最新lab3双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株应用教学讲义ppt
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抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
生化大实验双向琼脂免疫扩散
五 注意事项
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
2用已知抗血清或抗原检测未知抗原或抗双向免疫扩散常见孔型有三孔型双孔型双排孔型梅花孔型见图1双向免疫琼脂扩散孔型双向免疫琼脂扩散孔型三孔型双孔型梅花孔型双排孔型双排孔型1
纯度检测方法二：
双向免疫扩散试验
一实验目的
学习双向免疫扩散实验原理 掌握双向免疫扩散实验操作方法
基本概念
抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体 产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生 免疫效应（特异性反应）的物质。 抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗 原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产 生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
双向琼脂扩散试验课件
进行相关检测和分析。
02 试验材料与设备
试验材料
抗原和抗体
琼脂糖凝胶
硝酸纤维素膜
缓冲液
根据试验目的选择相应 的抗原和抗体，确保其
质量和纯度。
用于制备凝胶板，选择 适当规格的琼脂糖凝胶，
确保其质量和纯度。
用于固定抗原和抗体， 选择适当规格的硝酸纤
维素膜。
用于调节抗原和抗体溶 液的pH值，选择适当的
行操作。
结果直观
试验结果以抑菌圈的形式呈现，直 观易懂，便于观察和比较。
成本较低
该方法所需材料和试剂相对便宜， 降低了检测成本。
缺点
准确性不足
由于受多种因素影响，如菌种类 型、培养基成分、扩散时间等， 该方法的准确性有时难以保证。
灵敏度不高
对于低浓度的目标物质，该方法 的检测限相对较高，可能会漏检。
原或抗体。
确定抗原与抗体的浓度
02
沉淀线的清晰度和长度可以反映抗原或抗体的浓度，越清晰、
越长的沉淀线表明浓度越高。
确定抗原与抗体的特异性
03
如果不同抗原与抗体之间出现交叉反应，可以通过比较沉淀线
的位置和形状，判断抗原与抗体的特异性。
结果应用与注意事项
结果应用
双向琼脂扩散试验常用于检测体液中的微量蛋白质，如免疫球蛋白、补体、循环 抗原等，也可用于检测与免疫有关的疾病。
试验的应用领域
临床诊断
用于检测和诊断各种感染性疾 病、自身免疫性疾病等，如风 湿性心脏病、系统性红斑狼疮
等。
免疫学研究
用于研究抗原抗体的反应机制 、免疫复合物的形成等，为免 疫学理论提供实验依据。
生物制品检测
用于检测疫苗效价、血液制品 的免疫效果等，确保生物制品 的质量和安全。
02 试验材料与设备
试验材料
抗原和抗体
琼脂糖凝胶
硝酸纤维素膜
缓冲液
根据试验目的选择相应 的抗原和抗体，确保其
质量和纯度。
用于制备凝胶板，选择 适当规格的琼脂糖凝胶，
确保其质量和纯度。
用于固定抗原和抗体， 选择适当规格的硝酸纤
维素膜。
用于调节抗原和抗体溶 液的pH值，选择适当的
行操作。
结果直观
试验结果以抑菌圈的形式呈现，直 观易懂，便于观察和比较。
成本较低
该方法所需材料和试剂相对便宜， 降低了检测成本。
缺点
准确性不足
由于受多种因素影响，如菌种类 型、培养基成分、扩散时间等， 该方法的准确性有时难以保证。
灵敏度不高
对于低浓度的目标物质，该方法 的检测限相对较高，可能会漏检。
原或抗体。
确定抗原与抗体的浓度
02
沉淀线的清晰度和长度可以反映抗原或抗体的浓度，越清晰、
越长的沉淀线表明浓度越高。
确定抗原与抗体的特异性
03
如果不同抗原与抗体之间出现交叉反应，可以通过比较沉淀线
的位置和形状，判断抗原与抗体的特异性。
结果应用与注意事项
结果应用
双向琼脂扩散试验常用于检测体液中的微量蛋白质，如免疫球蛋白、补体、循环 抗原等，也可用于检测与免疫有关的疾病。
试验的应用领域
临床诊断
用于检测和诊断各种感染性疾 病、自身免疫性疾病等，如风 湿性心脏病、系统性红斑狼疮
等。
免疫学研究
用于研究抗原抗体的反应机制 、免疫复合物的形成等，为免 疫学理论提供实验依据。
生物制品检测
用于检测疫苗效价、血液制品 的免疫效果等，确保生物制品 的质量和安全。
《双向琼脂扩散试》课件
缺点
影响因素多
