乳腺生物反应器教学提纲

转基因动物的成活率低
在目的基因的分离和改造，乳腺特异 表达载体的构建及转基因技术的关键性技 术上存在缺陷，无法保证对基因的定点整 合，因此转基因动物常会出现繁殖力下降、 胚胎早期死亡等各种生理及病理缺陷 。
安全性
动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修 饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统 可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白 质水解等问题。 此外乳汁中可能含有的微生物及 不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大 的威胁，所以在分离过程中要去除所有可能引起 人类变态反应的蛋白质，同时对含量低的产物加 以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功能和理化 特性相同的产品。 另外，要防止把动物性疾病传 染给人。
2005年，国家 “863”计划组利用转基因体细胞克隆技术 ， 分别获得了 转人乳铁蛋白、转人溶菌酶、转乳清白蛋白 等转人基因 蛋白，其中人乳 铁蛋白和人α-乳清白蛋白是 国际上首次 利用转基因克隆牛而获得的。 虽然我国在该 项技术上取得了较大进展，但还处于探索阶段，与国外还 有一定的差距。 自国家“863”计划对 “动物乳腺生物反 应器应用研究”立项后，逐步受到有关部门和企业界的重 视，研究和开发的力度加 强，前景非常乐观。
1991年，Brem等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔，表达 水平达到1～10g/L。
1992年，Ve-lande：等报道了乳腺表达人C蛋白的转基因猪， 表达水平达到1g/L以上。
目前，从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶 Ⅲ和人C蛋白等基因工程产品已进入临床试验阶段，并已初 步形成以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业。
乳腺生物反应器的研究进展
国外研究进展
20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想
1987年，Gordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织 纤溶酶原激活剂(tPA)基因。
1991年，WrightG等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基 因绵羊，表达水平高达35g/L，在世界范围内引起了极大的 轰动。
步骤
转基因动物生产红细胞生成素（ EPO ）
将EPO DNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，回 收5.4kb的HindⅢ/BamHI片段，插入pGEM7zf(+)载体，再将867bp的BLG启动子插入EPO 基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体 pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通过显微注射方法得 到转基因小鼠，其乳腺中的EPO含量可达 0.5μg/ml。
根据目的蛋白表 达部位的不同可
分为乳腺生物反 应器、血 液生物
反 应 器 、卵 生 物 反 应 器 、尿 生 物 反 应器、精 囊腺生物反应器、 唾液腺生物反应 器等。
乳腺生物反应器的原理及步骤 乳腺生物反应器的研究进展 乳腺生物反应器的优点及其应用 乳腺生物反应器的存在的问题
乳腺生物反应器的原理及步骤
蛋白药物。重组人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性 ，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失 症有显著效果。
2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额达 到350 亿美元，生产的药物将占整个基因工程药 物种类的90%以上。
乳腺生物反应器的存在的问题
目的基因在动物基因中的整合问题
由于目的基因在动物基因中的整合是 随机的，因此包括整合位点、整合的拷贝 数等机制还不清楚。所以易发生调节失控、 遗传不稳定、表达率不高等问题。
生物活性与天然蛋白几乎完全一样,极易提纯。
应用
组织纤溶酶原激活剂(TPA)：由美国遗传技术公司开发的
血栓溶解剂，1987 年11月经联邦食品及药物管理局(FDA) 批准上市。1988年的销售额为1.5～1.6亿美元，1989年为 1.8～1.9亿美元。今后每年的市场销售额约为2～2.5亿美 元。
重组人抗凝血酶ii:世界上第一个动物乳腺生物反映器重组
国内研究进展
20世纪80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反应器的构 想 ，并成功获得表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔 ，为 我国通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础。
1995年，我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因；
1996年10月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的 能在乳腺中表达人凝血因子Ⅳ的转基因羊。
乳腺生物反应器的优点及其应用
➢表达产物能充分修饰且具有稳定wenku.baidu.com生物活性
利用DNA重组技术的微生物来生产的药用蛋白,由 于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工, 因 而生物活性低, 并且具有免疫原性。
➢产品成本低,可以大规模生产
药物其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术 的100倍
➢产品质量高,易提纯
原理:
应用重组 DNA技术和转基因技术，将目的基 因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎 移植得到转基因乳腺表达多肽药物、工业酶、疫 苗和抗体等蛋白的技术。
外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因 的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期 乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置 于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中 表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。
动物乳腺生物反应器
转基因动物技术
转基因动物最诱人的前景是
作为生物反应器，利用它生
产人类所需要的生物活性产 品或药物，其常用方法是把 目的基因在血液循环系统、 唾液腺或乳腺等器官或组织 中表达，从而获得人类需要 的目的产物。
加快家畜品种的改良 速度，提高肉、奶、 蛋的产量和品质，生 产珍贵的药用蛋白,为 大量患者造福。