几种细胞混合培养特点及应用
细胞培养技术详细学习资料
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上皮型细胞
• 来源：起源于内、外胚层 的细胞，如：皮肤及其衍 生物、消化道、乳腺、肺 泡、上皮性肿瘤等。
• 形态：类似体内的上皮细 胞，呈扁平、不规则、多 角形，中有圆形核。
• 生长特点：细胞紧密相连 成单层膜
相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
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对细胞培养技术的评价
优点：
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动；
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） ； 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）； 利用方法：研究技术、记录方法；
3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物--高等动物--人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤）
缺点： 观察不方便
很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
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培养细胞的生长特点
粘附并伸展 是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞
在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支 持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放 射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类 型生长。 密度依赖性
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悬浮型细胞
概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长。
来源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白细胞 肿瘤细胞为主。
特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，呈单个 或小细胞团。
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优点： 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
202X
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
202X
本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
2
现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
3
陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
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清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
第三章 细胞工程(三)
缺点：
存在扩散限制，颗粒太大时细胞生长不 良； ② 培养过程中忌钙沉淀剂或整合剂 ，如磷 酸盐、柠檬酸盐、EDTA等均会使凝胶溶 解。
①
3.抗凋亡技术
细胞凋亡，是指为维持内环境稳定，由 基因控制的细胞自主有序地死亡。 细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的 最大障碍，死亡的细胞80%是凋亡所导致， 而不是坏死。因此抗凋亡技术的应用在 细胞大规模培养中显得极为重要。
3.灌流式操作
灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面 新鲜培养基不断加入反应器。一方面又将反应 液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使 细胞处于一种不断的营养状态。 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件 较好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～ 108个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低 温下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提 高，生产成本明显降低。