双向琼脂扩散试验的结果受到多种因 素的影响，如抗原和抗体的质量、浓 度、扩散速度等，可能导致试验结果 的差异。
试验周期较长
由于抗原和抗体需要在琼脂凝胶中扩 散，因此试验的完成需要一定的时间 。对于快速检测的需求，双向琼脂扩 散试验可能不是最佳选择。
灵敏度与特异性难以平衡
在提高试验的灵敏度的同时，可能会 牺牲部分特异性；反之亦然。因此， 在实际应用中需要权衡灵敏度和特异 性之间的平衡。
主观性较强
试验结果的判断依赖于操作者的主观 观察，因此结果的准确性和可靠性可 能受到操作人员经验和技术水平的影 响。
05
双向琼脂扩散试验的改进与发 展趋势
改进方法与技术
01
02
03
04
优化试验条件
通过调整温度、pH值、离子 强度等参数，提高试验的稳定
性和准确性。
自动化与智能化
引入自动化设备和技术，实现 试验过程的自动化和智能化，
优点
操作简便
灵敏度高
双向琼脂扩散试验是一种经典的血清学检 测方法，操作简便，易于在实验室或临床 环境中实施。
该试验对微量抗原和抗体具有较强的检测 能力，能够检测出低浓度的抗原或抗体。
特异性好
结果直观
由于采用琼脂凝胶作为载体，抗原和抗体 在凝胶中扩散，形成浓度梯度，从而达到 高度特异性识别的效果。
试验结果可以通过观察凝胶上的沉淀线来 直接判断，无需复杂的仪器设备。
食品中病原菌检测
通过双向琼脂扩散试验，可以检测食品中是否存在某些病原菌， 确保食品安全。
食品添加剂检测
该试验也可用于检测食品中是否含有超标的食品添加剂，如防腐剂 、色素等。
食品过敏原检测
药物微生物筛选-图文
药物微生物筛选_图文.ppt
主要内容
药物微生物筛选的主要 途径 药物微生物筛选的方法
目的
扩展抗菌谱 增强抗菌活性 克服耐药性 改善药物动力学性能
饱浸含某种指 示剂的固体培 养基的滤纸片 变色圈
固体培养基渗入溶解 待筛选的菌株 性差，可被特定菌利 能分泌产生某 用的营养成分，造成 些能抑制工具 不透明的培养基背景。 菌生长的物质 菌落利用此物质形成
指示剂直接掺入或透明圈。 喷洒固体培养基， 利用一些有特别营养要求的微生物 菌落周围形变色圈。作为工具菌，待筛选菌具有该营养
物的前体转化成营养物能力，工具
菌就能围绕该菌生长。
主要内容
药物微生物筛选的主要 途径 药物微生物筛选的方法
目的
扩展抗菌谱 增强抗菌活性 克服耐药性 改善药物动力学性能
饱浸含某种指 示剂的固体培 养基的滤纸片 变色圈
固体培养基渗入溶解 待筛选的菌株 性差，可被特定菌利 能分泌产生某 用的营养成分，造成 些能抑制工具 不透明的培养基背景。 菌生长的物质 菌落利用此物质形成
指示剂直接掺入或透明圈。 喷洒固体培养基， 利用一些有特别营养要求的微生物 菌落周围形变色圈。作为工具菌，待筛选菌具有该营养
物的前体转化成营养物能力，工具
菌就能围绕该菌生长。
生化大实验双向琼脂免疫扩散
可用于大量样本检测
通过优化实验条件，可以同时进行多个样本的检测。
实验优缺点分析
实验周期较长
需要等待蛋白质在琼脂 中扩散，时间较长。
影响因素较多
实验结果受多种因素影 响，如温度、湿度、pH 值等。
定量分析不准确
由于扩散的非均一性和 不稳定性，定量分析不 够准确。
未来研究方向与展望
改进实验方法
进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和特异 性。
加样
将抗原或抗体溶液加入到相应的孔中，并让其扩 散。
加入抗体或抗原
将抗体或抗原溶液加入到凝胶板的另一侧的孔中， 让其扩散。
显色反应
观察凝胶板上是否出现沉淀线，如果出现则说明 抗原和抗体发生了反应。
结果分析
根据沉淀线的位置和清晰度，分析实验结果。
02
生化大实验双向琼脂免疫扩散的应 用
在医学诊断中的应用
应用拓展
将双向琼脂免疫扩散技术应用于更多领域，如疾 病诊断、药物研发等。
技术创新
结合其他技术手段，如纳米技术、生物信息学等， 创新发展新的蛋白质检测方法。
感谢您的观看
THANKS
严格按照实验步骤进行操作， 避免操作失误或遗漏。
注意观察实验过程中出现的异 常情况，如气泡、沉淀等，及 时处理并记录。
在实验过程中保持恒温，避免 温度波动对实验结果的影响。
实验后的处理和结果分析
清洗并整理实验器材，确保实验室整洁。
对实验结果进行记录和分析，确保数据的准确性 和可靠性。
根据实验结果进行总结和归纳，得出结论，为后 续研究提供参考和依据。
食品添加剂和污染物检测
检测食品中的添加剂和污染物，确保食品的质量和安全性。
03
实验操作注意事项
通过优化实验条件，可以同时进行多个样本的检测。
实验优缺点分析
实验周期较长
需要等待蛋白质在琼脂 中扩散，时间较长。
影响因素较多
实验结果受多种因素影 响，如温度、湿度、pH 值等。
定量分析不准确
由于扩散的非均一性和 不稳定性，定量分析不 够准确。
