腺病毒转染细胞步骤及方法
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒基因工程实验方法学实验讲义
《腺病毒基因工程的实验方法学》实验手册华中科技大学基础医学院病原生物学系2014年3月课程目的：向基础、预防、药学和临床专业，从事新药和疫苗研究、基因治疗和疾病致病机制研究的研究生传授最适用的实验方法和技术。
课程特点：以重组腺病毒技术建立实验技术平台，选课学员可全面掌握病毒基因工程技术原理和重组腺病毒基因工程技术，并了解SFDA对相关技术产品的政策要求，从基础到临床应用的综合、系统角度考虑和设计科研课题，有的放矢地进行实战培训，为进入科研提前做好相关准备。
课程设计：强调跨学科技术的综合性学习（涉及微生物学、病毒学、分子生物学、细胞生物学）强调基础研究与临床实践。
开课方式：理论讲授和实践操作相结合。
利用微生物学室的科研条件（师资、场地、仪器设备、药品试剂等），完全按正式的科研要求进行严格训练。
背景介绍《腺病毒基因工程的实验方法学》课程包含的不同种类病毒载体和及其多样性的转基因技术原理。
不同种类病毒载体可分为三类：一、质粒型载体（含病毒复制子的真核细胞表达质粒，可经物理或化学方法转染细胞后并在细胞中复制或表达，不产生感染性病毒颗粒）。
二、假型病毒载体（含有病毒复制子和病毒包装所必需的顺式作用序列的质粒，转染提供病毒反式作用序列的细胞或在辅助病毒感染细胞的情况下，可被包装成与亲代病毒外形一致、但核酸特点不同的假型病毒，具有的感染性而缺乏复制能力）。
三、重组型病毒载体（将外源基因的表达盒插入到携带病毒非必需功能基因片断的转移载体中，转染野生型病毒感染的细胞并同源重组、或直接体外基因操作将外源基因的表达盒插入到野生型病毒基因组中的特定位置，获得经过修饰的病毒基因组在细胞内表达和复制，产生具有新遗传性状的感染性病毒颗粒）。
本课程的的实践教学内容，以构建和鉴定表达颗粒溶素的复制缺陷型重组腺病毒的内容为基础，进行举例并实践其中涉及的相关内容。
本实验构建的复制缺陷型重组腺病毒属于上述假型病毒载体。
具体原理参见教材，宏观上分为以下步骤，在本课程将这些步骤中涉及的技术和实验，分别集中进行在不同专题进行实验。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33。
2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44。
1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1。
1 克隆的一般原则44。
1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54。
2.1 共转化的一般原则54。
2。
2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64。
4 AdEasyTM重组子转染QBI—293A细胞6 4.4。
1 细胞铺板64。
4。
2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85。
1 QBI-293A细胞培养85.1。
1 QBI—293A细胞的初始培养85。
1.2 QBI—293A细胞的维持培养和增殖8 5。
1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2。
1 感染QBI—293A细胞95。
2.2 病毒空斑形成95.2。
3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105。
4.1 X-Gal染色11 5。
5 重组腺病毒的筛选和纯化115。
5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5。
2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5。
3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145。
5。
6 免疫测定145。
5。
7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI—293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5。
7.1 不连续密度梯度离心175.7。
2 连续密度梯度离心175.7。
3 病毒溶液去盐和浓集175。
8 病毒滴度测定185。
8。
1 O。
D。
260 nm (VP/ml) 195。
8。
腺病毒的包装与制备
腺病毒的包装与制备1 转染AD293第一轮:1. pAd质粒转染AD293，可使用六孔板或60mm皿。
当细胞出现明显细胞病变效应(CPE)时回收细胞，(吸去培养基用PBS洗一遍，若细胞已经悬浮则取所有培养基低速离心，细胞用PBS洗一遍)，并用0.5ml PBS重悬。
置于1.5ml microcentrifuge tube中2. 裂解细胞:进行四轮-80?/37?3. 12000g 10min 室温离心，将上清移入新的离心管中。
-80?保存。
第二轮:1. 取第一轮的病毒液50μl(或设置梯度)感染100mm皿。
(如细胞第一天就出现病变则用量太高，一般应在第一天少量病变，第二三天全部病变)。
重复第一轮方法裂解细胞并收集腺病毒，终体积1ml第三轮取第二轮的病毒感染4个150mm皿(100μl/皿或设置梯度)，并用CsCl密度梯度法纯化腺病毒。
2 透析Transfecting AD-293 Cells以Lipofectamine? 2000说明书为本，更改了细胞密度和DNA量51. One day before transfection, plate 4x 10 cells per 6-wellofgrowth medium without antibiotics so that cells will be 50-70% confluent at the time of transfection. 2. For each transfection sample, prepare complexes as follows:a. Dilute 4μg linearized DNA in 250 μl of Opti-MEM I Reduced Serum Medium without serum (or other medium without serum). Mix gently.b. Mix Lipofectamine? 2000 gently before use, then dilute 10μl lipofectaminein250 μl of Opti-MEM I Medium. Incubate for 5 minutes at room temperature. Note:Proceed to Step c within 25 minutes.c. After the 5 minute incubation, combine the diluted DNA withdilutedLipofectamine? 