腺病毒表达系统PPT
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• 可适用的宿主细胞类型 • 选择标记 • 插入片段的大小 • 调控元件 • 报告基因
病毒表达载体的用途
基因治疗
1990年French等把腺嘌呤脱氨酶基因导入到一名4岁小女孩的T 淋巴细胞中治疗了腺嘌呤脱氨酶基因缺失病,开创了人类利用人 体基因治疗疾病的先例。 1992年复旦大学薛京伦等首次把人凝血因子Ⅸ基因成功用于治 疗血友病。 2005年第一个批准上市的基因治疗制品Adv-P53在中国上市。
腺病毒的基因及其功能
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白,分为早 期表达和晚期表达。早期表达的蛋白是功能蛋白、晚期表达的有 功能蛋白和结构蛋白,并且早期的功能蛋白调控晚期蛋白的表达。 早期表达的Ｅ1区蛋白(甚至包括Ｅ2区蛋白)是腺病毒基因组复制、 病毒包装和其他蛋白表达翻译所必需的,但其对细胞的毒性也是 很强的。E2蛋白涉及AdDNA复制, E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御 系统, E4调节有效的晚期基因转录。
重组腺病毒表达系统
腺病毒颗粒比较稳定,病毒基因组较少发生重排。插入外
源基因的病毒基因组在连续传代中一般保持不变。
腺病毒基因组较易操作。 制备大量的腺病毒较为容易。 可感染分裂细胞和非分裂细胞。rAds可转导肺细胞、肝细
胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等。
重组腺病毒表达系统
通过对本体蛋白的同样的翻译后的修饰，在细胞 wk.baidu.com表达真核蛋白。
一系列腺病毒转换因素允许产生高水平的异种蛋 白。重组蛋白代表了整个细胞蛋白的最丰富的多 肽（20%-30%）。
在较好的条件下，表达系统在数升的293细胞悬浮 培养液中可以按比例地增加，产量可达90mg/L。
腺病毒表达系统
腺病毒的特性
腺病毒属于无包膜病毒,外壳由240个六邻体和12个五邻体构成 二十面体结构,内部有约36kb的线性双链基因组,属于DNA病毒。 外壳的五邻体分别位于二十面体结构的顶角、均有一个纤突蛋 白(fiber)突起与其相连,腺病毒的组织亲合性与纤维蛋白头部 密切相关。
Adeno-X Expression System
Adeno-X Expression System
构建重组腺病毒不同方法比较
制备穿梭载体和 腺病毒载体
目的基因从穿梭 载体克隆到腺病
毒载体
获得重组腺病毒
噬斑纯化
总计
同源重组 Viral DNA Plasmid-based
7-14天 7-14天
E1a/E1b genes (integrated into 293 genome) allow replication and transcription of Adenovirus
构建重组腺病毒
构建重组腺病毒的传统方法是以同源重组为基础的。 其一用修饰的腺病毒DNA与穿梭载体在HEK 293细胞中进行同源重组； 通过Cre-loxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都
样可以插入长约8kb的外源DNA。
去除Ｅ1区还有一个优势,就是阻止了依赖Ｅ1区和Ｅ2区功
能蛋白的转录和随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。
Ｅ1区缺失的腺病毒可以在能够反式提供Ｅ1区基因蛋白的
293细胞中得到增殖。
腺病毒基因组结构与载体改造
HEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus E1a/E1b genes
病毒的受体与入侵细胞的过程
腺病毒感染细胞的第一步是通过纤突蛋白与细胞表面柯萨奇 病毒和腺病毒受体(CAR)结合。腺病毒粘附后,五邻体蛋白 上的精氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸（ＲＧＤ)与细胞表面的整 合素αｖβ3和αｖβ5结合并相互作用使病毒进入细胞。
第一代腺病毒载体
第一代腺病毒载体中,Ｅ1、Ｅ3基因表达盒已经去除了,这
病毒载体疫苗
重组腺病毒的作用
在哺乳动物细胞中，AdV已被成功应用于表达各种病毒 和细胞的基因，腺病毒表达载体系统表达出蛋白的生 物化学特性，可用于商业价值的开发，它可用来生产 亚单位疫苗，和新型诊断试剂盒的开发。
AdV可以通过转染细胞来表达蛋白，除基因治疗的相关 实验外还可用做体内特性研究。
真核生物细胞常用的表达载体
质粒型表达载体
病毒型表达载体