中 试 生 物 反 应 器
动物细胞融合
细胞融合是正Байду номын сангаас的生命活动
受精作用
两个细胞正在融合
细胞融合又称细胞杂交。是指将二种或二 种以上的细胞或原生质体合并形成一个细 胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞 的方法。
自然融合 自然情况下发生的融合 人工诱导融合 在体外用人工方法促使融合
细胞融合技术
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图
聚乙二醇 （PEG） 法细胞融 合过程
电融合 诱导法 原理示 意图
动物细胞融合的过程
动物融合最成功的例子就是“杂交瘤”— —能够产生单克隆抗体的融合细胞。
细胞共培养技术在美白药物研究中的应用及前景
人表皮原代黑 素细胞 与角质 形成 细胞共培养 的体外模型 ， 为
美 白药 物 的筛 选 提 供 了 可行 的 方 法 。 仲少 敏等 取 ８ ｏ 选 ５种 生药醇提 物和水提物在 ｍｌｎａ与 ｓ一 ｅ ａ Ｐ １共 培 养 体 系 做 实 验 研 究 ， 果 苷作 为 阳 性 对照 ， 熊 结果 川 芎 、 灵 仙 、 枝 、 冬 、 威 桂 麦 白果 、 本 、 花 、 蒿 红 白苏 叶 的醇 提 物 ， 倍 子 的水 提 物 在 细 胞培 五 养 水 平对 黑 素 生 成有 明显 抑 制 作用 ， 强 于 相 同浓 度 熊 果 苷 的
Ａｐ ｉａｔ ｎ ａｎ ｏｓ ｅｃ ｓ ｏ ｅｌｃｏ－ ｌ ｅ ｔ ｐｌ ｃ ｉ ｄ ｐｒ ｐ ｔ ｆｃ ｌ ｏ ｃｕｔ ｅｃｈ ｏｌｇｙ ｉ ｈ ｅｓ ｕｒ ｎ ｏ ｎ ｔ ｅ ｒ ｅａｒ ｄ ｄｅｖ ｌ ｐｍ ｅｎ ｃｈ ａｎ ｅｏ ｔＯｆ
ｓ ｉ － ｉ ｉ ｇ ｄｒ ｇ ｋ ｎ ｗｈｔ ｎ ｕ ｓ ｅｎ
胞共培养技术筛选美白药物的发展现状及前景综述如下。
１ 细 胞 共 培 养 的 方 法
细 胞 培 养 技 术 目前 应 用 的方 法 可 分 为 单 层 混 合 共 培 养 技 术 、 接 触 式 共 培 养 技 术 和 组 织 １程 支 架 技 术 。单 层 共 非 ＝ 培养 是将 两种 以上 细胞 放 入 同 一器 皿 中共 同 培 养 的 方 法 ， 非 接 触 式 共 培 养 是 通 过 Ｔ ａ ｓ ｅ １ 小 室 来 实 现 的 。 将 ｒ ｎｗ ｌ Ｔ ａ ｓ ｅ １小 室放 入 培 养 板 中 ， 室 内称 上 室 ， 养 板 内称 下 ｒ ｎｗ ｌ 小 培
黑素细胞相连的角质形成细胞对其发挥的作用不容忽视 ， 罗 增 香 等 过 中 药 单 体 蛇 床 子 素 、 芩 苷 埘 黑素 合 成 的研 究 。 通 黄
细胞共培养
细胞共培养细胞共培养是一种在细胞生物学领域广泛应用的技术，它可以促进不同类型的细胞相互作用，有助于揭示细胞间的相互关系、细胞与外界环境的互动以及细胞功能的调控机制。
在细胞共培养中，通常会选择两种或多种不同类型的细胞种类共同培养，通过它们的相互影响，我们可以更好地理解细胞之间的相互作用以及共生关系。
细胞共培养的意义细胞共培养技术的应用可以为多种领域带来重要的研究价值。
首先，细胞共培养可以模拟体内细胞相互作用的情况，有助于理解细胞间的信号传导、代谢调节等机制。
其次，通过细胞共培养，可以研究不同类型细胞在共同培养条件下的相互影响，推测细胞之间的相互作用对细胞功能和生理活动的影响。
此外，细胞共培养也可以应用于药物研发领域，通过模拟体内环境，评估药物对细胞相互作用的影响，为药物筛选和疾病治疗提供重要参考。
细胞共培养的技术原理细胞共培养的技术原理主要包括细胞种类的选择、培养基的配方和共培养体系的建立。
在细胞共培养过程中，不同类型的细胞根据研究需要选择合适的比例和细胞密度进行混合培养，通常会在含有足够营养物质和生长因子的培养基中进行共培养实验。
培养基的pH值、温度、湿度等条件也需要精心控制，以确保细胞在共培养过程中能够生长和相互作用。
细胞共培养的应用细胞共培养技术在生物学研究、药物筛选和组织工程等领域都有重要的应用。
在细胞学研究中，可以通过共培养实验探究细胞间的相互作用，揭示新的细胞通信机制、信号传导路径等；在药物筛选领域，细胞共培养可以评估药物对多种细胞类型的影响，提供更接近体内情况的药效评价方法；在组织工程领域，利用不同类型细胞的共培养，可以构建更接近天然组织结构和功能的人工组织，为组织修复和再生医学研究提供新思路和技术支持。
总结细胞共培养作为一种重要的细胞实验技术，有助于揭示细胞相互作用的本质、理解细胞功能的调控机制，对生物医学研究和应用具有重要的意义。
通过合理设计共培养实验，可以进一步拓展我们对细胞间相互关系的认识，为深入探讨生命活动的奥秘提供新思路和方法。
细胞培养技术与应用
细胞培养技术与应用细胞培养技术是生物科技领域的重要组成部分，其应用范围广泛，涉及医学、农业、食品工业、环境保护等多个领域。
