几种细胞混合培养特点及应用

几种细胞混合培养特点及应用

高征

摘要：混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。本文介绍了几种常见的细胞混合培养方法及其特点。

关键字：混合细胞；培养；淋巴细胞；兔成骨细胞；兔骨髓基质干细胞；肝癌细胞；大鼠皮层神经元细胞；大鼠胶质细胞；表皮细胞；纤维细胞；U937；鼻咽癌细胞

混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。

1.混合淋巴细胞培养

1.1混合淋巴细胞培养定义

混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture）是指同种异体的淋巴细胞在体外共同培养的现象。若一方(通常为供者)淋巴细胞经灭活处理，则称“单向混合淋巴细胞培养(one-way mixed lymphocyte culture)”。

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC)。若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。

1.2混合淋巴细胞培养用途

混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR) 常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多

的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。

两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell，HTC)作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

2.混合细胞培养在病毒学和肿瘤学研究中的应用

2.1混合细胞培养的具体应用方法

根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行棍合培养。待细胞形成致密的单层后接种病毒，研究蚀斑形成的条件，或以受染病毒的病人或尸解组织经胰酶消化成单个细胞后再与其它种类的敏感细胞进行棍合培养，分离病毒，或以正常人体细胞与癌肿病人的肿瘤细胞混合培养、观察细胞之间的相互影响，由此达到实验者所要研究的目的。

2.2 研究进展

研究病毒蚀斑的形成在探索影响流感病毒蚀斑形成的因素时，曾观察到流感病毒可对鸡胚肾单层细胞引起细胞病变，但鸡胚肾单层细胞在培养液中维持的时间短暂，尤其在琼脂培养基复盖下细胞极易团缩，细胞间隙加大，故不易形成明显的流感病毒蚀斑。虽有关于流感病毒在鸡胚肾细胞上形成蚀斑的简报幻，但实验不稳定，数据不足，似乎不能重复。

皮肌细胞对流感病毒虽不如鸡胚肾细胞敏感，但在琼脂培养基复盖下维持时间较长。综合鸡胚肾细胞对流感病毒比鸡胚皮刃细胞敏感以及鸡胚皮肌细胞比鸡胚肾细胞在琼脂培养基下维持时间较长的特点，将鸡胚肾细胞与鸡胚皮肌细胞各以适当的比例进行混合培养，结果流感病毒在此混合培养细胞上形成明显的蚀斑。在鸡胚肾与鸡胚皮肌混合细胞上形成的流感病毒蚀斑(直径2~3mm)比鸡胚皮肌细胞上形成的蚀斑(直径1~Zmm)大而清楚。前者的蚀斑形成。

单位(PFU)比后者高达100倍。试验证明采用鸡胚肾与鸡胚皮肌混合细胞，

既保留了鸡胚肾细胞对流感病毒较为敏感的特点，又在与鸡胚皮肌细胞棍合培养时延长了鸡胚肾细胞在琼脂培养丛复盖下维持的时间，保证蚀斑的形成。实验结果能反复重演且稳定。

运用这一混合细胞培养技术对甲型流感病毒WS株、原甲型的PRS、亚甲型的洛57一4、亚洲甲卫不敏感相的贵57一2、兰生60一2以及乙型的Lee等株均能成功地在鸡胚肾与鸡胚皮肌棍合细胞。_L形成蚀斑。

3. 兔成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养

3.1 研究背景

对骨髓基质干细胞进行改造，使其在保持快速生长的同时向成骨细胞方向分化是目前国内外研究的热点。实验发现，成熟的成骨细胞可以通过细胞间的直接接触作用促进骨髓基质干细胞增殖，此外成骨细胞可产生多种生长因子促进其骨髓基质干细胞的增殖、分化。但骨髓基质干细胞通过诱导向成骨细胞分化后，难以再与原有的成骨细胞区分开。

3.2 试验方法

实验组：取第3代成骨细胞与第3 代骨髓基质干细胞以1∶1 比例直接混合培养，一定时间后测定细胞的增殖及成骨情况。

对照组：分别取上述两种细胞在与混合培养细胞完全相同的条件下单独进行培养，按测定混合培养细胞相同的方法分别测定该两种细胞的相应指标。

将混合培养细胞与同期两种对照细胞相应指标的平均值进行比较。

3.3 试验结果

在细胞增殖和细胞成骨能力等方面均是实验组明显高于相应的平均值。

3.4 试验结论

将第3代成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养，可以使其中一种或两种细胞增殖加快，成骨能力加强。该方法可能成为一种新的骨组织工程种子细胞的获取方法。

4. 淋巴细胞与肝癌细胞混合培养

4.1 试验目的

通过肝癌细胞和淋巴细胞混合培养，体外诱导产生高活性的肝癌特异性细胞T淋巴细胞(H S CTL)。

4.2 试验方法

采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养技术，在IL 1，IL 2 ，IL 4和IL 6刺激下，诱导产生H S CTL ，应用间接免疫荧光法和51Cr释放法检测其对靶细胞的杀伤效应。

4.3 试验结果

H S CTL与自身LAK相比，CD3+，CD4+和CD8+细胞明显增多，抗肿瘤效应明显增强。

4.4 试验结论

采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养同时应用白细胞介素可获得大量扩增的高活性的H S CTL。

5. 大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养

5.1 试验目的

建立大鼠皮层神经元胶质细胞混合培养牵张损伤模型。

5.2试验方法

提取出生时间24h到48h的SD大鼠大脑皮层组织行神经元和胶质细胞原代混合培养，根据Ellis方法采用CICⅡ型细胞损伤装置建立大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养牵张损伤模型，根据硅胶膜的变形距离将实验组分为轻度组、中度组和重度组。同时设立对照组，不作牵张损伤。分别在不同时间进行神经细胞的PrI染色和测定培养上清液中的LDH含量，以确定损伤的程度。

5.3试验结果

随着牵张损伤程度加重，PrI红染细胞数逐渐增多，同时细胞培养液中LDH 释放量也逐渐增多。

5.4试验结论

成功建立了大鼠皮层神经元胶质细胞体外牵张损伤模型，可分别模拟轻、中、重度损伤。使用方便，可重复性好，可用于颅脑创伤的病理机制和药物作用的进