PCR扩增检测转基因大豆(精)

180 bp
外源基因
CP4 EPSPS
320 bp
外源基因
主要试剂
Taq DNA polymerase
引物对：1μmol/L 底物：10mMdNTP PCR缓冲液 ddH2O
主要实验器材
PCR主要操作步骤

标源自文库试管
加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶） 设立PCR循环程序，进行扩增
标记PCR反应管
外源基因( EPSPS)特异性扩增 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2
外源终止子(NOS) 特异性扩增
外源启动子(CaMV35S)特 异性扩增 3~7 非转基因大豆、玉米
1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米
PCR假阳性结果 1． 引物设计不当，应调换引物 2． 循环参数不合适，导致非特异性扩增 3． 靶序列的交叉污染 PCR假阴性结果 1． 模板问题 2． 试剂浓度不够 3． 标本中有Taq酶的抑制剂 4． PCR产物检测系统灵敏度不够
【实验步骤】
大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法

称取0.1g样品，在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液， 继续研磨充分后加入到1.5mL Ep管中；向EP管加入4μL RNaseA， 至于65℃水浴，过程中混匀3~5次，30min，12000r/min室温离心 10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24: 1)， 轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀)，室温静置5min，室温 12000r/min离心10min；重复加入氯仿异戊醇一到两次 (过程中如 上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水)；取上清于新的Ep管(千 万不要吸入下层液体 ) ，再加入等体积的 CTAB 沉淀液，轻缓颠 倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液， 加入400μL 1.2mol/L氯化钠溶解沉淀，56℃温浴15min，期间轻 摇 EP 管数次助溶；加入 800μL -20℃无水乙醇， -20℃静置 1h ， 15000 r/min室温离心10min；弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两 三次后，在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。
检测基因
大豆 Lectin
引物序列
p1：5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c3’ p2：5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg3’(54 ℃) p3：5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc3’ p4：5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc3’ (56℃) p5：5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’ p6：5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’ (54 ℃)
实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米
【实验目的】

通过 PCR 扩增方法检测市场常见大豆、玉米 产品是否含有转基因成分 培养学生的实验设计能力和创新能力

【实验原理】
以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin) 基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、 农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及 外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转 基因成分。
【实验步骤】 基因组DNA浓度和纯度的鉴定

取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中，用 Biophotometer分 析 DNA 的浓度，通过它对提取大豆 DNA 测 OD 值。并记 录数据。由 OD260nm/OD280nm 判定基因组 DNA 的浓度， 其比值在1.7~2.0之间较好，符合PCR检测要求。
【注意事项】
1 提取高质量的模板DNA是PCR成功的 决定因素之一
加入试剂
【实验步骤】

1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系：
反应物 dd H2O PCR缓冲液 （10×） dNTP （2.5mM each） 引物1 引物2 Taq DNA聚合酶 模板DNA 体积（μL） 37.5 5 4 1 1 0.5 1
反应管放入PCR仪

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 一种选择性体外扩增 DNA的方法，其基本原理类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 。 它 包 括 : 变 性 (Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基 本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上 每一轮循环将使目的 DNA扩增一倍，这些经合成 产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经 25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
扩增片段长度
118 bp
基因性质
内源基因
玉米 IVR
226 bp
内源基因
CaMV 35S
195 bp
外源基因
NOS
p7：5’-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3’ p8：5’-tta tcc tag ttt gcg cgg ta-3’ (54 ℃)
p9：5’-ctt ctg tgc tgt agc cac tga tgc-3’ p10：5’-cca cta tcc ttc gca aga ccc ttc c-3’ (56 ℃)
3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果

配制 0.8 ％琼脂糖凝胶，取 PCR 产物 5μL 加 1μL 点 样 液 混 合 后 点 入 上 样 孔 ， 于 120V电压电泳20~30min。电泳结束后， 用自动凝胶成像分析系统检测
M 1 2 3 4 5 6 7
M 1 234 5 6 7
内源基因(Lectin)特异性扩增 M 1 2 3 4 5 6 7
编辑程序进行扩增
PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。
2. 按下述程序进行PCR扩增:


1） 2） 3） 4） 5） 6） 7）
94℃ 预变性 3 min； 94℃ 变性 1 min； 54℃ ( 或者56℃ )退火 45 sec； 72℃ 延伸 1 min； 重复步骤2~4, 29次； 72℃ 延伸 10 min； End.