• 腺病毒表达载体 • 逆转录病毒表达载体 • 昆虫杆状病毒表达载体
病毒表达系统的特点
高转染效率 高蛋白表达水平 对转染效率很低的细胞进行高效转染 (原
代细胞等) 稳定,可遗传的表达 (逆转录病毒) 可控制拷贝数
如何选择合适的病毒表达载体？
插入loxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞， 通过Cre介导两个loxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒， 这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。 更为流行的方法采用了穿梭载体与腺病毒质粒转化一种特殊的菌株(BJ 5183)。然后从细菌中收集重组腺病毒，用其感染HEK 293细胞。
纯化腺病毒的电子显微照片 被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓
被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠纹状体的切片
用AdV转染基因的优点
速度快，简单，不需要任何特殊的装备。 相对其它方法，它非常容易被接受。事实上，这种感
染后细胞生存率几乎为100%。因此，AdV有向细胞内 转染遗传物质而忽视毒性作用的能力。 许多细胞类型均可被转染。 感染后的数小时，基因表达便可被分析。 刺激后，可有一种以上的基因被同时表达。
Reference Fisher & Watanable, 1996 Fang et al., 1996 Bout et al., 1994 Lee et al., 1996; Stratford-Perricaudet et al., 1990 French et al., 1994 Donahue, et al., 1998; Riew et al., 1998 Mastrangeil et al., 1993 Hoizinger et al., 1995
--
0-15天
14-21天 5-10天 26-45天
17-22天 0-5天 24-56天
体外连接法
2-3天 4天
4-7天 --
10-17天
Ad5腺病毒可感染的寄主
人体各类组织的细胞，除造血细胞外
多种哺乳动物细胞：
Species Chicken Dog Monkey Mouse Pig Rabbit Rat Sheep
病毒表达载体的用途
基因治疗
1990年French等把腺嘌呤脱氨酶基因导入到一名4岁小女孩的T 淋巴细胞中治疗了腺嘌呤脱氨酶基因缺失病,开创了人类利用人 体基因治疗疾病的先例。 1992年复旦大学薛京伦等首次把人凝血因子Ⅸ基因成功用于治 疗血友病。 2005年第一个批准上市的基因治疗制品Adv-P53在中国上市。
腺病毒的基因及其功能
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白,分为早 期表达和晚期表达。早期表达的蛋白是功能蛋白、晚期表达的有 功能蛋白和结构蛋白,并且早期的功能蛋白调控晚期蛋白的表达。 早期表达的Ｅ1区蛋白(甚至包括Ｅ2区蛋白)是腺病毒基因组复制、 病毒包装和其他蛋白表达翻译所必需的,但其对细胞的毒性也是 很强的。E2蛋白涉及AdDNA复制, E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御 系统, E4调节有效的晚期基因转录。
重组腺病毒表达系统
腺病毒颗粒比较稳定,病毒基因组较少发生重排。插入外
源基因的病毒基因组在连续传代中一般保持不变。
腺病毒基因组较易操作。 制备大量的腺病毒较为容易。 可感染分裂细胞和非分裂细胞。rAds可转导肺细胞、肝细
胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等。
重组腺病毒表达系统
通过对本体蛋白的同样的翻译后的修饰，在细胞 wk.baidu.com表达真核蛋白。
一系列腺病毒转换因素允许产生高水平的异种蛋 白。重组蛋白代表了整个细胞蛋白的最丰富的多 肽（20%-30%）。
在较好的条件下，表达系统在数升的293细胞悬浮 培养液中可以按比例地增加，产量可达90mg/L。
腺病毒表达系统
腺病毒的特性
腺病毒属于无包膜病毒,外壳由240个六邻体和12个五邻体构成 二十面体结构,内部有约36kb的线性双链基因组,属于DNA病毒。 外壳的五邻体分别位于二十面体结构的顶角、均有一个纤突蛋 白(fiber)突起与其相连,腺病毒的组织亲合性与纤维蛋白头部 密切相关。
Adeno-X Expression System
Adeno-X Expression System
构建重组腺病毒不同方法比较
制备穿梭载体和 腺病毒载体
