多克隆抗体纯化-、
血清哇巴因多克隆抗体的纯化及Fab2片段的制备
本文缩略语Ａｂｂｒｅｖａｔｉｏｎｓ英文缩写英文全称ＥＯＢＳＡＯＶＡＦｃＡＥＬＩＳＡＨＰＬＣＨＰＳＥＣＳＰⅧＳＤＳ—ＰＡＧＥＣＤＲＦＲＳＰＡＤＡＢＡｎｇＩＩＡＣＴＨＶｅＭＷＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＯｕａｂａｉｎＢｏｙｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎＯｖａｌｂｕｍｉｎＦｒｅｎｄ’ＳＣｏｍｐｌｅｔｅＡｄｊｕｖａｎｔＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＳｉｚｅＥｘｃｌｕｄｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｉｃｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ—ｄｅｔｅｒｍｉｎｇＦｒａｍｅｗｏｒｋＲｅｇｉｏｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＤｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩＡｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈｉｎＶ０１ｕｍｅｅｌｕｔｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔ中文译名内源性哇巴因牛血清白蛋白卵清蛋白弗氏完全佐剂酶联免疫吸附法高效液相色谱高效液相排阻色谱过氧化酶标记的链酶卵白素十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰铵凝胶电泳ｒｅｇｉｏｎ互补决定簇框架区葡萄球菌Ａ３，３－－－氨基苯联胺血管紧张索ＩＩ促肾上腺皮质激素洗脱体积分子量血清哇巴因多克隆抗体的纯化及兰ｌ盐２ｇ丘露的制备●＿＿＿＿＿＿＿－－＿＿＿一ＩＩ研究背景：内源性哇巴因是一种存在于人和动物体内的Ｎａ＋，Ｋ＊－ＡＴＰ酶抑制物，具有调节水、钠代谢，血管舒缩和心肌收缩等重要生理功能，还与高血压、心力衰竭、慢性肾功能不全等多种疾病的发生、发展密切相关。
目前，我们已经运用动物免疫的方法，制备出血清哇巴因多克隆抗体，并分别用硫酸铵盐析法、ＤＥＡＥ一纤维素柱层析法及盐析法＋ＤＥＡＥ－纤维素柱层析法对抗血清进行部分纯化，进而动物实验中发现高血压大鼠静注哇巴因多克隆抗降压效果，但降压效果持续时间较短，并且出现轻度的过敏体后反应研究目的：１．选用适宜的免疫周期和适宜的免疫剂量，免疫家兔制备出高效价的哇巴因多克隆抗体；２．用ＨＰＳＥＣ法纯化哇巴因多克隆抗体，并且制备出高纯度的哇巴因多克隆抗体；３．用胃蛋白酶酶解哇巴因多克隆抗体，制备Ｆ（ａｂ）ｚ片段；４．用ＨＰＳＥＣ法初步测定哇巴因多克隆抗体及其Ｆ（ａｂ）。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
检验技师考点：多克隆抗体的纯化
检验技师考点：多克隆抗体的纯化检验技师考点：多克隆抗体的纯化多抗的纯化是一件比较简单的事情，因为人工干预比较大，所以对实验者的操作依赖性较强。
很多新手觉得这是一件比较复杂困难的工作，但是如果理解了原理，就可以自行改进实验了。
多抗纯化方法比较多，过去有用盐析法纯化的，有用辛酸-硫酸铵沉淀的方式纯化的，也有用冷酒精沉淀的方式纯化的，也有后来的离子交换层析和Protein A，G，A/G纯化的`，但是在今天，市场上几乎所有的抗体都是通过抗原亲和纯化得到的，与其它方法相比，抗原亲和层析得到的抗体效率高、产量高、产品纯、操作简单。
操作方法：免疫方法可以采用以下各种方法之一进行免疫。
(1)淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下(或皮内)注射活卡介苗 50mg(每侧约0.30ml) 。
7～10 天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大;②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG 乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml);③必要时，14 天后，重复步骤②一次;④再过 7 天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的 IgG 乳化抗原0.50ml(含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml) ;⑤5～7天后，耳静脉采血。
测定血清效价。
(2)皮下多点注射法：①家兔两侧掌(跖内各注射含有完全佐剂抗原0.10ml(IgG 含量5mg/ml) ;②7～10 天后，脊柱两侧多点(颈、胸、腰椎各两点、共 6 点)皮下注射含不完全佐剂5的抗原，每点0.50ml;③7～10 天后，脊柱两侧重复注射一次;④7～10 天后试血。
不合格者重复步骤③。
(3)多途径联合注射法：①两侧掌(跖)内侧皮下注射含完全佐剂抗原 0.50ml(IgG 量为5mg/ml) ;②14 天后，多点皮下注射含有不完全佐剂抗原;③7 天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml;④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增 IgG 量。
多克隆抗体纯化与保存
多克隆抗体纯化与保存
多克隆抗体的纯化和保存是制备高质量抗体的重要步骤。
以下是一些关于多克隆抗体纯化和保存的常见信息：
1. 纯化方法：多克隆抗体通常通过Protein A 或Protein G 的方法从动物血清中纯化抗体。
