胚胎冻融的原理
胚胎冻融的原理
胚胎冻融的原理本文转载于兰州军区兰州总医院生殖医学中心：胚胎冻融的原理介绍很多人都不明白胚胎冻融的原理就是什么？所以在网上一直提问，就于这个问题，今天大编成给大家一起互动这个蒙蔽的答案，期望对存有疑惑的您有所帮忙，也期望能够协助您踏进疑惑！专家为我们讲解：利用冷冻技术将胚胎和配子从生理温度降至低温并贮存，需要时，再从低温状态解冻至生理温度。
为增加胚胎和配子对冻融过程的耐受，增加存活率，必须选择合适的物质作为冷冻保护剂。
专家谈至：胚胎相同与配子，所以须采用相同的冷藏保护剂和冷藏方法展开冷藏，但它们都就是活的细胞，对耐热冷藏与融化过程存有相近的机理，以下以胚胎为基准表明。
一、常用冷冻保护剂1.渗透性保护剂例如丙二醇（proh），二甲基亚砜（dmso），甘油（glycerol）等小分子化学物质，难扩散进细胞，也称作细胞内冷藏2.非渗透性保护剂包括单糖如葡萄糖、果糖，双糖如蔗糖、麦芽糖等，它们不能进入细胞，利用它增高细胞外溶液的渗透压而引起非特异保护作用，又称细胞外冷冻保护剂。
二、冷藏保护剂对胚胎的影响及机制（一）毒性作用为证明其毒性，将胚胎放在相同的冷藏保护剂一定时间，却不将其冻融，再继续观测胚胎的发育，辨认出在22℃时，逗留在proh的胚胎失活率为低于dm的，而在4℃时，曝露于此两种冷藏保护剂几乎未辨认出其对胚胎存有不良影响。
但经冻融过程后，存活率却显著上升，除其毒性促进作用外，引发冻融后胚胎失活的因素主要存有：（二）细胞内冰晶形成细胞的冷藏实际上就是一个水解过程，如果在资金投入液氮前胚胎能够充份水解，防止构成细胞内冰晶，就是胚胎冻融后能够存活的主要因素。
相信仔细看过以上讲解的您一定收益匪浅吧，希望我的分享能给您带来福音！。
胚胎冷冻原理
胚胎冷冻原理当科技进步到一定程度时，胚胎冷冻技术便应运而生。
胚胎冷冻是指将受精卵或初期胚胎置于低温环境下，储存起来，以便未来使用。
这项技术不仅帮助那些在生育时遭遇不孕不育的夫妇，更为科学界的发现提供了便捷的途径。
胚胎冷冻的整个过程可以分为以下几个步骤：第一步，收集和准备健康的卵子和精子。
在体外受精的过程中，取出卵子和精子，然后将它们培养在培养皿中，以促进受精卵的发育。
第二步，收集和冷冻受精卵。
将受精卵贴在培养皿上，按照标准程序进行操作。
在发育的早期，胚胎会被收集并放置在低温的液氮中，这会停止胚胎的发育，使其进入休眠状态。
第三步，储存和保护。
使用液氮条码系统来确保胚胎的标识和储存信息，以避免混淆和损失。
胚胎在常规下是能够存储5年，但在特定情况下或新技术和研究的发现，其保存时间或可延长。
胚胎冷冻可以帮助那些需要辅助生殖技术的夫妇。
例如，一些女性因年龄或疾病等原因而不能自然怀孕，或许可以将他们的受精卵冷冻下来，以备不时之需。
此外，对于那些必须接受放疗或化疗的患者，他们还可将备用胚胎存储在里面，用于将来他们生育孩子的可能性。
同时，胚胎冷冻也为科学研究提供了全新的方向。
有些科学研究无法在体外进行，因为某些特定的细胞只在某些发育阶段生存。
通过冷冻胚胎，科学家就可以拥有这些细胞并在适当的时间点解冻以进行研究。
然而，胚胎冷冻技术也存在一些争议，其中最主要的是胚胎的生命可形成。
有些人认为，在冷冻过程中，胚胎会被暴露在液氮所引发的极寒温度下，这可能导致损伤甚至死亡。
因此，他们反对这种技术并呼吁立即禁止它。
总之，虽然存在着一些争议，但胚胎冷冻技术仍是一项非常重要的科学技术。
它为那些需要帮助实现生育的夫妇提供了新的选择，并为科学研究提供了独特的途径。
我们需要继续关注这项技术的发展和应用，并逐步完善它。
胚胎冷冻保存资料
渗透型冷冻保护剂
属于细胞内冷冻保护剂，一般小分子物质，在0℃ 以上很容易通过细胞膜进入细胞质。 机理：在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞 内渗透出，减少了细胞内冰晶的形成；同时保护剂 与水分子形成氢键，降低了冻结部分的电解质浓度 从而减少了冷冻过程对细胞的损伤。 常见的渗透型冷冻保护剂有：甘油、二甲基要亚砜 （DMSO）、丙二醇和乙二醇等。
胚胎冷冻保存原理 胚胎冻存的损伤机制 抗冻保护剂 胚胎冷冻方法 人类胚胎冷冻案例
胚胎冷冻保存原理 冷冻保存,是将体外培养物悬浮在加有或小加 冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速度降 至零下某一温度，对其长期保存的过程。此 时细胞的代谢活动被完全抑制，使细胞的生 命在静比状态下保存来，从而达到长期保存 的目的。
非渗透型冷冻保护剂 属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质， 能够溶解于水，但不能进入细胞。 机理：非渗透型冷冻保护剂主要通过该改变 渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作 用。 常见的非渗透型冷冻保护剂包括：单糖（如 葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子 糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。