本文将简单介绍细胞培养技术的基本原理、分类、常见技术及应用。
一、细胞培养技术的基本原理细胞是生物体内组成单位，是生物学研究的基本对象。
细胞培养技术是指将生物体内的细胞从组织或器官中分离出来，放入含有必需营养物质和适当环境的培养基中，进行生长、增殖和分化的一种技术。
培养基是一种液态或固态的生物学培养用基质，其中含有细胞生长所需的各种营养物质、维生素、微量元素和生长因子等，而无菌的操作条件、适当的pH值和氧气浓度以及温度和湿度的控制，也是细胞培养过程中必须关心的问题。
细胞培养技术的基本原理就是通过对培养基中培养的细胞进行试验和分析，研究细胞生长、增殖、分化和功能等方面的问题。
二、细胞培养技术的分类细胞培养技术的分类主要依据种类、来源、形态等特性，可分为以下几类：1.原代细胞培养（Primary cell culture）此类培养为第一次从组织或器官中分离的细胞，具有原代细胞特征，具有细胞衰老限制，常能增殖到35-60倍，适于生物学仿真实验的研究；2.细胞株培养（Cell line culture）细胞株是长期经连续传代而获得的细胞世代，可分为稳定细胞株和不稳定细胞株。
稳定细胞株经多次传代后，还能保持原始形态和功能，代表性细胞株有HeLa、CHO、Vero等，常用于药理学、生物学及生物工程等领域中进行研究；3.二次扩增或转染细胞培养（Secondary cell culture）此类培养为从原代细胞或细胞株中分离后通过扩增或转染处理的细胞。
常用于细胞毒性实验、用于表达蛋白质、病毒、植物和昆虫细胞的重组蛋白等；4.三维细胞培养（3D Cell culture）此类培养方式为采用特殊的培养基和培养方法，使细胞形成三维组织结构。
其应用领域涉及人体组织再生医学、肝内药代动力学等。
5.定量检测型细胞培养（qPCR and ELISA）此类培养突出利用优化的细胞培养条件，量化检测细胞中与特定指标相关的分子量、酶活性、基因表达等，是常用于诊断、监测疾病和药效评估的技术。
细胞培养基种类及用途
细胞培养基种类及用途1. DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）：DMEM 是最常用的无血清培养基之一，是以鹰的鸟胚为基础改进而来的，含有大量氨基酸、糖类、维生素和一些重要的生长因子。
适用于大多数哺乳动物细胞的培养，具有优良的细胞增殖和生长效果。
2.RPMI1640：RPMI1640是一种由罗斯韦尔公立医院制备的细胞培养基，主要用于淋巴细胞、淋巴瘤和骨髓细胞的培养。
它具有高浓度的氨基酸和维生素，适合长期的培养以及体外细胞繁殖实验。
3. MEM（Minimum Essential Medium）：MEM 是一种最简单的细胞培养基，含有大量的必需氨基酸、维生素和果糖。
它广泛用于原代细胞和肿瘤细胞的培养，具有适应性强、成本低的优势。
4. FBS（Fetal Bovine Serum）：FBS 不是一种细胞培养基，而是培养基中添加的血清。
FBS 富含细胞生长因子、激素和营养物质，可提供所需的细胞补体和血浆蛋白。
它被广泛用于细胞培养中，可以促进细胞的增殖和生长。
5. StemPro MSC SFM：StemPro MSC SFM 是一种专门设计用于人类间充质干细胞（MSC）培养的无血清培养基。
它富含生长因子和维生素，可以维持 MSC 的干性状态，有利于其增殖和多向分化。
6. Neurobasal medium：Neurobasal 是一种特殊的神经元细胞培养基，用于神经元细胞的培养。
它含有许多神经营养因子和激素，能够促进神经细胞的生长和分化。
7.DMEM/F12：DMEM/F12是一种混合型细胞培养基，是DMEM和HAMF12培养基的混合产物。
它具有增强细胞的生存能力和增殖速度的优势，适用于许多类型的肿瘤细胞和原代细胞的培养。
细胞培养基的选择要根据具体实验目的和细胞类型来确定。
不同种类的细胞培养基在细胞生长、增殖和分化方面有不同的影响，因此合理的选择细胞培养基可以提高实验效果和数据可靠性。
细胞融合及应用PPT课件
应用1：细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 一、何谓单克隆抗体？
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
人类免疫系统的介绍
外分泌淋巴系统：呼吸道和生殖泌尿系统
内分泌淋巴系统：胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等
T淋巴细胞：即胸腺依赖淋巴细胞（thymus dependent lymphocyte）。亦可简 称T细胞。来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。目前认 为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸 腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T 细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血 和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有 利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T 细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面 标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