未来研究方向与展望
改进实验方法
进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和特异 性。
加样
将抗原或抗体溶液加入到相应的孔中，并让其扩 散。
加入抗体或抗原
将抗体或抗原溶液加入到凝胶板的另一侧的孔中， 让其扩散。
显色反应
观察凝胶板上是否出现沉淀线，如果出现则说明 抗原和抗体发生了反应。
结果分析
根据沉淀线的位置和清晰度，分析实验结果。
02
生化大实验双向琼脂免疫扩散的应 用
在医学诊断中的应用
应用拓展
将双向琼脂免疫扩散技术应用于更多领域，如疾 病诊断、药物研发等。
技术创新
结合其他技术手段，如纳米技术、生物信息学等， 创新发展新的蛋白质检测方法。
感谢您的观看
THANKS
严格按照实验步骤进行操作， 避免操作失误或遗漏。
注意观察实验过程中出现的异 常情况，如气泡、沉淀等，及 时处理并记录。
在实验过程中保持恒温，避免 温度波动对实验结果的影响。
实验后的处理和结果分析
清洗并整理实验器材，确保实验室整洁。
对实验结果进行记录和分析，确保数据的准确性 和可靠性。
根据实验结果进行总结和归纳，得出结论，为后 续研究提供参考和依据。
食品添加剂和污染物检测
检测食品中的添加剂和污染物，确保食品的质量和安全性。
03
实验操作注意事项
药敏试验(扩散法)操作方法课件
药敏试验(扩散法)操作方法
21
1、纸片琼脂扩散法（3/3）
3、培养观 察
将平 皿培养基 置于37℃ 温箱中倒 置培养24 小时后， 观察效果
药敏试验(扩散法)操作方法
22
2、牛津杯法
第一步同“纸片法”细菌涂抹平板。 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、
高10 nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、 瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接 触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可 放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数 量的各种药液，勿使其外溢。
药敏试验(扩散法)操作方法
12
药液的制备（用于商品药的试验）：
按兽药说明书(或标签)上标明的治疗量的10-20倍比例配制药液。 如某药品：100g兑水100kg，表明该药治疗量为1g兑水1L，配制 药液时就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g药品，即为配制药敏 片所用的药液浓度。
抗菌药的稀释剂通常用纯化水。
药敏试验(扩散法)操作方法
16
4、其他用品
药敏试验(扩散法)操作方法
17
四、药敏试验操作步骤：
一步法：用病料直接在平板上进行涂抹后贴药敏 片，培养后观察。
二步法：先进行细菌的增值培养后，再取培养菌 进行平板药敏试验。（纸片法、牛津杯法、打孔 法）
药敏试验(扩散法)操作方法
18
细菌增值培养：
用法：称取本品18.0g,加热溶解于 1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或试 药敏试管验,(1扩21散℃法高)操压作灭方法菌15分钟备用。
MH肉汤 （¥100）、
MH琼脂 （¥250） ；
营养肉汤 （¥60） 、 营养琼脂 （¥80）均 可以生化试 剂店买到。
抗菌药物药敏试验PPT课件
பைடு நூலகம்
注意事项
1. 接种时均匀密涂
2. 贴片时，用无菌镊子轻轻触压药物纸片使之 与培养基充分接触
3. 贴片后不能再更改纸片位置
4. 镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继 续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不 同抗生素交叉影响
5. 整个贴片过程应在15- min内完成
12
-
3
试验程序
-
4
材料
❖ 普通平皿培养基,大肠杆菌菌液,葡萄球菌菌液。 ❖ 抗生素药敏纸片（直径5mm，青霉素，链霉
素、氯霉素、庆大霉素、 四环素） ❖ 无菌镊子、无菌棉签 、量尺
-
5
方法
❖取琼脂平皿培养基两个，分别在 其底部中央位置标注“大肠杆菌” 和“葡萄球菌”字样，同步进行 如下操作。
-
6
抗菌药物药敏试验 纸片扩散法
实验目的和要求
❖ 掌握纸片扩散法的原理、操作方法及结 果判读
❖ 了解药物敏感试验的方法和实际意义
-
2
原理