冷冻方法
胚胎冻存的损伤机制
胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程，冷冻保存的关 键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。正常 胚胎细胞内水分含量达80%以上，在冷冻过程中， 胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶， 一方而对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤，另 一方而导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高， 造成蛋自质变性即溶液损伤，二者最后都导致胚胎 小可逆性变化而死亡。
胚胎冻融原理及技术进展
② 预平衡液ES：以BS为基础液配制7.5%DMSO+7.5%EG ③玻璃化冷冻液VS：以BS为基础液配制15%DMSO+15%EG+0.5MSucrose
2.从原核到囊胚阶段胚胎的玻璃化冷冻
预平衡
玻璃化
囊胚冷冻前进行人工皱缩( 对滋养细胞层进行激光穿刺，使囊胚腔内液体流出，囊胚腔 塌陷，再进行冷冻减少冰晶的产生) 后再行冷冻。
Rienzi L, Gracia C, Maggiulli R, et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Hum Reprod Update. 2017 ;23(2):139-155.
保护剂毒性。 开放载体：交叉污染。
对细胞超微结构的影响：玻璃化冷冻时巨大 的渗透压变化及高浓度冷冻保护剂会引起滋 养细胞微绒毛数量的减少，对质膜、线粒体 和粗面内质网等细胞器都可能造成影响。 操作机械性损伤：人为技术熟练程度；激光 辅助也可能会因其热效应而影响胚胎发育。
六、胚胎解冻
4. 囊胚期细胞慢速冷冻流程
脱水程序
• 5%glycerol，10min； • 9%glycerol/0.2mol/L sucrose， 10min； • 装入含0.5ml 9%glycerol 0.2mol/L sucrose冷冻保护溶 液的冷冻管中。 • 上机。
胚胎冻融技术及其在我国肉羊产业中的应用
Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ Ｈｕ ｓ ｂ ａ ｎ ｄ ｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｅ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ
胚胎冻融技术及其在我国肉羊产业中的应用
特 日格 勒 － － ， 何 小龙 ， 王孟巍 ， 祁 云 霞 ， 刘永斌 ， 荣威 恒
（ １ ． 内蒙 古农 业 大 学 动 物 科 学 学 院 ， 内 蒙古 呼 和 浩 特 蒙 古 呼伦 贝 尔 市 畜牧 工 作 站 ， 内 蒙古 海拉尔区 ０ １ ０ ０ １ ８ ； ２ ． 内 蒙 古农 牧 业 科 学 院 ， 内蒙 古 呼和 浩 特 ０ １ ０ ０ ３ １ ； ３ ． 内 ０ ２ １ ０ ０ ８ ）
Ｔ ｅ ｒ ｉ ｇ ｅ ｌ ｅ 一 ， Ｈ Ｅ Ｘ ｉ ａ ｏ － ｌ ｏ ｎ ｆ， ＷＡ Ｎ Ｇ Ｍｅ ｎ ｇ － ｗ ｅ ｉ ， Ｑ Ｉ Ｙ ｕ ｎ － ｘ ｉ ａ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｙ ｏ ｉ － ｈ ｅ ｎ ｇ
关键词 ： 胚胎冻融技术 ； 胚 胎 移植 ； 肉羊
中图分类号 ： ￥ ８ ２ ６ ． ３ ６ 文 献标 识码 ： Ａ 文 章顺 序 编 号 ： １ ６ ７ ２ — ５ １ ９ ０ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ７ — ０ ０ ５ ３ — ０ ３
Ｅｍ ｂｒ ｙ ｏ Ｆｒ ｅ ｅ ｚ ｉ ｎ ｇ ａ ｎｄ Ｔｈ ａ ｗｉ ｎｇ Ｔｅ ｃ ｈ ｎｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｉ ｔ ｓ Ａｐ ｐｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ Ｍ ｕｔ ｔ ｏ ｎ Ｓ ｈｅ ｅ ｐ Ｉ ｎ ｄｕｓ ｔ ｒ ｙ ｉ ｎ Ｃｈｉ ｎａ
摘要 ： 胚 胎 冻 融 技 术 可使 胚 胎 移 植 不 受 时 间 、 地 点的限制 ， 从 而 达 到 提 高胚 胎 移 植 效 率 的 目的 ． 研 究 和 优 化
《胚胎冷冻保存》课件
准化和规范化。
THANKS
02
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存的方法
