液质联用

现代分析技术之
液相色谱-质谱联用技术
一、 概述
1、质谱
质谱法（Mass Spectrometry）即质谱分析法
不同质荷比的离子经质量分析器分离，而后被检测并记录下来的谱图叫做质谱图(Mass Spectrum)
质谱图的横坐标是质荷比（m/z)，纵坐标是离子强度
2、质谱检测的是离子质量
质谱中采用的质量单位
—Da=Dalton（道尔顿）
质量单位，等于一个碳原子（12C）质量的十二分之一，约为1.66×10-24克；一克约为6×1023道尔顿
—amu=atomic mass unit，
原子质量单位
1amu=1Da
3、质量数
¾名义质量数
—采用元素质量数的整数进行计算，例如：C=12，H=1，O=16
¾单同位素质量数或准确质量数
—用丰度最大的同位素准确质量数计算
—例如：12C=12,1H=1.0078,16O=15.9948
¾平均质量数或化学质量数
—考虑到所有天然同位素丰度的该元素原子量来计算
—例如：C=12.001，H=1.00794，O=15.9994
¾质谱获得的单电荷离子的m/z值，是单同位素质量数
4、分子量的计算
利血平，C33H40N2O9的MW的计算
5、液质联用（LC/MS）
色谱质谱的联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。

6、LC/MS中的液相色谱
液质联用的前提和基础=进样+分离
根据化合物的化学特性分离样品（比如极性化合物，非极性化合物，酸性化合物，碱性化合物等）
LC的特点：分离技术
分离效率高
连续流出，峰宽有限
有时需要使用缓冲盐提高分离度
高压环境工作（>1000 psi）
7、LC/MS中的质谱
质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱
分析物被转化为气相离子而被分析
离子按其质荷比（m/z）被分离及检测
MS的特点：
灵敏度高
定性/定量
高真空环境工作
溶剂参与反应（API电离源）
8、LC/MS的局限性
异构体，立体化学方面区分能力差。

重复性稍差，要严格控制操作条件。

有离子源产生的记忆效应，污染等问题。

价格稍显昂贵，操作较复杂。

9、为什么使用LC/MS?
（1）丰富的结构信息
（2）高灵敏度
（3）定量结果
（4）进一步增加HPLC的分离能力
（5）解决无UV吸收样品的分析问题
10、LC/MS联用关键技术—接口
液相色谱：
¾高效分离混合物
¾流动相挥发后产生大量气体
¾出口压力为大气压
¾无质量限制
¾可以使用缓冲盐溶液
质谱：
¾需要高真空条件
¾质量分析系统
¾最好使用挥发性缓冲液
液质联用的接口必须完成三个转变：
—物态转变：液态—气态
—带电状态：“中性”—离子
—真空变化：760torr—10-8torr
¾要求：雾化，去溶剂和电离同时完成
11、液质联用与气质联用的区别：
气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。

12、液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：
①不挥发性化合物分析测定；
②极性化合物的分析测定；
③热不稳定化合物的分析测定；
④大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；
⑤没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

13、液质的名词和术语
总离子流图TIC（Total Ion Chromatography）
在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图，称总离子流图。

质量色谱图MC（Mass Chromatogram）
¾指定某一质量(或质荷比)的离子强度对时间所作的图。

¾由全扫描质谱中提取一种质量的离子得到的色谱图，又称为提取离子色谱图（Extract Ion Chromatography）。

¾选择不同质量的离子的MC，使正常色谱不能分开的两个峰实现分离，以便进行定量分析。

¾在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。

当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，根据分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的MC。

二、仪器
1、真空系统
质谱仪之所以在低压下工作是为了
尽量减少离子-分子之间的碰撞(即,得到最大平均自由程)
碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通道
碰撞可能导致产生意外的离子或反应
防止在高电压(用于某些离子聚焦)下生成电弧
减少污染/化学噪音
好的真空状况意味好的灵敏度!
2、进样系统
把分析样品导入离子源的装置
进样方式
LC 自动进样器进样
质谱直接进样
注射泵连续进样
3、离子源
使样品产生离子的装置称为离子源。

离子源作用:
1.电离分析物或者把离子从液相转成气相.
2.样品引入到质量检测器.
3.差分抽空。

4.抽走干扰的中性物种和排除电荷相反的离子。

离子源类型:
1.电喷雾电离 (ESI) – 液相过程(大多数情况).
2.大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization) – 气相过程.
电喷雾电离(Electrospray Ionization, ESI)
1）电喷雾离子化大致分为三个过程:
1.形成带电液滴
2.溶剂蒸发和液滴碎裂
3.形成气相离子
2）ESI的特点
分析物类型：
预形成离子(酸和碱)
极性中性
生物高聚物的多电荷离子
<100 da 到200 000 da
常用流速: low nL - 1.0 ml/min
提高离子化:
–适当的 pH
–合适 HPLC 溶剂
–柱前添加剂
软电离技术
灵敏度取决于化合物本身和基质，大致在fmol-pmol水平。