HAT培养基
次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基喋呤（aminopterin， A） 胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T）
次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型 （HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）
39
（二）免疫小鼠
免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周， 静脉再加强免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采 用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来 讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强 弱有关，以IgG为例，第一次为l00 g，第二次为50 g，免 疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂， 每次腹腔注射1×l06一1×107。
电融合法的基本过程
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电 场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是 原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体 紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就 可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在 一起。
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
几种细胞的培养
Adult stem cell
3）.主要特征 未分化造血干细胞的表面标记可被有荧光标记的 单抗识别 自我更新有关因子：端粒、端粒酶活性、干细胞 因子和信号分子gp130等 分化有关因子 凋亡 维持骨髓和血液中血细胞数目 Bcl-2 和 Steel 因子可以维持干细胞生命以避 免凋亡 临床应用 白血病 其他血液病（如再生障碍性贫血）
1.内皮
标本来源：牛主动脉，牛肾上腺皮质 毛细血管，人脐静脉等
方法：血管注入胶原酶使内皮细胞分 离，然后培养在铺有明胶基质的培养器 皿内。如果标本来源是毛细血管，培养 液中需加有丝分裂剂；如果来源是大血 管则不需要。
1.细胞种类：ECV-304(脐静脉内皮细胞株)； 2.培养的天数：3d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X100； 4.培养基种类：1640+10%胎牛血清； 5.状态与特征:细胞呈梭形，贴壁生长
植入 隆
未受精卵
易核卵
多
电激 莉
融合卵
羊
示
体外胚胎发育
意
植入 图
绵羊C子宫
生产
多莉
多莉
克隆猴
Spermatagonia stem cell
在哺乳动物的总生育周期内，精子的前体细 胞
高度专一、不间断地产生高度分化的精子
1.精原干细胞的特点 数目少，处于相对静止状态 包围在支持细胞中 对辐射和化学物质的损伤有最强的抵抗能力 可被移植并在受体内维持精原干细胞群，分化
几种常用细胞 的培养技术
一、肿瘤细胞的培养
肿瘤细胞(tumor cell)在组织培养中 占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易 培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞 系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大 的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、 抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手 段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起 着不可估量的作用。
细胞培育技术中的细胞杂交与融合方法介绍