玻璃化冷冻
快速降温使胚胎进入玻璃化状态，减少冰晶形成。
程序化冷冻
慢速降温使胚胎逐渐结晶，适用于大多数胚胎类型。
显微操作
对胚胎进行显微操作，如显微切割或显微注射，以提高冷冻存活率。
冷冻保护剂的选择与使用
01
02
03
低温保护剂
选择适当的低温保护剂， 如二甲基亚砜（DMSO） 或乙二醇（EG），以保护 胚胎免受低温损伤。
技术挑战
04
胚胎冷冻保存过程中可能存在细胞损伤的风险 ，需要不断优化冷冻和解冻技术，提高胚胎存
活率。
胚胎科研中的冷冻保存
技术简介
胚胎科研中的冷冻保存 主要用于研究胚胎发育 的机制和过程，通过低 温生物学方法将胚胎在 液氮中长时间保存。
应用场景
主要应用于动物模型和 人类胚胎科研，为科研 人员提供实验材料和研
温度控制
严格控制冷冻和解冻过程 中的温度，以最大程度地 减少对胚胎的损伤。
冷冻保存的效果评估
存活率
遗传稳定性
解冻后评估胚胎的存活率，以确定冷 冻效果。
通过遗传学方法检测解冻后的胚胎是 否保持了正常的遗传物质。
发育能力
观察解冻后的胚胎是否能正常发育， 以评估其发育潜力。
03
胚胎冷冻保存的应用
辅助生殖技术中的胚胎冷冻保存
引入自动化和智能化技术，提高胚胎冷冻保存的效率和安全性。
胚胎冷冻保存技术的潜在应用领域
辅助生殖技术
为不孕不育夫妇提供冷冻保存胚 胎的服务，实现生育愿望。
动物繁殖
保护珍稀动物和濒危物种，通过 冷冻保存其胚胎实现种质资源的
牛囊胚两步法玻璃化冷冻管内解冻方法的优化及其原理初步分析
牛囊胚两步法玻璃化冷冻管内解冻方法的优化及其原理初步分析牛胚胎程序化冷冻已广泛应用于生产当中,冷冻程序较统一,技术相对成熟。
玻璃化冷冻是继程序化冷冻之后发明的一种简单高效的冷冻方法,细胞无需经历缓慢的程序化降温过程,在玻璃化液中短暂处理后直接投入液氮冷冻即可。
该方法不需要昂贵的程序化冷冻仪,操作省时,节约资金。
牛胚胎玻璃化冷冻虽有大量的研究报道,但冷冻方案多种多样,极不统一,较大程度上限制了该方法的推广。
首先,解冻程序不统一,研究者对分步解冻与一步解冻各执己见,没有提出明了的解析,让生产者无从参考：其次,细胞在玻璃化液中的处理时间不确定,预处理时间从1min至20min均有报道,玻璃化液中的处理时间从30s至3min均有采用。
处理时间范围如此宽泛,不便于生产者参考。
牛卵母细胞是研究抗冻保护剂渗透的理想半透膜模型,本研究以MII期牛卵母细胞为模型,从原理上分析了抗冻保护剂的添加与脱除之间的关系,以及处理时间与胞内抗冻保护剂浓度的关系。
并将结论用于优化牛囊胚两步法玻璃化冷冻和管内解冻,以期简化和统一牛胚胎玻璃化冷冻方法,为指导生产提供依据。
实验结果表明：(1)用蔗糖浓度较高的玻璃化液处理牛卵母细胞后可采用较低浓度的蔗糖溶液甚至DPBS脱毒。
实验3.1中,牛卵母细胞经过EG20(20%v/v乙二醇的DPBS溶液)预处理3min,分别移入ES1(40%v/v乙二醇+0.3M蔗糖的DPBS 溶液)或ES3(40%v/v乙二醇+0.8M蔗糖的DPBS溶液)中处理30s。
ES1组以DPBS、0.25M蔗糖、0.5M蔗糖脱毒后的存活率分别为3.33%、56.67%和76.67%；而ES3组脱毒后的存活率分别为56.67%、83.33%和96.67%。
(2)实验3.2中,牛囊胚经EG20预处理3min后,分别以EG40(40%v/v乙二醇的DPBS溶液)、ES1、ES2(40%v/v乙二醇+0.5M蔗糖的DPBS溶液)或ES3处理30s,均采用DPBS脱毒,脱毒后各组胚胎再扩张率分别为90.32%、93.33%、86.60%、75.00%。
冻融胚胎移植是怎么回事
冻融胚胎移植技术的发展是由于在促超排卵药物刺激下，一个周期一次采卵可获得多个卵子，体外受精成功后可获得多个早期胚胎，而胚胎移植一次不宜超过4个以避免多胎妊娠，剩下一些好的胚胎就不得不丢掉了。
如果多余胚胎可以冷冻储存，对于在刺激周期未获妊娠者，可于自然周期复温后再次移植，从而增加妊娠机会。
另外，为避免卵巢过度刺激综合征(OHSS )，本刺激周期不移植，冷冻储存胚胎备自然周期再移植。
冷冻和解冻需要特殊的方法和试剂，是科学家经过多次的科学实验总结出来的。
1972年科学家报道小鼠冻融胚胎妊娠成功，产出鼠仔。
1983年澳大利亚冻融入胚胎移植妊娠成功。
1985年英国用胚泡期胚胎冷冻后解冻移植妊娠成功并分娩。
目前，胚胎冻融技术已在世界各地展开，已诞生的冻融胚胎试管婴儿已有数百例。
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用
动物配子与胚胎冷冻保存是一种常用的生殖技术，其原理是通过使配子或胚胎处于极低温度下，阻止细胞代谢和生长，从而延长其生存时间。
这种技术应用广泛，可以在动物繁殖和保护中起到十分重要的作用。
动物配子冷冻保存的应用包括：
1. 繁殖方面：用于改良牲畜品种，保存珍稀物种的遗传资源等。
2. 医学方面：用于人类生殖医学，包括人类卵子、精子、胚胎等生殖细胞的冷冻保存，用于不孕不育等治疗。