但是，对于某些使用场景，需要利用抗原亲和层析从总IgG 抗体中进一步纯化和分离抗原特异性抗体，从而获得纯度高、非特异性背景低的多克隆抗体。
2. 保存条件：多克隆抗体可以保存在50% 的丙三醇中，或保存在饱和硫酸铵中，或保存在-20℃。
对于某些特殊抗体，如酶偶联抗体、荧光抗体等，需要保存在4℃或避光保存。
3. 保存时间：多克隆抗体的保存时间取决于其类型和纯度。
一般来说，保存在50% 的丙三醇中的抗体可以保存数年，而保存在-20℃的抗体可以保存更长时间。
4. 保存前的处理：在保存前，需要对多克隆抗体进行适当的处理，例如去除任何可能的蛋白质杂质，并进行适当的稀释，以确保保存的抗体的稳定性和有效性。
总之，多克隆抗体的纯化和保存是制备高质量抗体的重要步骤。
在进行多克隆抗体制备时，应该根据具体情况选择适当的纯化和保存方法，并严格遵守保存条件，以确保抗体的稳定性和有效性。
重组人sCR1多克隆抗体制备及纯化鉴定
【 摘 要】 目的 制备原 核表达人 ｓ Ｒ 多克隆抗体并对其进行鉴定 。方法 Ｃ １ 提取人总 Ｒ Ａ进行 Ｒ — Ｎ Ｔ
采
・
论 著・
Ｐ Ｒ扩增合成 ｃ Ｎ 以 ｃ Ｎ Ｃ Ｄ Ａ， Ｄ Ａ为模板 。 构建重组表达质粒 ｐ Ｔ ８—ｓ ＲＩ 在大肠杆菌巾表达人 ｓ Ｒ 融 Ｅ ２ａ Ｃ 。 ＣＩ
ｔｅ ｅ ｎ ｉ ｏ ｙ ｐ ｏ ｅ ｔ ｓ ｈ ｓ ａ ｔ ｄ ｒ ｐ ｒｉ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｅ ｆ ｌ ｌ ｎ ｔ ＤＮＡ ｆ ｈ ｍａ ｓ Ｒ１ ａ ｏ ｔｉ ｅ ｕ ｉｇ Ｔ— ｂ ｅ ｔｏ ｓ ｈ ｕｌ ｅ ｇｈ ｃ ｏ ｕ ｎ Ｃ ｗ ｓ ｂａ ｎ ｄ ｓｎ Ｒ
ｂ Ｓ ｙ ＤＳ－ ＡＧＥ． Ｒｅ ｕ ｔ ｒ ｅ ａｂ ｉ ｏｙ ｌｎ ｌ ｎ ｉｏ ｙ ｇ ｉ ｓ Ｐ ｓｌ ｓ ｈ ｒ ｂ ｔ ｐ ｌｃｏ ａ ａ ｔ ｄ ａ ａ ｎ ｔ ｕ ｎ ＣＲ Ｉ ｆ ｓｏ ｐ ｏ ｅｎ ｏ ｌ ｂ ｈ ｍａ ｓ ｕ ｉｎ ｒ ｔｉ ｃ ｕ ｄ ｓ ｅ ｉ ｃ ｌｙ ｒ ｃ ｇ ｉｅ ｈ ｍａ Ｃ ｆ ｓ ｎ ｐ ｏｉ ．Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ Ｔ ｅ ｈ ｍａ Ｃ ｕ ｉｎ ｐ ｏｅ ｎ ｗ ｓ ｕ ｅ ｐ ｃｆ ａｌ ｅ ｏ ｎｚ ｕ ｎ ｓ ＲＩ ｕ ｉ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｎ ｌ ｓ ｈ ｕ ｎ ｓ ＲＩ ｆ ｓｏ ｒ ｔ ｉ ａ ｓ ｄ ｏ
ａ ｈ ｉ ｓ ｔ ｅ ｍｍｕ ｏ ｅ ａ ｔｒ ｕ ｉ ｅ ａ ｄ ｅｏ ｄｎ ，ｗｈｃ ｈ ｓ ｅｔｒ ａ ｔ ｅ ｉｉ ａ ｄ ｍｍｕ ｏ ｅ ｉ ｉ ． ｈ ｎ ｇ ｎ ｆ ｐ ｒ ｄ ｎ ｒ ｆｌ ｉ ｇ ｅ ｉ ｆ ｉｈ ａ ｂ ｔ ｎ ｉ ｎｃ ｔ ｎ ｉ ｅ ｇ ｙ ｎ ｇ ｎ ｃｔ Ｆ ｅ ｙ
DEAE-纤维素提取法纯化多克隆抗体
DEAE-纤维素提取法纯化多克隆抗体该法提取IgG简便，既可小量提取，•也可大量制备。
1．批量提取法称取DEAE-纤维素（DE32或DE52）50g，置于1000ml烧杯中，•先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0•左右的磷酸盐缓冲液（PB）平衡。
将水分抽干，或用布氏滤斗（内放两层滤纸）过滤，收集湿纤维素，•以降低其离子强度。
按1ml血清加湿重5g DEAE纤维素，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。
•上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。
该法提取IgG简便，既可小量提取，•也可大量制备。
2．Tris-Cl离子交换层析法（Ion-exchange chromatography）【材料和试剂】（1）DE32或DE52纤维素。
（2）HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
（3）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
（4）1.550cm 层析柱；透析袋；紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。
【操作步骤】（1）DE52纤维素的处理：DE52经酸、碱处理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
（2）装柱：将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。
将浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高时，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹•，控制流速1～2ml/min，同时连续加入DE52至所需高度。
待DE52完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。
（3）平衡：松开出水口螺旋夹，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15•滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。
兔抗人RBBP10多克隆抗体的纯化