2000 (total volume = 100 μl). Mix gently andincubate for 20 minutes at room temperature (solution may appear cloudy). Note:Complexes are stable for 6 hours at room temperature. 3. Add the 500 μl of complexes to each well containing cells and medium. Mix gently by rocking the plate back and forth.4. Incubate cells at 37?C in a CO2 incubator for 17-10days prior to testing for GFP. Medium may be changed after 4-6 hours.Preparing the Primary Viral Stocks1. Prepare a small dry ice-methanol bath and a small 37?C water bath and placethem in the laminar flow hood.2. Carefully remove growth medium from adenovirus-producing AD-293 plates andwash the cells once with PBS. Take care not to lose any clusters of floating andpartially attached cells during this process.Note :If the cells are already mostly detached, pipet up and down gently in the growth medium until cells become completely resuspended. Transfer cell suspension to a screw cap centrifuge tube and pellet the cells by low speed centrifugation. Aspirate medium, and wash the cells once with 0.5 ml of sterile PBS. Resuspend the cell pellet in a fresh 0.5 ml sterile PBS (per 60-mM dish) and proceed to Step 5. 3. Add 0.5 ml of PBS to each plate of cells to be harvested. Collect the cells by holding the plate at an angle and scraping the cells into the pool of PBS with a cell lifter.4. Transfer the cell suspension to a 1.7-ml screw-capmicrocentrifuge tube. If duplicate DNA samples were transfected, the cells from duplicate samples may be combined in the microcentrifuge tube at this stage.5. Subject the cell suspension to four rounds of freeze/thaw by alternating the tubes between the dry ice-methanol bath and the 37?C water bath,vortexing briefly after each thaw.Note :Each freeze and each thaw will require approximately 5 minutes’ incubationtime.6. Collect cellular debris by microcentrifugation at 12,000 × g for 10 minutes at room temperature.7. Transfer the supernatant (primary virus stock) to a fresh screw-cap microcentrifuge tube. Viral stocks can be stored for more than one year at –80?C.腺病毒扩增1. Plate 5 X 106 QBI-293A cells in a 100 mm culture dish in 10 mL DMEM 5%.2. Remove 50μl(100μl) of the viral stock of the first amplification, complete to 1 mL with DMEM 5% and mix. This dilution will give a MOI of about 5.3. Remove the medium from the 100 mm dish, delicately add the viral particle mix onto the cells taking care not to disturb the monolayer and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2.4. Add 9 mL of DMEM 5%.5. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 72 hours. At this point you should have between 5 x91010 and 5 x 10 VP in 10 mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired.If this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume or about 1mL. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8. 6. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C until completely frozen/37?C until fully thawed. 