细胞培育技术中的细胞杂交与融合方法介绍细胞培育技术是现代生物技术的重要组成部分，它通过控制环境条件和培养基的组成，使细胞在体外得以增殖和分化。
在细胞培育过程中，细胞杂交和融合技术起着关键的作用。
本文将介绍几种常见的细胞杂交和融合方法。
首先，细胞杂交是指将两种不同的细胞融合在一起，使其产生杂合细胞。
这种技术常用于基因工程研究中，可以将不同的基因组和性状进行组合，从而获得新的性状。
目前常用的细胞杂交方法有两种：化学法和电融合法。
化学法细胞杂交是指利用化学物质使细胞融合。
其中，聚乙二醇(PEG)是一种常用的融合剂。
在细胞杂交实验中，首先需要将两种细胞分别处理，使细胞表面变得黏性，然后将两种细胞混合并加入适量的聚乙二醇，使细胞融为一体。
这种方法简单易行，操作方便，但效率相对较低。
电融合法细胞杂交是利用高压电脉冲使两种细胞融合。
在细胞杂交实验中，首先需要将两种细胞分别处理，使细胞表面变得黏性，然后将两种细胞放置在导电板上，并施加一定的电压脉冲。
电压脉冲的作用下，细胞膜被破坏，两种细胞间的质膜融合。
这种方法操作简单，融合效率较高，但对细胞的伤害较大。
其次，细胞融合是指将两个或多个细胞融合成一个细胞。
这种技术常用于细胞重编程和克隆繁殖中，可以获得具有特定性状的细胞和个体。
目前常用的细胞融合方法有两种：电融合法和病毒介导融合法。
电融合法细胞融合是利用高压电脉冲使两个或多个细胞融合。
在细胞融合实验中，首先需要将待融合的细胞分别处理，使细胞表面变得黏性，然后将这些细胞按照一定比例混合，并施加一定的电压脉冲。
脉冲的作用下，细胞膜被破坏，不同细胞间的质膜融合。
这种方法操作简单，融合效率较高，同时对细胞的伤害较大。
病毒介导融合法细胞融合是利用病毒作为工具介导细胞融合。
在细胞融合实验中，首先需要将待融合的细胞分别感染两种不同的病毒，然后将这些感染的细胞混合培养。
病毒通过侵染细胞，使细胞融合形成杂合细胞。
这种方法无需施加外力，操作相对简单，但效率较低。
植物体细胞杂交技术ppt课件
思考1：根据细胞结构特点，不同植物体细胞
发生融合，首先会遇到什么障碍？
细胞壁
原生质体
思考2：有没有一种温和的方法去除细胞壁？
用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁-------酶解法
思考3：如何将原生质体进行融合？
化学法---聚乙二醇（PEG）诱导融合 物理法---离心、振动、电刺激
利用电激法将野生马铃薯与栽培马铃薯进 行细胞融合
二、杂交技术流程
三、意义及局限
打破物种界限，定向改变生物性状 未按照人们的需要表现出亲代的优良性状
异想天开
然师 法 自
小试牛刀
1.植物体细胞杂交是利用不同物种的两个体细胞 融合成一个杂种细胞的过程。该过程是（ B ）
A、不同植物的精子与卵细胞的融合 B、不同植物的原生质体的融合 C、完整的两个体细胞的融合 D、植物花粉细胞的两两融合
有性生殖的过程中进行减数分裂，才遵循 孟德尔的遗传规律
分离出有活力的原生质体 最常用的 酶解法 。 （2）步骤2一般常用
的化学试剂是 PE，G
目的是
诱导不同植物体细 胞的原生质体融合
(3)在利用杂种细胞
培育成为杂种植株
的过程中，运用的
技术手段
是植物组织培养
，其中步骤④相当于Fra bibliotek分化，步骤⑤再相分当化
于
。
（4）植物体细胞杂交的目的是获得新的
杂种植株，使远源杂交亲本的遗传特征能 够在新的植物体上有所表现，其根本原 因 杂种植株获得双亲的遗传物质。 （5）若远源杂交亲本A和B都是二倍体， 则杂种植株为倍 四 体。
（6）从理论上讲，杂种植株的育性为 可育。 若运用传统有性杂交方法能否实现？不能 ， 原因是 因为不同种生物之间存在生殖隔离。 因此，这项研究对于培养作物新品种方面 的重大意义在于 克服远源杂交不亲和的障碍。 （7）利用植物体细胞杂交的方法培育作物 新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循 孟德尔的遗传规律？为什么？ 否
一种pbmc和msc共培养的方法及其应用
一种pbmc和msc共培养的方法及其应用1. 引言PBMC（外周血单个核细胞）和MSC（间充质干细胞）是目前研究较为广泛的细胞类型之一。
PBMC是体内免疫系统的主要组成部分，具有免疫调节和抗肿瘤等功能；而MSC则具有自我更新、多向分化和免疫调节等特性。
PBMC和MSC共培养能够发挥两者的协同效应，有望在疾病治疗和再生医学领域发挥重要作用。
2. 共培养方法（1）PBMC和MSC分离：从人体外周血中分离PBMC和从骨髓、脂肪组织等源头分离MSC，并进行细胞计数和鉴定。
（2）细胞培养：将PBMC和MSC分别培养至适当的浓度和状态，如PBMC可采用RPMI-1640培养基，MSC可采用DMEM/F12培养基，并添加适当的生长因子和补充物。
（3）共培养体系建立：将PBMC和MSC以一定比例混合，常用比例为1:1或2:1，将混合细胞悬液转移到共培养培养基中。
（4）培养条件调节：调整培养条件如温度、湿度、CO2浓度等，提供适宜的生长环境。
（5）共培养时间：根据具体实验设计，共培养时间可在数小时至数天不等。