❖ 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂 平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解 后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度 梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被 抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试 菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最 低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈 小。
注意事项
1. 接种时均匀密涂
2. 贴片时，用无菌镊子轻轻触压药物纸片使之 与培养基充分接触
3. 贴片后不能再更改纸片位置
4. 镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继 续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不 同抗生素交叉影响
5. 整个贴片过程应在15- min内完成
12
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3
试验程序
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4
材料
❖ 普通平皿培养基,大肠杆菌菌液,葡萄球菌菌液。 ❖ 抗生素药敏纸片（直径5mm，青霉素，链霉
素、氯霉素、庆大霉素、 四环素） ❖ 无菌镊子、无菌棉签 、量尺
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5
方法
❖取琼脂平皿培养基两个，分别在 其底部中央位置标注“大肠杆菌” 和“葡萄球菌”字样，同步进行 如下操作。
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6
抗菌药物药敏试验 纸片扩散法
实验目的和要求
❖ 掌握纸片扩散法的原理、操作方法及结 果判读
❖ 了解药物敏感试验的方法和实际意义
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2
原理
❖ 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂 平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解 后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度 梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被 抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试 菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最 低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈 小。
琼脂扩散实验 PPT
花孔型
单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。 将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝 固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入 抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会 向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h －48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓 度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本 中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫 球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
A1：待检抗原；A2：标准抗原
免疫学及免疫学检验
抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。