ｈ Ｒ Ｂ Ｂ Ｐ １ ０ ｐ ｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ． Ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ① Ｐ Ｔ Ｃ—ｈ Ｒ Ｂ Ｂ Ｐ ｌ ｏ ｗ ａ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｐ ｕ ｒ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｓ ｕ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｆ ｕ ｌ ｌ ｙ ｗ ｉ ｔ ｈ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｍ ａ ｓ ｓ （ Ｍｒ ）ｏ ｆ ８ ０×１ ０ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ｐ ｕ ｉ ｒ ｔ ｙ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｒ ｅ ａ ｃ ｈ ａ ｂ ｏ ｕ ｔ ９ ５ ％． ② Ｐ ｕ ｉ ｒ ｉ ｆ ｅ ｄ Ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ —ｈ Ｒ Ｂ Ｂ Ｐ ｌ ０ ｐ ｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｂ ｉ ｎ ｄ Ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｔ ｏ Ｐ Ｔ Ｃ—
链 淀粉 树脂 亲合 柱 和 ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ ｏ ｓ ｅ １ ２凝 胶 柱 过 滤 纯 化 ， 将纯 化 的 Ｐ Ｔ Ｃ—ｈ Ｒ Ｂ Ｂ Ｐ 。 偶联 于 Ｎ Ｈ Ｓ— ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｅ ｄ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ 上 ， 制 备 亲 合 层 析 柱， 纯化兔抗人 Ｒ Ｂ Ｂ Ｐ 。 多 克隆 抗 体 。 结 果 ①表达 、 纯化 的 Ｐ Ｔ Ｃ—ｈ Ｒ Ｂ Ｂ Ｐ ， 。 的相对分 子质量 （ Ｍ ｒ ） 为８ ０×１ ０ 。 ， 纯度 为 ９ ５ ％； ② 从
．
Ｔｈ ｅ
ｐ ｕ ｉｆ ｒ ｉｅ ｄ ＰＴＣ — ｈ ＲＢＢＰ１ ０ ｗａ ｓ ｃ ｏ ｕ ｐｌ ｅ ｄ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ＮＨＳ — ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｅ ｐｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ ”ｔ ｏ ｐｒ ｅｐ ａ ｒ ｅ ａ ｆ ｉｎ ｆ ｉ ｔ ｙ ｃｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈｙ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍｎ ｔ ｏ ｐ ｕ ｉｆ ｒ ｙ ｒ ａ ｂ ｂｉ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ—
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
多克隆抗体的标准制备流程
多克隆抗体的标准制备流程包括以下步骤：
1.免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
2.免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。
3.免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性
抗体。
4.收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特
异性抗体。
5.抗体的纯化和鉴定：利用亲和层析、离子交换等方法对抗体进行纯化，并通过
蛋白质印迹、ELISA等方法对抗体进行鉴定。
6.抗体的保存：将纯化的抗体进行分装，并加入适量的防腐剂，放入-20℃的冰
箱中进行保存。
多克隆抗体的制备过程中需要注意以下几点：
1.免疫原的纯度和浓度要高，以保证产生的抗体特异性高、效价高。
2.免疫动物的种属差异会影响抗体的质量和效价，因此要选择与免疫原同种属的
动物作为免疫对象。
3.在免疫过程中要保证免疫原的质量和安全性，避免对动物造成不必要的伤害。
4.在纯化和鉴定抗体时，要选择合适的方法和试剂，以保证抗体的质量和特异性。
5.在保存抗体时要注意温度和湿度等环境因素，避免抗体失活或变质。
总之，多克隆抗体的制备是一个相对复杂的过程，需要严格按照标准流程操作，以确保抗体质量和安全性。
HCV多表位多克隆抗体的纯化及HCV-Ag的检测
性 。 方 法 ： 人 工 合 成 的 ＨＣＶ 复 合 多 表 位 抗 原 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 融 合 蛋 白 后 免 疫 小 鼠 分 析 表 达 产 物 的 将 免 疫 特 异 性 及 免 疫 原 性 ， 疫 家 兔 获 取 多 克 隆 抗 体 ， 用 盐 析 和 亲 和 柱 纯 化 多 克 隆 抗 体 ， 用 该 抗 体 用 免 利 利 双 抗 夹 心 法 检 测 ＨＣＶ — Ａｇ。 果 ： 合 蛋 白 能 在 原 核 表 达 系 统 中 高 效 表 达 ， 可 诱 发 小 鼠 及 家 兔 产 生 高 结 融 并 滴 度 的 特 异 性 ＨＣＶ 抗 体 ， ＨＣＶ 多 表 位 复 合 抗 原 多 克 隆 抗 体 ， 用 ＥＬＩ Ａ 法 检 测 ＨＣＶ— Ａｇ 中 表 现 出 该 在 Ｓ
ห้องสมุดไป่ตู้