7. Pellet cell debris in a sterile 15 mL conical tube. Centrifuge at maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes, remove and store the supernatant in another sterile 15 mL conical tube at -20?C or -80?C.8. Plate 3 x 107 QBI-293A cells in 3 x 175 cm2(150mm dish) culture flasks (1 X 107cells/flask).9. Mix 3 mL of cell lysate supernatant from step 7 with 12 mL DMEM 5%. Remove the mediumfrom the flask, then delicately add 5 mL of supernatant mix perflask on the cells, taking care notto disturb the monolayer, and spread by slowly rocking the dish 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.10. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.11. Incubate at 37?C in a CO2 incubator for 48 to 72 hours. At this point you should have between 3 x 1010 and 3 x 1011 VP in 90mL of DMEM 5%. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. Again, if this quantity of virus is sufficient, you can immediately proceed to the titration step (section 5.8). In this case, collect the cells in a centrifuge tube, spin at 600 x g for 5 min, discard supernatant and resuspend the cell pellet in a minimal volume, typically 1:10 of the original volume. Then proceed with 3 freeze/thaw cycles (-20?C / 37?C), spin at maximum speed on a tabletop centrifuge to remove cellular debris, and collect the supernatant. Titer as described in section 5.8.12. Perform three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C.13. Pellet cell debris in a sterile 50 mL conical tube. Centrifugeat maximum speed in a tabletop centrifuge for 10 minutes. Remove and store the supernatant.14. Plate 3 x 108 QBI-293A cells in 30 x 175 cm2 culture flasks (1 X 107 cells/flask). 15. Mix 45 mL of cell lysate supernatant from step 13 with 105 mL DMEM 5%. Remove the medium from the 175 cm2 flasks, pour 5 mL of the cell lysate mix per flask on the cells, taking care not to disturb the cell monolayer, and spread by slowly rocking the flask 3 times in a cross shape. Incubate for 90 minutes at 37?C in 5% CO2. This should give a MOI of 25.16. Complete to 30 mL/flask with DMEM 5%.17. Put the cells back at 37?C in a CO2 incubator for 2-3 days. You should now have between 3 x 111210 to 3 x 10 VP. Perform a MOI test (section 5.3) to estimate the titer if desired. If you want to produce viral particles, first collect and pellet the infected cells, then resuspend in 5 mL DMEM 5%. Extract viral particles by performing three freeze/thaw cycles at -20?C/37?C; pellet cell debris by centrifugation. At this point you should have between 3 x 1011 to 3 x 1012 recombinant virus particles in 5 mL DMEM 5%, for a final VP/mL of 6 X 1010 to 6 x 1011. Your viral particle pre-stock will now be ready to be titrated directly, asdescribed in section 5.8, or purified, using standard cesiumchloride gradients (section 5.7). Further amplifying your recombinant virus on 109 cells will result in the production of a viral stock, while amplification on 1 x 1010 cells is technically a viral production. You should never use the virus from a production stock to infect additional cells because you will at the same time significantly increase the amount of RCA generated. Instead, use virus from an earlieramplification steps such as the stock, pre-stock or pre-amplification in order to produce more virus particles. You can eventually go back to the purified eluted plaque in order to minimize RCAproduction as much as possible. If a purified eluted plaque is no longer