3. 科研方面：动物配子冷冻保存还可以用于原位杂交、基因突变体的维护等科学研究。
动物胚胎冷冻保存的应用包括：
1. 增加繁殖率：胚胎冷冻保存可以增加繁殖率，提高种畜的生产效益。
2. 保护珍稀物种：野生动物保护中，胚胎冷冻可以保护珍稀物种，防止灭绝。
3. 医学研究：用于人类生殖医学，在不孕不育等疾病治疗上有很大的应用前景。
总之，动物配子和胚胎冷冻保存在人类生活、科学研究和动物保护中都有着重要的地位和应用前景。
哺乳动物胚胎冷冻保存综述
哺乳动物胚胎冷冻保存综述09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。
目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。
常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。
与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。
关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在-196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。
1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。
这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。
1.胚胎冷冻保存原理胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。
常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。
将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。
随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。
为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。
缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。
为什么胚胎在—196℃条件下保存不会死亡？
为什么胚胎在—196℃条件下保存不会死亡？1 问题提出人教版《现代生物科技专题》模块专题“胚胎工程” P.77在描述胚胎移植的基本程序时提到，可以将胚胎“放入-196 ℃的液氮中保存”。
学生和教师常常对此产生疑问：在-196 ℃的超低温条件下，胚胎细胞不会死亡吗？细胞内水分不会结冰吗？细胞内水分结冰后还能进行正常的新陈代谢吗？结冰发生反膨胀不会对细胞的结构造成损伤和破坏吗？要弄清以上问题，我们必须深入了解胚胎冷冻保存的原理和处理方法。
下面就这些问题作简要分析。
课本P.77图↑2 分析胚胎冷冻保存就是利用一定的冷冻技术将胚胎保存于-196 ℃的液氮中，使细胞的新陈代谢和分裂暂时停止，处于休眠状态，从而达到长期保存的目的。
通过冷冻可以保存胚胎，但也不可避免地会对其造成损伤。
视频：液氮速冻鱼复活实验↑2.1 胚胎冷冻造成的细胞损伤机制2.1.1物理损伤。
在胚胎冷冻过程中，如果降温速度过快，当温度下降至某一临界点，细胞内水分来不及渗透到外部时，胞内就会形成冰晶，胞内冰晶过大会破坏细胞器，刺穿细胞膜，从而对胚胎细胞造成致命的机械损伤。
同时，在-15 ℃~-50℃的温度条件下，细胞内液处于超冷状态时，如细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶将会迅速集聚，引起温度瞬间剧增，也会对细胞产生相当大的损伤。
2.1.2 溶液效应。
如果降温速度过慢，细胞就有充分的时间向细胞外渗透水分，使细胞内部溶质浓度增大，导致细胞过度脱水，细胞强烈收缩。
由于细胞内部长时间处于高浓度溶液状态下，这种高浓度的电解质可使蛋白质变性，同时破坏细胞膜，引起细胞膜上脂蛋白复合物的变性和部分脂类物质的丢失，增加了细胞膜对阳离子的通透性，在细胞膜上形成一些小孔，造成对胚胎的不可逆损害。
2.2 冷冻保护剂的种类及作用机制利用冷冻保护剂减少胚胎在低温状态下受到伤害的方法来自于自然的启示。
科学家研究发现，多数耐冻动物能在冷冻中存活的关键原因是它们在低温下体内能产生大量的低分子防冻剂，如葡萄糖、甘油以及许多其他醇类和糖类，这些化合物通过在冷冻和解冻过程中减少渗透性损伤和阻止冰晶的形成来保护细胞结构。
胚胎冷冻保存ppt课件