3）影响化合物ESI电离的因素
1、被分析物的浓度：信号的饱和归因于离子在液滴表面过于密集,致使被分析物离子不
能到达液滴表面
2、基质：被分析物离子与电解质离子竟相转化为气相离子的竞争使被分析物响应降低
ESI的离子抑制现象
¾样品分子离子和电解质离子对电荷及占据液滴表面的竞争导致离子抑制，离子在液滴表面过于密集，致使某些样品分子离子不能到达液滴表面，这一现象叫离子抑制。

¾一般而言，被分析物的响应随其他的电解质浓度增高而降低。

3、流速：ESI 响应随流速的增加而降低；对ESI接口来说,最佳工作流速为100-250
μL/min.
4、溶剂：为促进样品的电离，要考虑以下因素
–要有一定的中、高性的溶剂，以利于样品极化。

–可利用挥发性酸、碱或其它电解质调节pH值，以利于形成正、负离子。

–为维持稳定的电喷雾，要考虑溶剂表面张力。

4）ESI可用的溶剂：
Methanol甲醇，Acetonitrile乙腈，Propanol丙醇，Isopropanol异丙醇，Butanol丁醇，2-methoxy ethanol 2-甲氧基乙醇，Acetic乙酸，Formic蚁酸，TFA三氟醋酸，Amm. Acetate 醋酸铵，Amm. Formate甲酸铵，HFBA 六氟丁醇，TEA 四乙基铵，Amm. Hydroxide 氨水，Tetrabutyl amm. Hydroxide四丁基氢氧化铵，Hexafluorobutanol 六氟丁醇
5）流动相选择
水有机溶剂混合物
挥发性缓冲剂
乙酸铵，甲酸铵，碳酸氢铵 (<100 mM)
甲酸，乙酸(0.01 - 1% v/v), 三氟乙酸 (<0.1% v/v)
三烷基胺和氨水溶液
避免:
¾无机酸
¾难挥发性缓冲剂——除非是特殊设计的离子源
6）ESI中的多电荷离子
质谱测定是基于质荷比 (m/z)
–单电荷离子m/z = (M+H)/1
–双电荷离子m/z = (M+2H)/2
–多电荷离子m/z = (M+nH)/n
多电荷离子可以扩展质谱的质量范围
7）ESI 的优化步骤
如果分析物的 pKa 值未知, 估计3个 pH 区域
用正离子和负离子模式
酸 – 负离子检测, 在pKa上增加pH 2
–用氢氧化铵，四乙铵、四甲铵提高pH值
碱– 正离子检测, 在pKa上降低 pH 2
–用甲酸，乙酸，三氟乙酸降低pH 值
除盐（引起离子抑制）
调节离子源温度和电离电压得到最大信号
在负离子模式, 降低喷雾电压来减小放电
对于复杂分子，经常出现不符合以上规则的情况
大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) 1）大气压化学电离可分为以下两个步骤:
1.快速蒸发
2.气相化学电离(电晕放电)
2）APCI的特点
分析物类型：
中低极性
高质子亲和力
高气相酸性
< 1200 da
一般流速: 0.2 - 2.0 ml/min
比ESI耐缓冲
只产生单电荷离子
软电离技术
3）APCI的优化步骤
如果分析物的p K a 值未知, 估计3个 pH 区域
用正离子和负离子模式
酸 – 负离子检测, 在pKa上降低pH 2
–用氢氧化铵，四乙基铵，四甲基铵提高pH值
碱– 正离子检测, 在pKa上升高 pH 2
–用甲酸，乙酸，三氟乙酸降低pH 值
调节电晕放电电压
调节喷雾温度
–分析物的热解离
4）APCI和ESI的不同点
¾离子产生的方式
ESI 利用离子蒸发，液相离子化
APCI 利用电晕放电离子化，气相离子化
¾能被分析的化合物类型不同
ESI 极性化合物和生物大分子
APCI 弱极性，小分子化合物，且具有一定的挥发性
¾流速
ESI 0.001到0.25 ml/min。

APCI 0.2到2 ml/min。

¾多电荷
ESI 能生成一系列多电荷离子，特别适用于蛋白，多肽类等生物分子。

APCI 产生单电荷离子
5）API中的源内CID技术
CID：Collision Induced Dissociation碰撞诱导解离
在API源内的亚真空区加速离子，并形成CID
调节锥孔电压，获得源内CID
源内CID过程与串联MS相同，但它对于母体离子没有选择性。

