养 7 d，每天取样前轻轻吹散细胞， 使 CD34+细胞分泌的信号因子和造血生长因子 等分散均匀，每孔取 0.2mL 细胞悬液进行各种 检测，取样后补加相同体积的新鲜培养液。另
9
（从项目学科性、前沿性、可行性、研究性、 可操作性和成效性加以评价） 本项目针对当前国际造血干细胞领域的热点， 在体外分离培养脐带血造血干/祖细胞的基础 上，将细胞微囊化的体外扩增技术与造血干/ 祖细胞的相关研究内容有效结合，具有很好的 前沿性、创新性和可行性。此外，本课题研究 思路清晰、新颖，目标明确，可操作性强，具 指导 有较好的基础研究价值，可为体外收获充足的 教师 造血干/祖细胞以尽快应用于临床治疗相关的 意见 血液类疾病打好坚实的基础。
研
HSPCS) 是体内各种成熟血细胞的唯一来源，它 主要存在于脐带血、骨髓和外周血中。HSPCs
究意
在治疗贫血等血液疾病、白血病等癌症病人高 剂量放化疗后的造血重建、基因治疗和免疫治
义 疗以及制备成熟血液产品等方面有极重要的
1
临床应用价值，因此多年来一直得到科研工作 者和临床医生的高度重视和关注。
有关微囊化基质细胞与造血干细胞共培 养的研究，刘洋等在旋转壁式反应器中进行了
2
微囊化骨髓间充质干细胞支持脐血造血干/祖 细胞体外扩增研究。但是到目前尚没有在低氧 环境中采用微囊化的方法包埋CD34+ 细胞进行 体外扩增的报道。本研究正是基于目前对CD34+ 细胞和造血生态位区的最新认识，从工程学的 角度设计出一种利用微囊化的CD34+ 细胞在低 氧环境下培养的策略，实现造血干/祖细胞的 有效体外扩增。
脐带血是目前临床上HSPCs的重要来源， 其富含更早期的HSPCs、免疫原性弱、对异源 性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采 集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损 伤及副作用、CD34+ CD38 与CD34+ CD33的比例 较高等一系列优点，使得与脐带血有关的造血 干/祖细胞的研究成为热点。
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2009 年 9 月 1 日~2010 年 2 月 29 日：查阅资 料、选 题、自 主设计 项目研 究方案、 开题报 告、实 验研究； 进行人 源脐血 造血干 / 祖细 胞的体 外分离 和培养 以及 CD34+ 细胞的 分离和 培养;
7Fra Baidu bibliotek
2010 年 3 月 1 日~2010 年 8 月 31 日：进行 CD34+ 细胞的 微囊化 培养， 并完成 扩增后 造血干 / 祖细 胞的生 物学鉴 定；填 写结题 表、撰 写研究 论文和 总结报 告、参 加结题 答辩。
研究内容： 1） 人源脐血造血干/祖细胞（HSPCs）的体
外分离和培养 将从健康足月分娩产妇采集到的脐带血(含抗 研究 凝剂)缓慢叠加到 Ficoll 淋巴分离液上，两者 内容 体积比为 1:1~2:1。然后，进行密度梯度离心 和拟 (2500rmin1，25 min)，吸取中间白膜层。将 解决 吸 取 到 的 细 胞 用 含 有 10% 胎 牛 血 清 的 的关 D-Hank’s 平 衡 盐 溶 液 离 心 洗 涤 两 次 (1000 键问 rmin1，5 min)，之后调整密度接种到培养瓶 题 中备用。
8
（如材料费、资料费、版面费、专利费、调研 费等） 材料费：4000 元 资料费：1500 元 项目 版面费：1500 元 经费 专利费：1500 元 预算 调研费：1500 元 经费预算总计：10000 元 （如项目鉴定、学术论文、申请专利、获奖、 推广应用等） 预期 研究 成果 预期发表 SCI 论文 1-2 篇。
创新实验申请书
项目编 号
大连理工大学大学生创新性实验计划项目
申报书
项目名称： 人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增
项目负责人：
所在院系： 化工学院化学工程系
指导教师：
申请时间：
2009 年 6 月 29 日
教务处制表
项目名称 申请经费
人源脐血造血干/祖细胞的体外扩增