available, you will have to perform a plaque assay of your recombinant virus and start the amplification step again from a purified eluted plaque, after analysis of your clone. If more material than produced in the first 4 passages(see Table 5) is needed, remember to always return to the previous passage as your source for virus. For example, use virus from passage 2 in order to generate passage 3. Note that once you have depleted all of your viruses from passage 2, you must use virus from the first amplification in order to create a new passage 2. Proceeding in this fashion will keep the level of RCA as low as possible. If you want to overexpress a protein, pellet the cells and extract the protein according to its characteristics. Typically, about 1-5 mg of a well-expressed protein can beretrieved from the pellet. It is recommended to first determine the best time pi to extract the protein on a smallscale, then to proceed with large-scale protein production.CsCl密度梯度法纯化腺病毒1 Add either purified Ad or unpurified Ad (medium) to monolayer culture cells (50-100pfu/cell)2 If using one T150 flask total 10-12 ml medium is used to cover the cells and allow cells to culture for one day3 Cells should look swollen and part of the cells may be floating. Another 10ml of complete medium is added into cells and allow another day culture (36-40hrs infection period )4 All of the cells should be floating. Collect all the cells and resuspend them in 0.5-1ml of complete medium . Also save the culture medium and store at -70?.5 Freeze in methanol/dry ice bath and thaw at 37?. Repeat for 3-4times6 Spin at high speed for 5min.7 Make 40% and 15% CsCl in TBS, PH8.1(50ml each and keep at 4?)8 Make CsCl gradient solution(5ml of 15% and 4.5ml of 40%) in Beckman centrifuge tube (14*89mm, which frist sw41 rotor)9 Load the supernatant from step 6 on the top of gradient10 Centrifuge at 4? 30000rpm for 16hr11 Two bands can be seen: the faint top band (mainly defective Ad) and the lower Ad band. Only the lower band is collected.12 the Ad is dialyzed in TBS PH8.1 for 1hr and then in TBS containing 10% glycol twice (1hr each time)13 Determine the Ad concentration, aliquot into microfuge tube(50μl each )and store at -70?TBS: tris 10mM, NaCl 0.9%, PH8.115% CsCl(50ml): 9.085g CsCl+47.69ml TBS40% CsCl(50ml): 28.45g CsCl+42.7ml TBSDialyze:1 透析袋: MW 8000-144002 透析缓冲液: TBS PH8.1 灭菌甘油步骤:1冲洗透析袋，如果是蛋白则需NaHCO-NaEDTA煮沸处理后用蒸馏水洗。
腺病毒载体操作手册1407
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
腺病毒转染细胞步骤及方法
腺病毒转染细胞步骤及方法腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒不仅可以作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al., 1998a,b）。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。
运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因此更为安全。
二、腺病毒载体优势1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因转导和蛋白表达；3)包装外源基因的片段大，高达8kb；4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。
三、流程描述制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 进行共转染293A 细胞，转3染6小时后更换为完全培养基，培养7-15 天，每3天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000 rpm 离心10 分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，腺病毒的大量扩增，而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液，在293A 细胞中测定并标定病毒滴度。