目的基因从穿梭 载体克隆到腺病
毒载体
获得重组腺病毒
噬斑纯化
总计
同源重组 Viral DNA Plasmid-based
7-14天 7-14天
E1a/E1b genes (integrated into 293 genome) allow replication and transcription of Adenovirus
构建重组腺病毒
构建重组腺病毒的传统方法是以同源重组为基础的。 其一用修饰的腺病毒DNA与穿梭载体在HEK 293细胞中进行同源重组； 通过Cre-loxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都
样可以插入长约8kb的外源DNA。
去除Ｅ1区还有一个优势,就是阻止了依赖Ｅ1区和Ｅ2区功
能蛋白的转录和随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。
Ｅ1区缺失的腺病毒可以在能够反式提供Ｅ1区基因蛋白的
293细胞中得到增殖。
腺病毒基因组结构与载体改造
HEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus E1a/E1b genes
病毒的受体与入侵细胞的过程
腺病毒感染细胞的第一步是通过纤突蛋白与细胞表面柯萨奇 病毒和腺病毒受体(CAR)结合。腺病毒粘附后,五邻体蛋白 上的精氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸（ＲＧＤ)与细胞表面的整 合素αｖβ3和αｖβ5结合并相互作用使病毒进入细胞。
第一代腺病毒载体
第一代腺病毒载体中,Ｅ1、Ｅ3基因表达盒已经去除了,这
病毒载体疫苗
重组腺病毒的作用
在哺乳动物细胞中，AdV已被成功应用于表达各种病毒 和细胞的基因，腺病毒表达载体系统表达出蛋白的生 物化学特性，可用于商业价值的开发，它可用来生产 亚单位疫苗，和新型诊断试剂盒的开发。
AdV可以通过转染细胞来表达蛋白，除基因治疗的相关 实验外还可用做体内特性研究。
真核生物细胞常用的表达载体
质粒型表达载体
病毒型表达载体
• 腺病毒表达载体 • 逆转录病毒表达载体 • 昆虫杆状病毒表达载体
病毒表达系统的特点
高转染效率 高蛋白表达水平 对转染效率很低的细胞进行高效转染 (原
代细胞等) 稳定,可遗传的表达 (逆转录病毒) 可控制拷贝数
如何选择合适的病毒表达载体？
插入loxP位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞， 通过Cre介导两个loxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒， 这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。 更为流行的方法采用了穿梭载体与腺病毒质粒转化一种特殊的菌株(BJ 5183)。然后从细菌中收集重组腺病毒，用其感染HEK 293细胞。
纯化腺病毒的电子显微照片 被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓
被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠纹状体的切片
用AdV转染基因的优点
速度快，简单，不需要任何特殊的装备。 相对其它方法，它非常容易被接受。事实上，这种感
染后细胞生存率几乎为100%。因此，AdV有向细胞内 转染遗传物质而忽视毒性作用的能力。 许多细胞类型均可被转染。 感染后的数小时，基因表达便可被分析。 刺激后，可有一种以上的基因被同时表达。
Reference Fisher & Watanable, 1996 Fang et al., 1996 Bout et al., 1994 Lee et al., 1996; Stratford-Perricaudet et al., 1990 French et al., 1994 Donahue, et al., 1998; Riew et al., 1998 Mastrangeil et al., 1993 Hoizinger et al., 1995
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0-15天
14-21天 5-10天 26-45天
17-22天 0-5天 24-56天
体外连接法
2-3天 4天
4-7天 --
10-17天
Ad5腺病毒可感染的寄主
人体各类组织的细胞，除造血细胞外
多种哺乳动物细胞：
Species Chicken Dog Monkey Mouse Pig Rabbit Rat Sheep