生物乳腺反应器的原理及进展

动物乳腺生物反应器的原理及进展

摘要：

动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。

关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点

动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物

乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。1生物反应器(bioreactor) 经历了3 个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必

须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物,

而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本

太高,限制了规模生产。动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。它是在转基因技术体系基础上发展起来的。7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多

突破，现己成为生物技术研究的热点。并向商业化阶段转变，显示

了广阔的应用前景。并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。2

1、动物乳腺生物反应器的原理

乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一

个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化

简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。

2、动物乳腺生物反应器的主要研究内容

2、1 乳腺特异表达载体的构建

乳腺特异表达载体就是能够在动物的乳腺部位特异表达携带外

源目的基因的DNA片段。目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。7乳腺特异表达载体的首先要具备乳腺特异的启动子，目前所熟知的乳腺特异启动子有Beta-乳球蛋白基因的启动子，αS1 /Beta 酪蛋白启动子( αS1 /Beta Casein，CA) ，乳清酸蛋白基因启动子，其中研究最多和效果较佳的是绵羊的BLG、牛的αS1CA、山羊的Beta-CA、小鼠的WAP 等基因的启动子．如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA,表达效果可能会更好。不翻译的外显子和内含子的掺入可能有利于转基因的表达。5

2． 2 乳腺生物反应器的基因介导方法9

1) 微注射法

微注射法是指直接将裸露的线形DNA 直接注射到胚胎原核中，使得目的DNA 整合到宿主基因组上。这种方法基因整合效率低，在家畜中尤其如此，家兔和猪为5% ～ 15%，山羊2%，绵羊1% ～ 5%，而牛不超过0． 5%，而且成本高; 基因只能加入，不能剔除或原位修饰; 整合是随机的，由于插人位点的关系，转基因的表达不确定;随机整合可能破坏重要的内源性DNA 序列或激活细胞的致癌基因; 产生的

转基因动物常常是嵌合体，即并非所有细胞都整合有外源基因; 以及不能在胚胎早期确定性别等。

2) 细胞转染与核移植

利用近年来发展起来的基因打靶技术，可以将目的基因定点整合至细胞染色体上的特定位置，目前基因打靶的位置主要还集中在乳蛋白基因座，因为乳蛋白的敲除对于宿主本身的影响不是很大。目前反刍动物的干细胞发展很缓慢，利用体细胞打靶在理论上是可行的，但是体细胞基因打靶的效率比干细胞要低2 个数量级。而且非同源重组的效率特别高，需要提高多种途径提高打靶效率，目前核移植的方法几乎就是整个转基因的关键步骤，也是限制转基因动物生产的“限速步骤”，目前体细胞克隆技术也有很多有待完善的地方，如克隆胎儿怀孕率低、易流产、出生后健康状况不好等，导致克隆技术效率低下，平均不到10%的克隆胚胎会产生一个活的后代。核移植技术的常规化需要在众多方面加以改进，特别是针对围产期胚胎死亡和细胞体外长期培养对克隆胚胎造成的不利影响。

3) 精子载体法

该方法实验的重复性很差，且DNA 整合进基因组后，基因重排现象严重。然而，最近有研究显示，通过体外受精或人工授精的方法，目的DNA 与抗精子表面蛋白的抗体结合，能有效进入受精卵中，这个方法目前已经成功地生产出转基因小鼠与猪，外源基因以这种途径进入动物体内整合效率高，没有基因重排现象，能表达且能传递给子代．这种方法似乎又给精子作为载体的转基因方法带来的曙光。

4) 逆转录病毒法

将外源基因替换病毒基因组的gag，pol 和env 等基因，通过顺

式元件的调控序列和感染成分重组病毒载体，然后注射到第二次减数分裂中期的卵母细胞，体外受精和筛选后，将胚胎移人假孕母体的子宫内，继续发育成转基因动物。该方法整合稳定，拷贝数和插入位

点相对固定，转基因效率高。然而转录病毒载体容量有限，只能转

移小于10kb 片段的DNA，而且基因是随机插入的，由于多处整合而产生嵌合体; 虽然设计时缺失复制功能序列，但复制大量载体所需的辅助病毒基因组也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，有可能产生辅助病毒株，从而产生生物安全性问题。

5) 电穿孔法

电穿孔法是在外界高电压短脉冲的作用下改变了细胞膜的结构，使细胞膜产生可逆性电穿孔，使得外源DNA 通过细胞膜进入细胞，然后将经过筛选的转基因细胞用显徽注射法，注入去核的卵母细胞的卵周隙，施加电脉冲使供体核与去核卵母细胞融合，获得转基因重构胚。再

经过电激活或化学激活，使重构胚胎发育，然后在体外或通过中间受体使其发育到囊胚，最后将胚胎移植到同期发情处理的受体中，适于转染多种细胞。

6) 脂质体法

通过脂质体包埋、介导，将外源基因转染到培养的体细胞，然后将此细胞与去核卵母细胞融合，融合的重构胚胎经电激活后在体外培养至囊胚，移入受体动物，最终获得转基因个体。脂质体法产生个体