（6）细胞采集：根据实验需要，采集共培养体系中的细胞，如细胞上清液、细胞沉淀等。
3. 共培养方法的应用（1）免疫治疗：PBMC和MSC共培养后，PBMC的活性和功能会得到调节和改善。
共培养体系中的MSC具有免疫抑制作用，可抑制PBMC 的过度激活和炎症反应，从而在免疫治疗中发挥作用。
例如，在移植物抗宿主病（GVHD）的治疗中，共培养的PBMC和MSC可通过调节免疫应答，减轻移植物对宿主组织的攻击。
（2）组织再生：PBMC和MSC共培养后，MSC的多向分化能力可以促进组织再生和修复。
共培养体系中的MSC可分化为成骨细胞、软骨细胞等，同时PBMC中的细胞因子也能促进MSC的分化和增殖。
这一方法在骨折修复、软骨修复等领域具有潜在应用前景。
（3）肿瘤治疗：PBMC和MSC共培养后，MSC的免疫调节能力可增强PBMC对肿瘤细胞的攻击。
5细胞融合
原生质体融合细胞的再生愈伤组织
三、物理法--电融合法
1、原理：
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极 排列，形成串珠。高频直流脉冲使原生质膜击穿， 从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：
一是不存在对细胞的毒害问题； 二是融合效率高； 三是融合技术操作简便。
1）亲本 2）同核体：同源原生质体的融合体
3）异核体：非同源的原生质体的融合体
4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体
5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。
为什么要筛选杂种细胞？
A+B
A、B、A+A、B+B ； A+B
生长快
如何筛选杂种细胞？尚无特定规律可循
最简单的方法是利用双亲细胞形态和色泽上的差
+
-
桥梁
+
-
+
-
电荷重排
+
- +
融合
+
- + -
原生质体膜接触
原生质体纯化
PEG法诱导原生质体融合过程
Hale Waihona Puke 融合过程影响因素：
分子量：400—6000（通常：1000—4000） 浓度： 20—60% （通常：30—50%） 时间： 悬浮法 1—2 min 离心法 5—8 min pH： 偏碱为宜（pH7.4—8.0）
二、动物细胞的筛选方式
1）利用抗药性筛选： 利用动物细胞对药物敏感性的差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感 亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识
尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规加入抗生素作继代培养，但仍建议不要在原代培养中加入抗生素，其理由之一是获得的细胞是无菌的，原代培养时的细菌污染很少发生。其次，尽管认为抗生素对细胞代谢的影响可忽略，但最好避免使用它们，以免细胞生长环境的不稳定。最重要的是要意识到培养中主要污染物的类型，它们通常暗示了问题的来源。
在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。
四、抗生素
在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是25~100ui/ml）与链霉素（25~100μg/ml）。这两种抗生素常混合使用。在一些实验室里，它们常规加入所有的培养基中。庆大霉素（10~100μg/ml）通常有广谱抗菌效应，并具有溶液稳定性，故也被一些实验室使用，特别是当有低水平的污染存在时更是这样。以上这些试剂对霉菌与酵母菌的污染均无效。
五、抗有丝分裂剂
某些DNA合成抑制剂对分裂细胞有毒，但对没有DNA合成的细胞仅有轻微影响。由于神经元通常缺乏DNA合成能力，因此对抗有丝分裂剂没有多大反应。这样的试剂常常用于神经元的培养，以消除或减少非神经元群体。若要杀死所有的非神经元细胞，可以先加入血清或生长因子来保证有高比例的非神经元细胞进行DNA合成，此时再加入抗有丝分裂剂。但是，某些细胞在它的细胞周期的某些时相时对抗有丝分裂剂是不敏感的。不过，可以重复的将抗有丝分裂剂使用于增殖的细胞群体。在CNS神经元的培养中抗有丝分裂剂常常在星形细胞形成单层后加入，此时，星形细胞由于接触抑制而终止了DNA的合成（即细胞停止增殖），它们不会因抗有丝分裂剂的加入而死亡。原代培养中用这种方法阻止成纤维细胞的过度增殖是十分必要的。有两种抗有丝分裂剂常用于神经元的培养：Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制剂，一般使用浓度为～10μM。尿苷（10μM）也常使用，可阻止不分裂细胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用浓度为5～50μM。使用任何一种抗有丝分裂剂，都必须考虑它的神经原毒性，应该确定最低效应的使用浓度。阿糖胞苷在很低的浓度下，也会对某些种类的神经元有毒性，可以造成特定神经原的死亡。其他的抗有丝分裂剂尚未表现出这种毒性。