锥孔气可以降低样品和溶剂形成簇离子的几率，提高灵敏度。

6）正负离子模式
选择的一般原则为：
正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。

样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。

负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。

样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。

4、质量分析器
质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。

Quadrupole 四极杆（Single 单级，Triple 三级）
Ion Trap 离子阱
Time - of - flight ( TOF ) 飞行时间
Magnetic, Electric Sectors 磁，电扇区
Fourier Transform – MS 傅立叶变换
5、碰撞诱导解离CID
选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(碰撞气体：N2、He、Ar、 Xe、CH4等) ，发生离子—分子碰撞反应，从而产生“子离子”，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID谱(collision-induced dissociation)
6、数据采集
连续扫描（Continuum）
每次扫描的数据都会被存下来，可以单独查看每次扫描的质谱图或者是summed spectrum.
可以得到每个质量点的峰形和分辨率信息。

这种扫描数据量非常大。

棒状图（Centroid）
每次扫描的数据都会被存下来，可以单独查看每次扫描的质谱图或者是summed spectrum ，数据虽然按照continuum 方式采集，但被自动处理并以棒状图方式存储 在一个质量点只选择一个代表性的点存储，所得到的谱图是一根一根棒状的谱图 从棒状图中无法去判断谱图的分辨率，对于没有分开的同位素峰，可能会造成质量不准确。

文件的数据量小，不会占用很多的硬盘空间，是较常用的采集方式
MCA
每次扫描的数据都会被加和在一起
因为噪音信号不会出现在相同位置，所以MCA方式采集的数据是样品信号叠加，而噪音则是平均，因而能够提高信噪比
文件数据量要比 continuum 方式小。

7、检测接收器
接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板
8、数据及供电系统
将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪各部分工作。

从几伏低压到几千伏高压。

9、仪器性能
质量范围：例如2-3000Da
灵敏度：有多种定义方法，粗略地说是表示所能检查出的最小量，一般可达到10-9-10-15克甚至更低，实际还应看信噪比。

分辨率（R）R=M/ΔM
M为相邻两峰之一的质量数，ΔM为质量差。

例如:500与501两个峰刚好分开，则R=500/1=500；若R=50000 则可区别开500与500.01。

对于四极杆仪器，通常做到单位分辨.
三、方法开发
1、定量的质量分析器：串联四级质谱仪（MS/MS）三重四级杆（QqQ）
2、LC/MS/MS扫描类型
¾全扫描（full/ms scan）
得到化合物的准分子离子
判断出化合物的分子量
鉴别是否有未知物
确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。

¾子离子扫描（daughter/product ion scan）
MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定母离子经碰撞产生。

¾母离子扫描（parent ion scan）
MS1质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，所得到的母离子质谱峰一定是能丢失指定碎片的母离子。

¾中性碎片丢失扫描（constant neutral loss）
MS1质量分析器扫描能丢失指定中性碎片的母离子，MS2质量分析器扫描丢失指定中性碎片的离子，所得到的质谱图是由MS1扫描的母离子，母离子只能是丢失指定中性碎片的离子。

¾离子检测（single ion recording & Multiple Reaction Monitoring ）
选择离子记录（SIR）
MS1质量分析器是静态，并且只检测指定的离子。

多反应监测（MRM）
指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的。

3、LC-MS/MS 定量分析流程
第一步：Q1 SACN——确定母离子的质荷比
¾根据待测化合物性质，选择分析的极性（+/-）、离子化方式（ESI/APCI），根据分子量选择扫描范围和时间
¾确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。

第二步：Product Ion Scan——确定子离子的质荷比
¾得到高质量的MS2图，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜
¾平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位
第三步：优化化合物参数
¾根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对
¾选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间
¾优化化合物的各参数，初步建立MRM方法
¾一般优化两次，以得到比较确切的结果
第四步：方法转化：将连续进样方法→LC/MS方法
¾添加色谱设备，设置色谱同步
¾设置色谱参数或调用色谱方法；修改质谱分析时间，与色谱参数一致，调用质谱方法。

¾保存样品表及方法
第五步：标准工作曲线的制作
¾空白基质添加标准品，稀释成不同浓度
¾根据LC流动相组成，选择稀释液，配置实际样品
¾编辑批处理文件，排列进样顺序
¾平衡色谱柱和质谱离子源
¾LC/MS采集数据
第六步：数据处理
¾标准曲线的制作
¾编辑定量方法
¾结果的分析和保存
4、为什么要进行样品的预处理？
¾保护仪器：防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。

¾获得最佳的分析结果：ESI电离的过程中，电荷在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。

5、样品前处理常用方法
¾超滤，过滤
¾溶剂萃取／去盐
¾固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE) 分散固相萃取（Dispersive SPE）
¾色谱分离（反相色谱分离，亲和技术分离）
¾甲醇或乙腈沉淀蛋白
¾酸水解，酶解
¾衍生化
¾浓缩
¾添加内标
6、数据处理
¾检出限，S/N~3:1；定量限S/N~10:1
¾同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%，峰面积比峰高准确
¾当浓度低、信号弱、自动积分不准时可对峰面积手动积分
¾平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值
¾标准曲线5-7个浓度点
四、应用
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