实验
材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体
操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理
琼脂扩散试验
一、实验目的
学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在 二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下， 可形成肉眼可见的沉淀物的反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自பைடு நூலகம்扩 散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物 分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可 见的带状或线状沉淀带。
盘中，37℃自由扩散24h～48h。
结果判定
．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中 心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻 孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原； 若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇； 若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。 将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝 固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入 抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会 向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h －48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓 度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本 中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫 球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
A1：待检抗原；A2：标准抗原
免疫学及免疫学检验
抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。
实验
材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体
操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理
琼脂扩散试验
一、实验目的
学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在 二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下， 可形成肉眼可见的沉淀物的反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自பைடு நூலகம்扩 散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物 分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可 见的带状或线状沉淀带。
盘中，37℃自由扩散24h～48h。
结果判定
．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中 心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻 孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原； 若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇； 若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
高级药理学体外抗菌活性试验ppt课件
菌
用无菌胶头滴管往每个牛律杯中 分别加入稀释为50倍和100倍的
活
1280µg/mL待检药品溶液，注意
性
要做到“满而不溢”。盖上陶瓦 盖放入托盘中，小心地移至培养
试
箱，37℃培养24h。用游标卡尺精
验
确测量各个抑菌圈直径（精确到 0.01mm）。
体 二、扩散法
外
抗
结果判定
菌
抑菌圈直径均值：
活
＞20mm为高敏药物
试 将检品管同样求出平均值，根据
验
标准曲线即可求出被检品的效价。
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
验
示。带入曲线方程可得对应的 MIC。
体
三、比浊法
外
2. 步骤
抗
将标准药液稀释成不同稀释度 1:10,1:15,1:20,1:30,1:40。然后于
菌
大小相同的试管内加入8.8mL肉
活 性
汤培养基，同时接种试验菌液 0.2mL。取上述已稀释好的标准 稀释液1mL加入肉汤菌液试管中。
试
此时的稀释倍数为
性
19mm～15mm为中敏药物
试
15mm～10mm为轻敏药物
验
＜10mm为抗药（不敏感）
体 三、比浊法
外 1. 原理
抗 细菌生长的浑浊度可以用透光度
菌
表示，则log透光度与一定范围内 的抗菌药的剂量呈直线关系，可
活
以制得标准曲线。
性 同样，被测药物所引起的抑制细
试
菌生长程度也可以用log透光度表
菌液，混匀盖塞后，37℃培养16~18h，
观察。相同过程重复三次。
附：琼脂平板为无菌检查；14管为培养
lab-3双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株
三 材料与器材
菌种：链霉菌, 枯草杆菌，大肠杆菌. 培养基：高氏1号培养基，牛肉膏蛋白胨 培养基. 培养皿，移液管等.
四 实验步骤
（1）倒平板：在无菌培养皿中，倒入高氏一号培养基， 凝固后待用。 （2）接种：用接种环挑取供测菌，在平板上涂抹成直径 约0.3cm的接种点，每个平板接种4~6点。倒置，28℃ 培养7天。 （3）覆盖指示菌：取熔解并冷却至约55 ℃的牛肉膏蛋白 胨培养基，加入枯草杆菌或大肠杆菌的菌悬液，摇匀， 终浓度约为106细胞/ml。在接种链霉菌7d后的平板上， 倒入含指示菌的牛肉膏蛋白胨培养基，每皿10~12ml， 凝固后30 ℃或37 ℃培养24 h。 （4）抑菌圈大小测定：测量抑菌圈和菌落直径，根据抑 菌圈和菌落直径比值（Di/Dc)检出活性菌株，比值大 一般抗菌活性较强。
实验三 双层琼脂扩散法筛选放线菌活性菌株的
一 教学要求
（1）学习抗菌活性菌株的筛选方法。 （2）掌握双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌 株的操作方法。
二 实验原理
抗菌活性菌株是指那些在生长过程中能够产生抑菌 或杀菌活性物质的微生物，通常利用抗生素测定的方 法给予检出。抗菌抗生素的测定主要有稀释法、比浊 法和扩散法。扩散法是利用药物在琼脂中扩散使其周 围的指示菌生长受到抑制而形成抑菌圈，根据抑菌圈 的大小来判断抗菌活性。扩散法包括了纸片法、管碟 法、点滴法等多种方法。本实验采用的双层琼脂扩散 法是一种抗菌活性菌株快速简便的初步筛选方，既直 接在琼脂培养基上培养供测菌，产生的抗生素在琼脂 中扩散，加入指示菌后测量抑菌圈直径和菌落直径比 值（Di/Dc)，根据比值的大小检出活性菌株。
五 注意事项
（液时的温度不能太高， 以免杀死指示菌。温度也不能太低，以 免指示菌覆盖不均
六 思考题
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解剖
下咽亦称喉咽。位于喉的后方，会厌上缘至 环状软骨下缘平面之间，相当于第三至第六 颈椎。其上分较宽，下分较窄。
上与口咽相连，下与食管相接。分为三个区 域：梨状窝区、环后区和咽后壁区。
下咽分为三部份：梨状窝、咽后壁和环后区 梨状窝 会厌咽皱襞和三个壁（前壁、内侧壁、
外侧壁） 咽后壁 会厌溪的底部至环状软骨下缘
术后放疗或术前化疗＋手术＋术后放疗。但对于有远 处转移者则以化疗为主。 化疗对下咽癌的治疗效果尚不明确。
肿瘤部位 分期
Hale Waihona Puke 治疗策略T1和T2
单纯放疗（65~70Gy）或部分喉切除+同侧 淋巴结清扫 （根据术后病理考虑放疗）
梨
T3和T4（可切除） 全喉切除+同侧淋巴结清扫和术后放疗
状
不能切除或
窝
内科原因不
lab3双层琼脂扩散法筛选抗菌 活性菌株应用
二 实验原理