10000 元
起止时 2009.9.1-2010 .8.3
2)脐带血 CD34+细胞的分离和培养 用免疫磁珠筛选分离法（magnetic activated
3
cell sorting, MACS）分选 CD34+细胞。 然后将分离出的 CD34+细胞接种到培养瓶中。 在接种到 6 孔板共培养以前，CD34+细胞在 T 形 瓶中培养过夜，以适应体外生长条件。
自干细胞的增殖发育存在于微环境的假 说被提出，大量研究证明了干细胞生态位区的 存在。低氧浓度也是骨髓造血niche区域的特 征之一，因此在HSPCs体外培养过程中，低氧 环境也起到非常重要的作用。Smith和Koller 等应用3%-7%的低氧环境进行造血细胞的体外 培养，发现这些中度的低氧环境均能增加各系 祖细胞的产率，且不影响它们的分化与成熟。 并推测是因为其氧浓度接近于体内造血环境 的氧含量，比在常氧条件下的培养体系能减少 氧自由基的形成或增加细胞因子的生成。孙冰 等进行了低氧和常氧条件下单核细胞和CD34+ 细胞的半固体和液体培养，计细胞总数和集落 产率，发现体外低氧环境能显著增加CD34+ 造 血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率，且使其 对细胞因子的依赖性降低，并对早期红系祖细 胞的维持有增强作用。体内造血过程是一个非 常复杂而周密的调节系统, 低氧所致造血细胞 增殖、分化和凋亡的改变是由一系列细胞内信 号转导、各种生物化学反应及相关基因表达改 变的综合结果。
5
G-CSF 20 ngmL1 和 EPO 3 UmL1，于 37℃、5% CO2 、饱和湿度下培养 7 d 和 14 d 后计数 CFU-Cs。
d．数据统计分析：实验中统计数据以 mean ±SD 表示，两组间比较采用 t 检验，四组间比 较选用双因素方差分析，用 Origin7.5 软件进 行统计分析。
间1
负 姓 院（系） 专业 班 学号 联系电话
责名
级
人
化工 化工英
学院 强
化工 化工英 参
学院 强 加
成
员
姓名
职 讲师 学 工学
指导
称
位 博士
教师 单位 大连理工大 联系方
学化工学院 式
项目 （同类研究工作国内外研究现状与存在的问
背 题等）
景及
数量稀少 (Hematopoietic
的造血干/祖细胞 stem/progenitor cells,
4
外，分别在常氧和低氧条件下进行 CD34+细胞 单独培养作为对照，低氧组记为 b’，常氧组为 b。 培养和检测方法与微囊化培养组相同。
4）扩增后造血干/祖细胞的生物学鉴定 a.细胞计数：使用血球细胞计数板和台 盼兰拒染法进行总有核细胞计数。 b. CD34+细胞检测：使用 CellQuest Pro 流式细胞仪对新分离以及培养后的造血 细胞(细胞数大于 1.0×106 个/组)进行表面抗 原检测。首先，用含有 1%胎牛血清的 PBS 溶液 将细胞离心洗涤一次 (1000 rmin1，5 min)。 之后，加入 CD34+抗体，并在 4℃下避光孵育 30 min 。然后，再使用 PBS 离心洗涤一次细胞 (1000 rmin1，5 min)，最后上机进行检测。 c.集落形成检测：将扩增前的单个核细 胞和扩增后的细胞分别以 1×105 cellsmL1 的 密度接种于甲基纤维素半固体培养基 (MethoCultTM GF H4435. Stem Cell Technologies 公司产品)中，内含 30% FBS、10 gL1 牛血清白蛋白、104 molL1 2-巯基乙醇、 2 mmolL1 L-谷氨酰胺、SCF 50 ngmL1、IL-3 20 ngmL1 、IL-6 20 ngmL1 、GM-CSF 20 ngmL1、
拟解决的关键问题 1） 人源脐血造血干/祖细胞包囊的最佳接种
密度； 2） 细胞生长因子的最佳使用浓度。
项目 使用微囊化方法包埋造血干/祖细胞（CD34＋细 创新 胞）进行体外扩增 之处
（查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、 项目 开题报告、实验研究、数据统计、处理与分析、 进度 研制开发、填写结题表、撰写研究论文和总结 安排 报告、参加结题答辩和成果推广等）