在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。
四、具体步骤细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/ml （一般稀释倍数为100 倍），在0.1 ml 的细胞悬液中加入0.1 ml 的0.4%的台盼蓝溶液。
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medi um DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺相关病毒转染细胞实验流程
腺相关病毒转染细胞实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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腺病毒介导TGF-β1基因转染兔骺板软骨细胞的实验探究
腺病毒介导TGF-β1基因转染兔骺板软骨细胞的实验探究目录一、中文摘要 (2)二、英文摘要 (4)三．论文正文1、前言 (7)2、材料和方法 (9)3、实验结果 (17)4、讨论 (20)四、结论 (24)五、附图 (29)六、论文参考文献 (25)七、中英文缩略词表 (39)八、综述1、综述正文 (42)2、参考文献 (47)腺病毒介导TGF-β1基因转染兔骺板软骨细胞的实验研究中文摘要目的：通过腺病毒介导TGF-β1基因转染兔骺板软骨细胞(Epiphyseal Chondrocytes，ECs)，观察TGF-β1的表达及ECs合成和分泌软骨基质的情况，为构建新型的组织工程骺板软骨提供实验依据。
方法：1.利用3周龄新西兰大白兔股骨远端骺板软骨，分离出ECs 并传代培养，观察ECs生长情况并鉴定。
选用第3代ECs进入下一步基因转染。
2. 构建携带TGF-β1基因的腺病毒载体。
3.分3组进行转染：分别为TGF-β1载体组、空载体组和空白组。
转染后在倒置显微镜下观察各组细胞形态以及增殖情况；并在荧光显微镜下观察各组病毒转染情况，同时计算转染效率。
利用MTT法检测重组腺病毒转染后的ECs增殖能力是否有明显变化。
应用ELISA法检测转染后收集到的各组培养液中的TGF-β1浓度。
应用Ⅱ型胶原免疫荧光评价转染后细胞的成软骨能力。
采用RT-PCR检测各组细胞TGF-β1 mRNA的表达情况，并用Western-blot检测各组细胞Ⅱ型胶原和TGF-β1蛋白表达情况。
结果：1、成功的从兔骺板软骨中分离出ECs，并进行了传代培养及鉴定。
2、在荧光显微镜下观察各组转染后细胞，发现TGF-β1载体组和空载体组有较多荧光细胞出现，而空白组始终没有出现荧光细胞，细胞转染成功。
通过MTT法检测证明，腺病毒介导TGF-β1基因转染后的ECs的增殖能力短期内没有影响。
3、转染14d后，TGF-β1载体组免疫荧光观察到Ⅱ型胶原较对照组明显增强。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，公司网址：有需要请联系丘先生病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C 保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
一种腺病毒转染类器官的方法[发明专利]
![一种腺病毒转染类器官的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/39e425e65ebfc77da26925c52cc58bd63186937d.png)
专利名称：一种腺病毒转染类器官的方法
专利类型：发明专利
发明人：程亦榕,徐小雅,时强,陈章涵,钟芸诗,周平红,李冰申请号：CN202111340984.4
申请日：20211112
公开号：CN114107388A
公开日：
20220301
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种腺病毒转染类器官的方法，包括以下步骤：消化：对类器官进行消化处理；转染：消化处理后的类器官中加入腺病毒的病毒液，孵育；培养：孵育后的类器官离心分离后，进行培养，得到腺病毒转染的类器官。
与现有技术相比，本发明方法不需要细胞因子的加入，降低了转染成本；本发明方法可以使用腺病毒转染，可转染的片段长度更长；本发明方法无需购置额外的设备，可运用普通的冰冻离心机和培养箱完成转染。
申请人：复旦大学附属中山医院
地址：200032 上海市徐汇区枫林路180号
国籍：CN
代理机构：上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：褚明伟
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腺病毒转染细胞步骤及方法腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒不仅可以作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al., 1998a,b）。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。
运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因此更为安全。
二、腺病毒载体优势1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因转导和蛋白表达；3)包装外源基因的片段大，高达8kb；4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。
三、流程描述制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 进行共转染293A 细胞，转3染6小时后更换为完全培养基，培养7-15 天，每3天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000 rpm 离心10 分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，腺病毒的大量扩增，而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液，在293A 细胞中测定并标定病毒滴度。
在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。
四、具体步骤细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/ml （一般稀释倍数为100 倍），在0.1 ml 的细胞悬液中加入0.1 ml 的0.4%的台盼蓝溶液。
轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。
活细胞排斥台盼蓝，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