冷冻保护液常用pH7.2~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS） 来配制，也可用生理盐水或M199来配制。 现有保存方法有3种：程序冷冻法：一步冷冻法和 玻璃化冷冻化。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保 护剂；快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冷冻保 护剂，如甘油、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二 醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。
非渗透型冷冻保护剂 属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质， 能够溶解于水，但不能进入细胞。 机理：非渗透型冷冻保护剂主要通过该改变 渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作 用。 常见的非渗透型冷冻保护剂包括：单糖（如 葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子 糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。
冷冻方法
将胚胎在含20%小妞血清的PBS溶液中清洗两次 将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油 和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡10min 将胚胎专一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS 溶液中，立即转入胚胎冷冻细管 将细管在液氮冠颈部预冷5min后投入液氮中保存 解冻时将液氮中取出细管，在空气中平衡7s，迅速 投入20℃温水中，摇动细胞管使其解冻均匀 将解冻后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的 PBS溶液中平衡10min，出去保护剂；再用含20小 牛血清的PBS溶液洗涤2次后用于移植
抗冻保护剂 胚胎冷冻的关键是减少细胞内冰晶形成对胚 胎的损伤。对于胚胎的冷冻和解冻，一50~15℃是一个致死温度区。在这个温度区细胞 容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免 冰晶的形成。 分类：渗透型冷冻保护剂 非渗透性冷冻保护剂来自渗透型冷冻保护剂
属于细胞内冷冻保护剂，一般小分子物质，在0℃ 以上很容易通过细胞膜进入细胞质。 机理：在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞 内渗透出，减少了细胞内冰晶的形成；同时保护剂 与水分子形成氢键，降低了冻结部分的电解质浓度 从而减少了冷冻过程对细胞的损伤。 常见的渗透型冷冻保护剂有：甘油、二甲基要亚砜 （DMSO）、丙二醇和乙二醇等。
胚胎冷冻保存技术
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹 住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速 通过－6℃左右冰点，强制性地使细胞外液 形成冰晶，称之为植冰。
目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰 迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给 胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫 升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至 －6℃左右时，用上述方法诱发结冰。
损伤保护
• 诱发结晶 • 使用冷冻保护剂 • 玻璃化
损伤保护
• 诱发结晶
在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈 的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发 方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液 上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，
降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使
胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形
成。
特点：分子量大，不进入细胞
损伤保护
• 诱发结晶 • 使用冷冻保护剂 • 玻璃化
玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相 时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外 表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚 细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。
冷冻过程
三，保存 • 常规冷冻法
• 一步冷冻法
• 玻璃化冷冻法
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并
产下后代。 • 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20-25℃），
冻融胚胎移植对子代的近、远期影响
Vol.41No.5May 2021上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)冻融胚胎移植对子代的近、远期影响秦宁馨1，2，赵文龙1，2，周志阳1，2，施炜慧1，2，吴琰婷1，2，3，黄荷凤1，2，31.上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院胚胎源性疾病研究所，上海200030；2.上海市胚胎源性疾病重点实验室，上海200030；3.复旦大学生殖与发育研究院，上海200032［摘要］冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer ，FET ）是常用辅助生殖技术之一。
由于FET 具有累积妊娠率高、卵巢过度刺激综合征发生率低等优势，通过该项技术出生的子代数量逐年增加。
多项研究提示FET 子代发生围产期早产、低出生体质量、小于胎龄儿等的风险低于新鲜胚胎移植周期出生的子代，也有证据显示FET 子代出现巨大儿、大于胎龄儿等的风险较高；同时，亦有研究针对FET 子代在儿童期及成人期的长期健康状况进行报道。
该文就FET 对子代的近、远期影响及其原因进行综述。
［关键词］辅助生殖技术；冻融胚胎移植；子代；近期影响；远期影响［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.05.016［中图分类号］R711.6［文献标志码］AShort -and long -term effects of frozen -thawed embryo transfer on offspringQIN Ning -xin 1,2,ZHAO Wen -long 1,2,ZHOU Zhi -yang 1,2,SHI Wei -hui 1,2,WU Yan -ting 1,2,3,HUANG He -feng 1,2,31.Institute of Embryo Original Diseases,the International Peace Maternity &Child Health Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200030,China;2.Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases,Shanghai 200030,China;3.Institute of Reproductive and Developmental Research,Fudan University,Shanghai 200032,China[Abstract ]Frozen-thawed embryo transfer (FET)is one of the commonly used assisted reproductive technology.Because FET has the advantages ofhigh cumulative pregnancy rate and low incidence of ovarian hyperstimulation syndrome,the number of offspring born through this technology is increasing year by year.Many studies have shown that the risks of preterm delivery,low birth weight and small for gestation age of FET offspring are lower than those of the offspring born in the fresh embryo transfer cycle.There is also evidence that the risks of macrosomia and large for gestational age of FET offspring are higher.At the same time,there are also reports on the long-term health status of FET offspring in childhood and adulthood.This paper reviews the short-term and long-term effects of FET on offspring and the causes.