特 效 的 治 疗 方 法 。 因 此 ， 期 诊 断 是 防 止 ＨＣＶ 传 播 早 的 有 效 手 段 之 一 。 然 现 有 的 抗 一ＨＣ 检 测 试 剂 盒 虽 Ｖ 特 异 性 和 敏 感 性 都 有 所 提 高 ， 由于 存 在 窗 口 期 和 但 静 默 感 染 ， 有 较 高 的 漏 诊 率 和 假 阳 性 。 ＨＣＶ — Ａｇ 仍 的 检 测 则 可 有 效 避 免 上 述 问 题 在 ＨＣＶ 的 抗 原 检 测 技 术 中 ， 用 一 种 型 别 制 备 利 的 免 疫 诊 断 试 剂 ， 以 对 其 它 型 别 的 感 染 做 出 有 意 难 义 的 诊 断 。对 单 个 病 毒 蛋 白 的 检 测 也 易 于 出 现 假 阴 性 ， 机 械 地 将 多 个 病 毒 蛋 白进 行 连 接 ， 会 增 加 检 而 又 测 的 非 特 异 性 ， 之 血 液 中病 毒 抗 原 的 含 量 较 低 ， 加 因 此 建立 病毒抗 原 检测 的基础 是制备 能广 泛识别 多种 ＨＣＶ 亚 型 病 毒 的 高 滴 度 特 异 性 抗 体 。近 年 来 ， 合 复 多 表 位 抗 原 的 概 念 促 进 了 抗 原 检 测 方 法 的 探 索 及 开 发 ， 种 理 论 是 基 于 对 多 型 别 表 位 的 分 析 的 基 础 上 这 寻 找 这 些 表 位 上 共 同 的 保 守 位 点 。利 用 这 个 多 表 位
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
多克隆抗体纯化
多克隆抗体纯化一、简介抗原分子通常具有多个抗原决定簇，免疫动物后可刺激具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，产生多种抗体。
由不同B细胞克隆产生的抗体称多克隆抗体；免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物；具有不均一性。
特异性差，易导致超敏反应。
抗原亲和纯化一般用在多抗的纯化上，这种纯化方式去掉了血清中那些非特异性结合的抗体分子，得到的抗体分子基本上都是能特异性与抗原结合的。
抗原亲和纯化需要先将抗原偶联到柱料上，然后通过亲和层析的方式去除非特异性抗体及杂蛋白，得到特异性抗体。
通常采用的柱料为溴化氢预处理和N-羟基琥珀酰亚胺预处理琼脂糖凝胶柱料，前者适合偶联大分子，后者适合偶联小分子物质，在实际操作中还是需要根据情况进行选择。
二、技术操作（一）实验准备1．实验材料：兔子血清2．抗原偶联亲和柱的制备（1）试剂与耗材：1）材料：CNBr活化的交联琼脂糖-4B；2）试剂：①偶联液：Buffer A：1mM HCl，体积为1L；Buffer B（pH8.3）：8.4g NaHCO3（0.1M）+29.25g NaCl（0.5M）+2.5mL12% SKL（0.03%），加水定容至1L；②封闭液（pH8.0）：12.1g Tris-HCl（0.1M）+29.25g NaCl（0.5M），加水定容至1L；③清洗液（pH4.0）：29.25g NaCl（0.5M）+11.5mL冰醋酸，加水定容至1L；④亲和纯化试剂：1xPBS缓冲溶液（pH7.4），0.1M Gly-HCl（pH2.7）;⑤其他试剂：硫酸铵，考马斯亮蓝G-2503）仪器与设备：Thermo台式离心机miro17R酶标仪（2）实验步骤①清洗：称取0.2g的CNBr活化交联琼脂糖-4B到柱子中，用偶联液A（1mM HCl）清洗，再用偶联液B清洗3-4遍。
②偶联：用偶联液B溶解的蛋白与填料介质混合，室温旋转孵育1h或4℃过夜；再用偶联液B洗去多余的蛋白；③封闭：将上述填料转移到封闭液（0.1M Tris-HCl，pH8.0）中封闭，室温封闭2h或4℃过夜；④循环清洗：封闭液（pH8.0）和清洗液（pH4.0）交替清洗填料至少3个循环；⑤平衡：用1xPBS缓冲溶液（pH7.4）平衡填料⑥保存：4℃，20%乙醇；3.多抗亲和纯化（1）硫酸铵沉淀①样品预处理：取过滤后的血清，用1xPBS稀释4-5倍；②硫酸铵沉淀：称取终浓度为0.277mg/mL的硫酸铵（45%）。
多克隆抗体制备流程_概述及解释说明
多克隆抗体制备流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述多克隆抗体制备是一种重要的生物学技术，用于生成大量具有特异性的抗体来识别和结合特定的抗原分子。
这项技术已经广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域，对于疾病的诊断、治疗以及基因工程药物研发都起着关键性作用。
1.2 文章结构本文将对多克隆抗体制备流程进行全面概述和解释说明。
首先在引言部分，我们将对文章的整体内容进行简单介绍，并阐明本篇文章的结构。
1.3 目的本文旨在提供一个清晰而详细地描述多克隆抗体制备流程的指南，使读者能够了解到该过程中各个步骤的目标与实施方法。
同时，我们还将涵盖实验操作中需要注意的事项以及可能出现的常见问题及其解决方案，帮助读者更好地开展多克隆抗体制备相关实验工作。
以上是“1. 引言”部分内容，下面将进入“2. 多克隆抗体制备流程概述”的撰写。
2. 多克隆抗体制备流程概述:2.1 抗原选择:在多克隆抗体制备过程中，首先需要选择合适的抗原。
抗原应具备以下特点：足够纯净、增强免疫原性、易于制备和保存，以及与目标分子高度特异性结合。
2.2 免疫动物选择与免疫原制备:在多克隆抗体的制备中，通常以小鼠作为主要的免疫动物。
小鼠免疫系统响应强且易于操作。
然而，在某些情况下，也可选用其他动物如大鼠、兔子等进行免疫。
针对所选抗原，需要将其与适当的佐剂混合以增强其免疫原性，比如与完全佐剂(Freund's adjuvant)或不完全佐剂(完全佐剂的无菌油乳化液形式)混合。
这有助于激发有效的抗体产生。
2.3 免疫程序与方案设计:在完成对抗原和佐剂的混合后，接下来是根据制备目标和实验需求设计合理的免疫程序和方案。
通常包括首次免疫、增强免疫和最后的终次免疫。