抗菌活性菌株是指那些在生长过程中能够产生抑菌 或杀菌活性物质的微生物，通常利用抗生素测定的方 法给予检出。抗菌抗生素的测定主要有稀释法、比浊 法和扩散法。扩散法是利用药物在琼脂中扩散使其周 围的指示菌生长受到抑制而形成抑菌圈，根据抑菌圈 的大小来判断抗菌活性。扩散法包括了纸片法、管碟 法、点滴法等多种方法。本实验采用的双层琼脂扩散 法是一种抗菌活性菌株快速简便的初步筛选方，既直 接在琼脂培养基上培养供测菌，产生的抗生素在琼脂 中扩散，加入指示菌后测量抑菌圈直径和菌落直径比 值（Di/Dc)，根据比值的大小检出活性菌株。
三 材料与器材
菌种：链霉菌, 枯草杆菌，大肠杆菌. 培养基：高氏1号培养基，牛肉膏蛋白胨
培养基. 培养皿，移液管等.
下咽癌(hypopharyngeal carcinoma)
下咽癌的定义 发病率 致病因素 治疗原则 预后
概述
发病率
下咽癌约占头颈部恶性肿瘤的0.8%~1.5% 梨状窝60%~70% 咽后壁25%~30% 环后区5%~10%
能手术
单纯放疗（70~75Gy）或同时放化疗
淋巴结固定
咽
T1 、T2
壁
T3 、T4
术前放疗（45~50Gy）
单纯放疗（65~70Gy） 放疗加手术综合治疗
环 后
T2、 T3、T4
手术切除+辅助放疗（65~70Gy），无最佳治 疗；可切除者行手术+术后放疗；不能切除者
区
行单纯放疗
手术治疗
如准备行手术治疗，首先考虑功能的保留， 保守手术的禁忌症包括：跨声带病变；软骨受侵；
治疗原则
治疗原则是提高肿瘤的局部控制率，降低喉咽器官功 能损伤的程度，尽可能地保持喉咽及喉的正常生理功 能。可根据临床分期选择最佳治疗模式。
临床资料表明，早期下咽癌手术与单纯放疗疗效相似， 而单纯放疗可以保存喉咽的功能。因此，对Ⅰ期应首 选单纯根治性放疗。
对Ⅱ/Ⅲ期者可以选择手术＋术后放疗。 对没有远处转移的Ⅳ期患者可选用术前放疗＋手术＋
影像学检查
X线检查
CT/MRI：CT/MRI由于具有较好的软组 织分辨能力，有助于发现下咽癌原发灶 及其侵犯的范围、颈淋巴结转移的部位。 通过MRI的横断面、冠状面及矢状面扫 面，可以更准确了解肿瘤侵犯下咽的邻 近部位及颈淋巴结转移的情况，有助于 临床TNM分期。
鉴别诊断
由于下咽癌的临床症状与喉咽的一些良性病 变症状极为相似，临床需要与喉咽部炎症以 及良性肿瘤鉴别，包括血管瘤、平滑肌瘤、 脂肪瘤和纤维肉瘤等。对于隐匿型的下咽癌 早期出现颈淋巴结转移时，需要与慢性淋巴 结炎以及颈淋巴结结核鉴别。
环后区 即环状软骨后缘的区域
淋巴引流
丰富 最常见部位（同侧、对侧） 与T分期无关 75%的患者出现淋巴结转移
病理及生物学行为
病理类型 生长方式 生物学行为
梨状窝癌：具有早期黏膜下浸润性生长的特 点，实际病变范围超过肉眼所见
咽后壁区癌：通常分化最低。 环后区癌：分化程度较高。
临床表现
症状
咽部异物感：常为首发症状 吞咽疼痛 咳嗽或呛咳 吞咽困难 声音嘶哑
M 远处转移
Mx：有无远处转移不能确定 M0：无远处转移 M1：有远处转移
临床分期
0期 Ⅰ期 Ⅱ期 Ⅲ期 ⅣA 期 ⅣB 期 ⅣC 期
TisN0M0 T1N0M0 T2N0M0 T3N0M0 T4aN0-1M0 T4bN0-3M0 T1-4N0-3M1
T1-3N1M0 T1-4aN2M0 T1-4N3M0
UICC/AJCC2002年TNM临床分期
T 原发肿瘤
T1：肿瘤局限于下咽的一个解剖部位，且肿瘤的最大直径 ≤2cm
T2：肿瘤侵犯下咽部一个以上解剖部位或邻近组织，或肿 瘤的最大直径≤2cm，而<4cm，不伴半喉固定
T3：肿瘤最大直径>4cm，或伴半喉固定 T4a：肿瘤侵犯甲状软骨/环状软骨、舌骨、甲状腺、食管
体征
喉外形改变 下咽部肿物：临床可通过间接喉镜
检查发现。 颈部肿块
诊 断（ENT）
下咽癌早期诊断较困难，由于下咽的解剖部位隐蔽， 早期癌的临床症状一般不典型。患者就诊时主诉吞咽 困难、吞咽疼痛，声嘶等症状通常已属晚期。 临床特点与喉咽检查：原发部位不同而症状表现各 异。间接喉镜或电子喉镜检查可了解肿瘤的部位。 颈淋巴结检查 影像学检查 病理活检：明确诊断
或中央隔软组织 T4b：肿瘤侵犯椎前筋膜，保绕颈动脉，或累及纵隔结构
UICC/AJCC2002年TNM临床分期
N 区域淋巴结
Nx：区域淋巴结情况不能评价 N0：无区域淋巴结转移 N1：同侧单个淋巴结转移，最大直径≤3cm N2：同侧单个淋巴结转移，最大径>3cm，但≤6cm，或同
侧多个淋巴结转移，最大径均≤6cm；或双侧/对侧淋 巴结转移，但其最大径均≤6cm N2a：同侧单个淋巴结转移，最大径>3cm但≤6cm N2b：同侧多个淋巴结转移，最大径均≤6cm N2c：双侧/对侧淋巴结转移，最大径均≤6cm N3：转移淋巴结的最大直径>6cm
声带麻痹；梨状窝底受侵；环后区浸润；喉结构之外侵犯
所有的患者至少应行同侧淋巴结清扫，几乎 所有的应行术后放疗
无保守手术指征的患者可行全喉下咽切除和 部分下咽切除+颈淋巴结清扫，然后行重建
环后区癌对放疗不敏感，通常行全喉咽切除