[Key words ]assisted reproductive technology (ART);frozen-thawed embryo transfer (FET);offspring;short-term effect;long-term effect自辅助生殖技术（assisted reproductive technology ，ART ）诞生40年以来，已累计有超过800万人通过这项技术出生［1］。
胚胎冷冻与冻融胚胎移植
[试管知识] 试管婴儿基础知识（七）胚胎冷冻与冻融胚胎移植
对多余的胚胎进行冷冻，以备以后移植，可以增加IVF的累积妊娠率，并可大大节省费用。
有时当有严重OHSS风险，或因其它原因不宜进行胚胎移植时，会冻存所有的胚胎。
因此，胚胎冷冻及融胚胎移植已经成为IVF治疗中不可或缺的方法。
冻融胚胎移植的程序通常如下：
子宫内膜的准备
对于月经规律的妇女，可以在排卵后移植，根据胚胎冻存时所处的阶段（卵裂期胚胎或囊胚），确定是在排卵后3天还是5天移植胚胎。
对于月经不规律的妇女，可以采用人工周期的方法构建子宫内膜。
通常是在月经来潮（或黄体酮撤退出血）的第2天开始，每日口服4-6mg戊酸雌二醇，8-10天后监测子宫内膜的情况，当子宫内膜厚度≥8mm后，开始给予孕激素，4-5天后进行胚胎移植。
如果是移植囊胚，则移植的时间后推。
胚胎的解冻与移植
胚胎移植当日解冻冻存的胚胎，移植过程与新鲜胚胎移植相同。
冻融胚胎移植周期的黄体支持
对于采用人工周期的方法构建子宫内膜的妇女，黄体支持必不可少，因为这些妇女在人工周期中没有卵泡生长，没有黄体形成，体内缺乏自身分泌的黄体酮，因此必须依赖外源性的黄体酮，支持子宫内膜的正常发育和胚胎着床。
对于在自然周期进行胚胎移植的妇女，是否需要应用黄体支持？一些文献报道，在这种情况下应用黄体支持与否，妊娠率没有差异，因此认为这些人不需要应用黄体支持。
试管婴儿之冷冻解冻考题 及答案
试管婴儿之冷冻解冻理论考核及答案被考核人：考核时间：2022年11月一胚胎/囊胚冷冻的岗位职责？1 负责核对患者的姓名、年龄、病历号、助孕方式、取卵日期、冷冻日期等基本信息及瘢痕子宫、单角子宫等特殊信息；2 负责制作冷冻支架和载杆；3 负责核对拟行冷冻的卵子/胚胎/囊胚编号以及相应载杆号；4 负责卵子/胚胎/囊胚冷冻皿的制作；5负责卵子/胚胎/囊胚冷冻液的制作；6 负责将拟行冷冻的囊胚行激光破膜；7负责将卵子/胚胎/囊胚按照标准化程序进行冷冻操作；8 负责将冷冻好的卵子/胚胎/囊胚放入相应编号的液氮罐；9 负责填写卵子/胚胎/囊胚冷冻记录本和登记本。
二胚胎冷冻解冻原理，冷冻试剂特点？1 胚胎玻璃化冷冻原理：基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温下凝固，形成不规则的玻璃化固体，能有效抑制细胞内冰晶形成，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生玻璃化时能起到保护作用，所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。
此过程无冰晶形成，避免了对细胞的物理损害。
2 胚胎玻璃化解冻原理：是胚胎冷冻的逆向过程，是一个将细胞内冷冻保护剂置换出细胞外的反脱水过程，应用不同浓度溶液逐步置换，使细胞内保护剂逐步渗出细胞，而不会造成细胞过度充水或渗透压改变。
3 冷冻保护试剂特点：分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。
渗透性保护剂是一类能渗透入细胞的低分子化合物，相对分子量小，多在63—97KD；具有良好的水溶性；能自由穿透细胞膜，迅速进入细胞内，所以又被称为渗透性冷冻保护剂；其本身不具有明显的细胞毒性，甚至在高浓度情况下也不产生明显的毒性作用。
非渗透性保护剂是一类能溶于水，但不能渗透入细胞的大分子物质，没有明显细胞毒性，能增高细胞外溶液的渗透压起到非特异性保护作用，使细胞在冷冻程序以前脱水。
三两种冷冻解冻试剂的配制方法，使用时注意事项？COOK冷冻液套装，不能直接使用，需将玻璃化溶液2和3与二甲基亚砜混合后方可使用。
人类胚胎冻融技术及其影响因素
人类胚胎冻融技术及其影响因素
李娟;孟祥阁
【期刊名称】《中国计划生育学杂志》
【年(卷),期】2000(008)009
【摘要】为探讨冻融胚胎的方法，提高试管婴儿妊娠成功率，我们对人体外受精（ＩＶＦ）及卵浆内单精子显微注射（ＩＣＳＩ）后的３４８个早期胚胎加保护剂（丙二醇、蔗糖），采用Ｔｅｓｔａｒｔ慢速冷冻方法保存。
将其中７９个胚胎用快速融解法解冻，有５７个胚胎存活，存活率７２．１６％。
５７个胚胎分别给１３例患者移植，结果５例生化妊娠，其中４例发展为临床妊娠，１例已出生健康婴儿。