在首次免疫后，需要根据抗体滴度等因素评估免疫反应情况，并判断是否需要进行增强免疫。
增强免疫有助于提高抗体产量和质量。
为了更好地激发和筛选出理想的抗体阳性杂交瘤细胞株，还需要在合适的时间点采集血液样本进行检测，评估抗原特异性IgG水平。
多克隆抗体纯化与保存
多克隆抗体纯化与保存多克隆抗体纯化与保存是研究免疫学和生物制药等领域的重要内容。
下面将介绍多克隆抗体纯化的常用方法和保存的注意事项。
多克隆抗体纯化是将杂质与非特异性抗体从多克隆抗体中分离出来，获得高纯度的特异性抗体样品。
常用的多克隆抗体纯化方法有凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析和逆向相层析等。
凝胶过滤是最常见和简单的纯化方法之一。
通过选择合适的孔径和分子量的凝胶柱，可以将抗体分离出来，去除大部分的杂质。
凝胶过滤方法操作简单，但抗体的纯度有限。
亲和层析是一种常用的高效和高选择性纯化方法。
这个方法利用某些亲和剂，如蛋白A、蛋白G或亲和标记抗体等，与特定的抗体结合，从而实现抗体的分离纯化。
亲和层析方法具有高选择性和高纯度，但需要选择合适的亲和剂和条件。
离子交换层析是基于分子在离子交换树脂上的亲和性差异而进行纯化。
抗体中的正电和负电残基与树脂上的离子交换基团相互作用，从而实现抗体的分离纯化。
离子交换层析方法适用于酸性或碱性条件下进行纯化，但需要根据具体的抗体调整参数。
逆向相层析是利用抗体与水相和有机相的亲和性差异来分离纯化的方法。
抗体与有机相的相容性通常较低，所以在某些条件下可以实现抗体的分离纯化。
逆向相层析方法操作简单快捷，但往往纯化效果较差，只适用于特定的抗体。
在多克隆抗体的保存中，一般需要注意以下几点。
首先，抗体的稀释保存时宜选择透明无菌的储存管，并密封避光保存。
其次，应避免反复冻融，一般将抗体分装成小份量，每份只冻融一次以避免失活。
再次，抗体的保存温度应考虑其稳定性，通常低温保存对抗体的稳定性更有利。
最后，在保存过程中，应注意避免抗体与金属离子、酶等物质接触，以防止其降解。
综上所述，多克隆抗体纯化方法有凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析和逆向相层析等，选择合适的方法可以获得高纯度的抗体样品。
在抗体保存过程中，需要注意选择合适的储存管和保存温度，并避免反复冻融以及与金属离子、酶等物质接触。
这些都是多克隆抗体纯化与保存中的常见注意事项。
多克隆抗体实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。
二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。
多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。
2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。
3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。
4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。
5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。
五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。
2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。
多克隆抗体的制备实验报告
多克隆抗体的制备实验报告实验二多克隆抗体的制备实验目的和要求：1、掌握多克隆抗体制备方法2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定实验内容：1、猪链球菌（2、7、9型）分型血清制备2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定实验方法和步骤：（一）相关免疫血清的制备2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL5、分离血清之后，-20℃保存备用（二）琼脂扩散实验：材料和试剂1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。
2、1%预复琼脂（或琼脂糖）1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。
3、1%琼脂糖凝胶1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
4、抗原及相应免疫血清。
1．预复琼脂玻板的制备将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
2．凝胶板的制备溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。
3．免疫扩散及结果观察将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。
待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。
常用抗体纯化方法
常用抗体纯化方法抗体纯化是分离和纯化单克隆或多克隆抗体的方法，以获得高纯度和高活性的抗体样品。
常用的抗体纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和电泳法、硫酸铵沉淀法等等。
下面将对常用的抗体纯化方法进行详细介绍。
1.亲和层析法：亲和层析法是一种基于抗原-抗体互作原理的分离纯化方法。
先制备含有抗原的固相材料，如亲和树脂或亲和膜，然后将抗体样品与这些固相材料接触，使抗体与抗原结合，其他非特异性蛋白质被洗脱，最后用适当的溶液洗脱目标抗体。