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几种细胞混合培养特点及应用高征摘要：混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。
根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。
本文介绍了几种常见的细胞混合培养方法及其特点。
关键字：混合细胞；培养；淋巴细胞；兔成骨细胞；兔骨髓基质干细胞；肝癌细胞；大鼠皮层神经元细胞；大鼠胶质细胞；表皮细胞；纤维细胞；U937；鼻咽癌细胞混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。
根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。
1.混合淋巴细胞培养1.1混合淋巴细胞培养定义混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture）是指同种异体的淋巴细胞在体外共同培养的现象。
若一方(通常为供者)淋巴细胞经灭活处理，则称“单向混合淋巴细胞培养(one-way mixed lymphocyte culture)”。
两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC)。
若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。
1.2混合淋巴细胞培养用途混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR) 常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。
由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。
两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。
如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell，HTC)作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。
若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。
EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。
2.混合细胞培养在病毒学和肿瘤学研究中的应用2.1混合细胞培养的具体应用方法根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行棍合培养。
待细胞形成致密的单层后接种病毒，研究蚀斑形成的条件，或以受染病毒的病人或尸解组织经胰酶消化成单个细胞后再与其它种类的敏感细胞进行棍合培养，分离病毒，或以正常人体细胞与癌肿病人的肿瘤细胞混合培养、观察细胞之间的相互影响，由此达到实验者所要研究的目的。
2.2 研究进展研究病毒蚀斑的形成在探索影响流感病毒蚀斑形成的因素时，曾观察到流感病毒可对鸡胚肾单层细胞引起细胞病变，但鸡胚肾单层细胞在培养液中维持的时间短暂，尤其在琼脂培养基复盖下细胞极易团缩，细胞间隙加大，故不易形成明显的流感病毒蚀斑。
虽有关于流感病毒在鸡胚肾细胞上形成蚀斑的简报幻，但实验不稳定，数据不足，似乎不能重复。
皮肌细胞对流感病毒虽不如鸡胚肾细胞敏感，但在琼脂培养基复盖下维持时间较长。
综合鸡胚肾细胞对流感病毒比鸡胚皮刃细胞敏感以及鸡胚皮肌细胞比鸡胚肾细胞在琼脂培养基下维持时间较长的特点，将鸡胚肾细胞与鸡胚皮肌细胞各以适当的比例进行混合培养，结果流感病毒在此混合培养细胞上形成明显的蚀斑。
在鸡胚肾与鸡胚皮肌混合细胞上形成的流感病毒蚀斑(直径2~3mm)比鸡胚皮肌细胞上形成的蚀斑(直径1~Zmm)大而清楚。
前者的蚀斑形成。
单位(PFU)比后者高达100倍。
试验证明采用鸡胚肾与鸡胚皮肌混合细胞，既保留了鸡胚肾细胞对流感病毒较为敏感的特点，又在与鸡胚皮肌细胞棍合培养时延长了鸡胚肾细胞在琼脂培养丛复盖下维持的时间，保证蚀斑的形成。
实验结果能反复重演且稳定。
运用这一混合细胞培养技术对甲型流感病毒WS株、原甲型的PRS、亚甲型的洛57一4、亚洲甲卫不敏感相的贵57一2、兰生60一2以及乙型的Lee等株均能成功地在鸡胚肾与鸡胚皮肌棍合细胞。
_L形成蚀斑。
3. 兔成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养3.1 研究背景对骨髓基质干细胞进行改造，使其在保持快速生长的同时向成骨细胞方向分化是目前国内外研究的热点。
实验发现，成熟的成骨细胞可以通过细胞间的直接接触作用促进骨髓基质干细胞增殖，此外成骨细胞可产生多种生长因子促进其骨髓基质干细胞的增殖、分化。
但骨髓基质干细胞通过诱导向成骨细胞分化后，难以再与原有的成骨细胞区分开。
