液质联用原理及应用

液相色谱—质谱联用的原理及应用

简介

1977年，LC/MS开始投放市场

1978年，LC/MS首次用于生物样品分析

1989年，LC/MS/MS取得成功

1991年，API LC/MS用于药物开发

1997年，LC/MS/MS用于药物动力学高通量筛选

2002年美国质谱协会统计的药物色谱分析各种不同方法所占的比例。1990年，HPLC高达85%，而2000年下降到15%，相反，LC/MS所占的份额从3%提高到大约80%。我们国家目前在这方面可能相当于美国1990年的水平。为此我们还有很长的一段路要走色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。

色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。

液质联用与气质联用的区别:

气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。

液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

现代有机和生物质谱进展

在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。

随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。

目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为

质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS 的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。

质谱原理简介：

质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。

常见术语:

质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.

峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.

离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度.

基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.

总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子

总离子流图:

在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图.

质量色谱图

指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图.

利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。

1.0

指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见的准分子离子峰是[M+H]+ 或[M-H]- .

在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子如M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等碎片离子：

准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子.

碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。

Ephedrine, MW = 165

多电荷离子：

指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝

大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.采用电喷雾的离子化技术,

可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。

同位素离子

由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.

各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等

如何看质谱图：

(1)确定分子离子,即确定分子量

氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。

(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式

高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式

低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:

(3)峰强度与结构的关系

丰度大反映离子结构稳定

在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。

不同类型有机物有不同的裂解方式

相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异需要经验记忆。

质谱解析的一般步骤

(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好)

(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当

(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等.

(3) 尽可能判断出分子离子。

(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......

(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。