这种方法可以用于多克隆或单克隆抗体的纯化。
2.离子交换层析法：离子交换层析法是利用样品中的离子性蛋白质与离子交换树脂（正离子交换或负离子交换）之间的相互作用进行分离的方法。
通过改变洗脱缓冲液的离子强度和pH值，可以将目标抗体从离子交换树脂上洗脱下来。
这种方法适用于广泛的抗体样品，可以快速纯化大量的抗体。
3.凝胶过滤法：凝胶过滤法是一种分子大小分离纯化方法，适用于分离分子量较大的抗体。
基本原理是通过调节凝胶孔隙大小，使大分子如抗体可以滞留在凝胶中，而小分子如低分子量杂质则可以通过凝胶孔隙逸出。
这种方法操作简单，纯化速度快，适合于大量抗体的纯化。
4.亲和电泳法：亲和电泳法是利用抗体在电场中迁移速度与分子特性有关的原理进行纯化的方法。
可以通过改变电场强度、溶液pH值和溶液离子浓度等参数来调节抗体的迁移速度，从而实现抗体的纯化。
亲和电泳法适用于纯化低丰度目标抗体和快速分离纯化。
5.硫酸铵沉淀法：硫酸铵沉淀法是利用硫酸铵的沉淀作用将目标抗体从混合物中分离出来的方法。
通过调节溶液的硫酸铵饱和度和沉淀时间，可以得到纯度较高的抗体样品。
该方法简单、快速，适用于大量抗体的纯化。
总的来说，抗体纯化方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体的实验要求和抗体性质选择最适合的纯化方法。
同时，也可以结合两种或多种方法进行联合纯化，以获得更高纯度和活性的抗体。
多抗纯化标准操作规程(3篇)
第1篇一、目的为确保多抗样品的纯度和质量，特制定本操作规程，规范多抗的纯化过程。
二、适用范围本规程适用于实验室多抗样品的纯化。
三、职责1. 纯化操作人员：负责纯化过程中的实际操作。
2. 质量监督人员：负责监督纯化过程，确保操作符合规程要求。
3. 管理人员：负责制定和修订本规程，监督规程的执行。
四、操作步骤1. 准备工作（1）确认多抗样品的来源、数量、质量等信息。
（2）检查纯化设备，确保设备运行正常。
（3）准备所需试剂、耗材和仪器。
2. 纯化操作（1）样品预处理：将多抗样品按照一定比例加入适量缓冲液，混匀。
（2）吸附：将预处理后的样品加入吸附柱，控制流速，使样品充分吸附。
（3）洗涤：使用适当缓冲液对吸附柱进行洗涤，去除非特异性吸附的杂质。
（4）洗脱：使用适当洗脱液将目标蛋白从吸附柱上洗脱下来。
（5）收集：收集洗脱液，进行蛋白浓度测定。
（6）浓缩：使用浓缩仪对收集到的洗脱液进行浓缩。
（7）复溶于适当缓冲液：将浓缩后的蛋白样品复溶于适量缓冲液。
3. 质量控制（1）在纯化过程中，定期检测蛋白浓度、纯度、分子量等指标。
（2）纯化后的多抗样品需进行SDS-PAGE、Western blot等分析，验证纯度。
（3）对纯化后的多抗样品进行冻存，确保样品稳定性。
五、注意事项1. 操作过程中，注意保持无菌操作，避免污染。
2. 严格控制纯化过程中的参数，如流速、洗脱液浓度等。
3. 根据样品特性和纯化目的，选择合适的吸附材料和洗脱液。
4. 纯化过程中，注意观察设备运行状态，发现问题及时处理。
5. 纯化后的样品需妥善保存，避免反复冻融。
六、记录与报告1. 操作人员需详细记录纯化过程中的各项参数，如流速、洗脱液浓度等。
2. 质量监督人员对纯化过程进行监督，确保操作符合规程要求。
3. 纯化完成后，填写纯化报告，包括样品来源、纯化方法、检测结果等信息。
4. 将纯化报告存档，以便后续查阅。
本规程自发布之日起实施，由实验室负责解释和修订。
纯化一多克隆抗体
我需要纯化一多克隆抗体.抗原是GST融合蛋白.不知道谁有抗体纯化手册,给小妹一些建议好吗?不胜感谢回复抗体的纯化有很多中方法，帮你整理一些供你参考。
一、硫酸铵沉淀法基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
试剂及仪器·组织培养上清液、血清样品或腹水等·硫酸铵（NH4）SO4·饱和硫酸铵溶液（SAS）·蒸馏水· PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一)·透析袋·超速离心机· pH计·磁力搅拌器实验步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS）将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到pH7.0。
此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）；（二）沉淀1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片；2、保留上清液并测量体积；3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）；4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。
弃上清保留沉淀；2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。
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汇报内容
一 抗体技术的简介
二
多克隆抗体纯化的研究及应用
三
实验思考
一、抗体技术的简介
抗体制备技术的发展阶段
1
2
基因的原核表达及抗体的制备
3
多克隆抗体的纯化技术
1. 抗体制备技术的发展阶段：
抗体：B细胞分泌的能够特异性结合抗原的免疫球蛋白。
1890年Behring等发现抗白喉毒 素抗体，开始了以抗原免疫动物 来获得多克隆抗体(Pabs) 的途径 1975年 kohler等创建杂交瘤技 术制备单克隆抗体(McAb)
强度，中和抗体
表面大量电荷。
中性盐有： 硫酸 铵、 硫酸钠、 硫 酸镁、 氯化钠及 磷酸盐等。
的上清液， 再经 硫酸铵沉淀。
[1]甘丽晶,刘晓波,胡质毅.抗体分离纯化技术研究进展[J].检验医学与临床,2013,04:461-464.