3.2 试验方法实验组：取第3代成骨细胞与第3 代骨髓基质干细胞以1∶1 比例直接混合培养，一定时间后测定细胞的增殖及成骨情况。
对照组：分别取上述两种细胞在与混合培养细胞完全相同的条件下单独进行培养，按测定混合培养细胞相同的方法分别测定该两种细胞的相应指标。
将混合培养细胞与同期两种对照细胞相应指标的平均值进行比较。
3.3 试验结果在细胞增殖和细胞成骨能力等方面均是实验组明显高于相应的平均值。
3.4 试验结论将第3代成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养，可以使其中一种或两种细胞增殖加快，成骨能力加强。
该方法可能成为一种新的骨组织工程种子细胞的获取方法。
4. 淋巴细胞与肝癌细胞混合培养4.1 试验目的通过肝癌细胞和淋巴细胞混合培养，体外诱导产生高活性的肝癌特异性细胞T淋巴细胞(H S CTL)。
4.2 试验方法采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养技术，在IL 1，IL 2 ，IL 4和IL 6刺激下，诱导产生H S CTL ，应用间接免疫荧光法和51Cr释放法检测其对靶细胞的杀伤效应。
4.3 试验结果H S CTL与自身LAK相比，CD3+，CD4+和CD8+细胞明显增多，抗肿瘤效应明显增强。
4.4 试验结论采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养同时应用白细胞介素可获得大量扩增的高活性的H S CTL。
5. 大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养5.1 试验目的建立大鼠皮层神经元胶质细胞混合培养牵张损伤模型。
5.2试验方法提取出生时间24h到48h的SD大鼠大脑皮层组织行神经元和胶质细胞原代混合培养，根据Ellis方法采用CICⅡ型细胞损伤装置建立大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养牵张损伤模型，根据硅胶膜的变形距离将实验组分为轻度组、中度组和重度组。
同时设立对照组，不作牵张损伤。
分别在不同时间进行神经细胞的PrI染色和测定培养上清液中的LDH含量，以确定损伤的程度。
5.3试验结果随着牵张损伤程度加重，PrI红染细胞数逐渐增多，同时细胞培养液中LDH 释放量也逐渐增多。
5.4试验结论成功建立了大鼠皮层神经元胶质细胞体外牵张损伤模型，可分别模拟轻、中、重度损伤。
使用方便，可重复性好，可用于颅脑创伤的病理机制和药物作用的进一步研究。
6. 表皮细胞、纤维细胞与淋巴细胞混合培养6.1 研究目的异体、自体皮肤混合移植是提高大面积三度烧伤治愈率的有效方法。
根据烧伤后皮肤混合移植的病理生理变化和组织学特点的研究，通过表皮细胞、纤维细胞与淋巴细胞混合培养，进一步证实人体表皮细胞的组织特异性和较强的抗原性。
根据这个特点，可在今后皮肤混合移植的过程中识别异体表皮，从而可更深入地探讨混合移植的排异规律。
6.2试验原理皮肤表皮细胞、淋巴细胞混合培养与淋巴细胞混合培养一样，它们之间的反应强度均能反映出组织相容性差异程度。
组织相容性相同的同卵双生间反应均为阴性，皮肤移植能长期存活，组织相容性差异越大，反应亦越强，皮肤移植存活时间越短。
7.U937与鼻咽癌细胞的混合培养7.1 试验背景U937是一种前单核细胞，其主要是以悬浮生长为主，细胞形态成圆球状，表面光滑，没有突起。
在PMA、内毒素或生长因子的刺激下细胞可由悬浮状态衍变为贴壁生长，细胞形态由圆球状变化为多边型，细胞表面有突起伸出。
本实验采用流式细胞术检测了U937与鼻咽癌细胞CNE- 2混合培养对其CD36表达的影响。
7.2 试验结果U937与CNE- 2混合培养以促进U937对CD36的表达，共同培养24小时，CD36表达显著增加。
7.3 试验结论前单核细胞与肿瘤细胞混合培养可促进前单核细胞向单核细胞的分化。
参考文献[1] 张汉荆.混合细胞培养在病毒学和肿瘤学研究中的应用[J]. 国外医学. 1986年06期.[2] 蔡国锋,章庆国,黄开. 兔成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养的实验研究[J]. 现代医学. 2005年04期[3] 李均乐,叶小鸣,程权永,等. 淋巴细胞与肝癌细胞混合培养诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的形成[J]. 中华普通外科杂志. 2003年03期.[4] 范东东,钟春龙,夏蓉,等. 大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养牵张损伤模型的建立[J]. 立体定向和功能性神经外科杂志. 2010年04期.[5] 李映月,韦巧妹,杨之骏. 表皮细胞、纤维细胞与淋巴细胞混合培养-异体、自体皮肤混合移植的研究[J]. 上海医学. 1981年第05期.[6] 冷启新,李瑞祥,刘执玉. U937与鼻咽癌细胞混合培养对其CD36表达的影响[J].四川解剖学杂志. 2000年02期.。