结论：采用冻融胚胎技术可提高一次取卵的总妊娠率
【总页数】4页(P393-396)
【作者】李娟;孟祥阁
【作者单位】山东省计划生育科研所,济南;山东省计划生育科研所,济南
【正文语种】中文
【中图分类】R321－33
【相关文献】
1.041 延长培养人类冻-融胚胎的时间对囊胚形成和细胞数的影响 [J], 宋文妍;孙莹璞
2.冻融技术的安全性回顾分析——复苏胚胎与新鲜胚胎的对比研究 [J], 罗小平;章汉旺
3.激光透明带薄化技术在冻融胚胎和高龄妇女新鲜胚胎移植中的应用研究 [J], 石
燕;葛斌;杨智敏;杨靖;杨名慧
4.冻融后的完整胚胎与局部损伤的冻融胚胎采用激光辅助孵化技术去除坏死的卵裂球及进行选择后潜在存活能力的比较 [J], Rienzi L.;Ubaldi F.;Iacobelli M.;张剑萍
5.人类冻融胚胎应用的探讨 [J], 康跃凡;陈文祯;张小燕;罗美瑜;郑备红;刘逸萍;王雅芬;林小鸣
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胚胎冷冻技术 ppt课件
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发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
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从总体上讲,冻胚移植的妊娠率比 鲜胚低,影响人类胚胎冷冻保存结果的 因素是多方面的,主要有胚胎的质量(大 小、渗透性等)和分裂(发育)阶段、母 体年龄及移植时机以及冷冻保护剂(渗 透性、毒性等)和冷冻溶解程序等几方 面。
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另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
??玻璃化冷冻具有许多冷存液没有的优点操作简单快捷价格便宜不需要特殊设备避免细胞内外冰晶形成更重要的是其粘滞性高在6冷存后形成的要的是其粘滞性高在6冷存后形成的玻璃样Байду номын сангаас构保持了分子离子正常的扩散与分配细胞内物冰晶形成维持了正常的细胞超微结构减少了对透明带和基因的损害提高了冷冻存活率和妊娠率
胚胎冷冻技术
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• 1985年Rau和Fahy用高浓度的DMSO、乙 酰胺、丙二醇和聚乙二醇分别组成玻璃化 溶液，对8细胞期的小鼠胚胎进行了一步冷 冻实验，获得87.5%的冻后发育率。此后。 牛、绵羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后应 用玻璃化冷冻法获得成功。目前该技术已 广泛应用于畜牧生产。
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人类胚胎冷冻的应用现状
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胚胎冻融的原理
本文转载于兰州军区兰州总医院生殖医学中心：
/shiguanyinger/sgbk/2012/0625/10282.html
胚胎冻融的原理介绍
很多人都不明白胚胎冻融的原理是什么？所以在网上一直发问，就于这个问题，今天小编给大家一起分享这个迷惑的答案，希望对有困惑的您有所帮，也希望能帮助您走出困惑！
专家为我们讲解：利用冷冻技术将胚胎和配子从生理温度降至低温并贮存，需要时，再从低温状态解冻至生理温度。
为增加胚胎和配子对冻融过程的耐受，增加存活率，必须选择合适的物质作为冷冻保护剂。
专家讲到：胚胎不同与配子，所以须选用不同的冷冻保护剂和冷冻方法进行冷冻，但它们都是活的细胞，对耐受冷冻与融解过程有相似的机理，以下以胚胎为例说明。
一、常用冷冻保护剂
1.渗透性保护剂如丙二醇（PROH），二甲基亚砜（DMSO），甘油（glycerol）等小分子化学物质，容易渗透入细胞，也称为细胞内冷冻
保护剂。
2.非渗透性保护剂包括单糖如葡萄糖、果糖，双糖如蔗糖、麦芽糖等，它们不能进入细胞，利用它增高细胞外溶液的渗透压而引起非特异保护作用，又称细胞外冷冻保护剂。
二、冷冻保护剂对胚胎的影响及机制
（一）毒性作用
为证明其毒性，将胚胎置于不同的冷冻保护剂一定时间，却不将其冻融，再继续观察胚胎的发育，发现在22℃时，停留在PROH的胚胎失活率高于DM的，而在4℃时，暴露于此两种冷冻保护剂几乎未发现其对胚胎有不良影响。
但经冻融过程后，存活率却明显下降，除其毒性作用外，引起冻融后胚胎失活的因素主要有：
（二）细胞内冰晶形成
细胞的冷冻实际上是一个脱水过程，如果在投入液氮前胚胎能充分脱水，避免形成细胞内冰晶，是胚胎冻融后能存活的主要因素。
相信仔细看过以上讲解的您一定收益匪浅吧，希望我的分享能给您带来福音！。