二、多克隆抗体纯化的研究及应用
1 微生物方面的研究应用
2
动物方面的研究应用
4]庞学燕,季昀,王洪荣,魏宗友,王梦芝.奶牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备、纯化及鉴定[J].动物营养学报,2012,11:2190-2194
3. 植物方面的研究应用
3.1 拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的多克隆抗体纯化
在拟南芥中， 该磷酸酶家族有９个成员， 分别命名TOPP1-9， 这些蛋白
质序列高度保守， 部分序列存在特异性。
3
植物方面的研究应用
4
茶叶方面的研究应用
1. 微生物方面的研究应用
1.1 大肠杆菌O157：H7 多克隆抗体纯化
采用盐析法、亲和层析法和抗原抗体复合物解离法获得其纯化产物 ,比较各纯化产 物的比效价、纯度及交叉反应性。
1. 1. 1 比效价
测定抗血清 、各种方法纯化后抗体的效价 ,以及各自蛋白质的质量浓度 ,以每毫克 蛋白质的效价作为比效价 。
图1 不同纯化方法所得抗体纯度的比较
[2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241.
1. 1. 3 交叉反应性
以大肠埃希氏菌、阿柏 丁沙 门菌等为相似抗原, 通过观察纯化产物对相似抗原
的效价与对 O157∶H7的效价比值来判断纯化产物与相似抗原的交叉反应程度。
2.1.2盐析法结合亲和层析法纯化效果
抗血清先用盐析法粗提纯，再用蛋白A树脂亲和层析法精提纯，得到的条带清晰度 最高。
将盐析法与亲和层析法相结合，得到了纯度较高、特异性较 好的抗体，而且由于盐析法的初步纯化，使亲和层析填料蛋 白A树脂的使用寿命显著延长。
图 3 Western 盐析法结合亲和层析法抗体的纯度检测 图 4 Blot蛋白A亲和层析提纯后抗体特异性
（3）将重组蛋白His-GFP-N150结合到溴化氢活化的树脂上， 通过亲和吸
附的原理特异性纯化识别 Ｎ末端50个氨基酸的多克隆抗体。
5]王玮,管利[萍,张静,陈亮,李猛,侯岁稳.拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的原核表达和多克隆抗体纯化[J].西北植物学报,2014,10:1937-1943
3.1.4 抗体的特异性检测
[6]邓威威,金阳,李旻,马林龙,张正竹.茶树咖啡碱合成酶基因原核表达、及其抗体制备与鉴定[J].植物研究,2015,03:333-339.
Cf
7-MX
Px
图13 TCS1体外酶活性的HPLC分析
1，3，5 融合蛋白 GST 不同底物下(7- MX、 Tb 及 Px)的体外酶反应产物检测(CK);2，4，6融合蛋白 TCS1 不同底物下(7- MX、 Tb 及 Px)的体外酶反应产物检测
酸性条件（pH4.5）
往血清中加入短链 脂肪酸 － 辛酸， 血浆蛋白中的清蛋 白、α 及 β－球蛋 白成分沉淀， 取 抗体成分为主
3. 亲和层析法
根据分子的特定结
夺取抗体分子的
水化层； 改变了溶液离子
构部位能够同其他
分子相互识别并结 合的原理。 如酶与底物的识别 结合、 受体与配体 的识别结合、 抗体 与抗原的识别结合， 改变条件可以使这 种结合解除。
将TOPP4全长和特异部分序列(TOPP4基因的 Ｎ 端150bp,简称 N150） 分别构建到带有 GST标签和 His标签的载体中，转化大肠杆菌， 诱导重组
蛋白表达。
以 GST- TOPP4为抗原制备 TOPP4多克隆抗体， 特异序列肽段纯化 方法纯化 TOPP4蛋白抗体，即用 TOPP4Ｎ 末端50个氨基酸序列与 His标 签重组表达纯化。
2. 动物方面的研究应用
2.1 奶牛α-酪蛋白抗体纯化方法的比较及其优化
2.1.1 盐析法和亲和层析法纯化效果比较
盐析法纯化后的α-酪蛋白比重大，仍有少量杂带；蛋白A树脂亲和层析法提纯的 抗体条带清晰，杂带明显减少，抗体的纯度更高。
图2 盐析法与蛋白A树脂层析提纯比较
[3]庞学燕,季昀,潘晓花,田青,王洪荣.奶牛α-酪蛋白抗体纯化方法的比较及其优化[J].中国奶牛,2013,02:41-42.
5]王玮,管利[萍,张静,陈亮,李猛,侯岁稳.拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的原核表达和多克隆抗体纯化[J].西北植物学报,2014,10:1937-1943
3.1.2 重组蛋白的纯化
利用GST标签蛋白能够与谷胱甘肽特异性结合， 以及 His标签蛋白能够与金属 Ni离子螯合的原理纯化蛋白的原理。SDS-PAGE电泳检测洗脱液中蛋白质纯度。
4.2 茶树咖啡碱合成酶抗体的制备及纯化
为了给 TCS1 的深入研究提供良好的工具，邓威威等通过构建重组质粒 TCS1pGEX- 4T- 2，转入表达宿主细胞 Ｒeastta(DE3)pLysS中，表达纯化了融合蛋白， 制备出 TCS1 多克隆抗体。
抗体纯化方法：采用硫酸铵沉淀后将其通过 Protein A 层析柱进行纯化，获得
[2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241.
1.1.4 小结
(1)盐析法纯化的抗体纯度低，但是抗体得率很高，而且盐析法简单方便，实验设备 要求低，经济实惠。
(2) 亲和层析法纯化抗体具有高效、快速 、纯化产物纯度高的优点 。但亲和层析填料成
[2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241.
1. 1. 2 纯度鉴定
通过SDS- PAGE电泳测定抗体纯度 。亲和层析纯化法得到的抗体较纯, 其次是
抗原吸附法纯化的抗体 ;而只采用盐析法所获得的抗体仍含有较多的杂蛋白 。
图5 SDS- PAGE 鉴定 α s－酪蛋白抗体纯度
注：M: 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 Protein molecular weight marker， 1 ～4: α s － 酪蛋白抗体 。 4]庞学燕,季昀,王洪荣,魏宗友,王梦芝.奶牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备、纯化及鉴定[J].动物营养学报,2012,11:2190-2194
2.1.4 α s－酪蛋白抗体特异性:
（1）Western- blot 显示， 纯化后的抗体能够与 α s － 酪蛋白标准品专一性 结合。
图6 Western- blot 法鉴定 α s － 酪蛋白抗体特异性
（2）纯化后的抗体与奶牛乳腺组织中提取的 α s－酪蛋白具有反应性。
图 7 Western- blot 法鉴定抗体与奶牛乳腺组织中提取的 α s－酪蛋白的反应性
[6]邓威威,金阳,李旻,马林龙,张正竹.茶树咖啡碱合成酶基因原核表达、及其抗体制备与鉴定[J].植物研究,2015,03:333-339.
4.2 .2 抗体的效价及特异性检测
若反应孔OD450值大于阴性对照孔OD450值的2.1倍时，则判为阳性。经间接
ELISA 法检测，得到其抗体效价为1∶2 000
图9 重组蛋白 GST- TOPP4和 His-GFP-N150的纯化
5]王玮,管利[萍,张静,陈亮,李猛,侯岁稳.拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的原核表达和多克隆抗体纯化[J].西北植物学报,2014,10:1937-1943
3.1.3 抗体的纯化
（1）原核表达出带有 His标签的TOPP4Ｎ末端特异氨基酸序列的重组蛋白 His－N150。 （2）在重组蛋白中引入GFP蛋白，提高重组蛋白的分子量，重组蛋白HisGFP-N150发绿色荧光。
[3]庞学燕,季昀,潘晓花,田青,王洪荣.奶牛α-酪蛋白抗体纯化方法的比较及其优化[J].中国奶牛,2013,02:41-42.
2.1.3 αs -酪蛋白抗体纯度SDS- PAGE检测结果：
经过饱和硫酸铵法和蛋白 A 树脂 2 步纯化后得到的 α s－酪蛋白抗体重链 清晰可见， 表明通过纯化得到了纯度较高的 α s－酪蛋白抗体。
4. 茶叶方面的研究应用
4 .1 茶叶领域的相关研究
茶树中咖啡碱含量存在差异， 这可能是由于咖啡碱合成酶基因表达上的差异， 也可能是其咖啡碱合成酶蛋白表达上的差异。因此， 通过得到茶树咖啡碱合成酶 的多克隆抗体， 对后续研究有着重要的价值。
但是目前关于咖啡碱合成酶TCS1 蛋白水平上的研究仍然有限， 并且没有针 对咖啡碱合成酶 TCS1 的商业化抗体出售， 也不能检测其在蛋白水平上的表达情 况。
提取拟南芥TOPP4目的基因缺失突变体（没有完全缺失 TOPP4基因）拟南 芥野生型Col-0的总蛋白，检测是否有杂带。
图10 Western bloitting检测多克隆抗体的特异性
Qin Q, Wang W, Guo X, et al. Arabidopsis DELLA protein degradation is controlled by a type-one protein phosphatase, TOPP4[J]. 2014 5]王玮,管利[萍,张静,陈亮,李猛,侯岁稳.拟南芥蛋白磷酸酶TOPP4的原核表达和多克隆抗体纯化[J].西北植物学报,2014,10:1937-1943