细胞株的冻存1)取培养2～3 天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml。
2)在1 ml 细胞冻存管中加入0.5 ml 细胞悬液，0.4 ml 小牛血清和0.1 ml 二甲基亚砜（或甘油），混匀后密封。
置4°C，1 小时，-20°C ，2 小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。
细胞复苏1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带防护眼睛和手套。
2)迅速放入盛有37°C 水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
3)2000rpm，离心3分钟。
4)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出上清液，加3ml含10% FBS的DMEM 培养基，吹打均匀，加入到6 cm 培养皿中，置温箱培养。
5)次日更换一次培养液后再继续培养。
细胞传代1)弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。
2)加入2 ml 胰酶消化液，消化1-2 分钟直到细胞完全消化下来。
3)加入含10%胎牛血清和100 U/ml 双抗的DMEM 培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。
4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
病毒包装1)293A细胞在10cm培养皿中培养至80-90%融合时，接种6cm培养皿。
2)倾去培养液，用1mlD-Hank’ssolution洗涤细胞两次。
3)加入1 ml Trypsin-EDTAsolution，混匀后，37ºC放置2-3 分钟。
4)小心吸去胰酶溶液，加入2ml 含10%FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
5)将0.5ml细胞悬液接种6 cm培养皿，加入4 ml含10% FBS 的DMEM培养液，混匀后37ºC 5% CO2 培养过夜。
6)在一支无菌的1.5ml离心管中加入0.5ml无血清DMEM，按比例加入含客户目的序列的穿梭质粒和骨架质粒，混匀，取另一支无菌的1.5 ml 离心管，加入0.5ml无血清DMEM，再加入10-15μlRNAi-Mate，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20-25分钟。
7)除去6cm培养皿中的培养液，加入3ml 无血清的DMEM培养液。
8)将转染混合物逐滴加入6 cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37ºC5% CO2培养箱中温育4-6小时。
9)吸弃转染液，加入4ml 含10% FBS 的DMEM 培养液。
37ºC5% CO2继续培养。
病毒收集1)孵育7天后，检查是否存在空斑。
如果可以收获（剩余>50%的细胞），然后收集病毒裂解原液。
如果不能收获，添加1ml完全培养基，继续在CO2，37°C 下孵育。
第10天，检查是否存在空斑。
如果可以收获（剩余>50%的细胞），然后收集病毒裂解原液。
如果不能收获，添加1ml完全培养基，继续在CO2，37°C 下孵育。
持续检查是否存在空斑，但不要超过15 天。
3)用5或10ml无菌吸管将含腺病毒的细胞从皿上吹下，将细胞和培养基转移到一个15ml管中，必要时使用细胞刮。
4)37°C 水浴和干冰-甲醇浴，每次10分钟，反复冻融三次释放病毒。
5)室温下，细胞溶胞产物在台式离心机中以3000 rpm离心15 分钟以沉淀细胞碎片。
6)分装并-80°C 储存病毒裂解原液（初始病毒原料）。
病毒扩增1)感染前一天，按3-5×106个细胞铺一个15 cm 培养皿。
2)加入50％的上述病毒裂解原液至培养基。
我们建议使用大于>0.5 PFU（空斑形成单位）或足够的病毒使细胞在48 h 内表现细胞病变效应（CPEs）。
3)在感染24-48 小时，每天两次显微镜下检查细胞病变效应（CPE）。
当CPE 是接近完成（即大多数细胞呈葡萄球状，但尚未脱离瓶底）时，用移液管将感染的细胞从皿上吹到培养基中，收获细胞。
4)合并感染的细胞和培养基。
在1000 g 下离心5 分钟沉淀细胞。
吸弃上清液，用培养基或10 mM Tris，pH8.0，100 mM NaCl 重悬细胞（每15cm 培养皿0.25-0.5 ml）。
5)反复冻融三次释放腺病毒，3000 g，10 分钟离心，以沉淀细胞碎片。
弃去沉淀，保存病毒上清物。
6)病毒上清可以储存在-80°C，或立即纯化或滴度检测。
病毒纯化1)病毒纯化采用CsCl 密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CsCl 梯度的制备方法如下：加入2.0 ml 密度为1.40 g/ml 的CsCl 溶液，然后缓慢加入3.0 ml 密度为1.30 g/ml的CsCl 溶液，再加入5 ml 的病毒悬浮液。
2)20000 rpm，室温离心2 小时3)收集密度在1.30 g/ml 和1.40 g/ml 之间的病毒条带至透析袋中（透析袋使用前用10 mM 的EDTA-Na2煮沸10 min）。
在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1MTris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl2定容至1L）中。
4)4°C 搅拌透析过夜，中间换一次透析液。
收集病毒。
病毒保存1)一周内使用则置于4度冰箱保存。
2)如需长时间存放需置于-80°C 甚至液氮保存。
病毒滴度检测1)采用微量全细胞病变法检测病毒滴度（参考复旦大学遗传学研究所方法），取96 孔板1 块，每孔加入293 细胞104个，加液量100 μl，置孵箱培养24 h。
待测病毒用DMEM 全培养基稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度。
吸去上清后，分别加入每个稀释度的病毒液体，每孔100 μl，每种样本均作复孔，同时设培养基对照( 不含腺病毒) 。
再置于37°C，5% CO2条件下继续培养36-48 h。
镜检观察CPE 现象，计算病毒滴度。
2)按MOI100 接种腺病毒后72 h，40 倍光镜下观察，293 细胞出现完全CPE。
3)现象：95%-100% 的细胞变圆，其中约60% 脱落浮起，未浮起者有聚集融合现象。
收集并裂解细胞获得待测腺病毒。
4)用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度。
按104/孔293 细胞接种腺病毒后36-48 h，观察到在10-2、10-3稀释度的样本中293 细胞出现完全CPE 现象：90%细胞变圆，10%细胞浮起。
按上述公式计算扩增所得腺病毒的滴度约为5×108PFU/ml。
（通过不同的检测方法，滴度会有差异，并请在试验过程中注意生物安全要求。
）五、使用方法重组腺病毒在细胞水平使用腺病毒有很广泛的宿主范围，可以感染多数人类或者其他哺乳动物细胞系或部分原代细胞。
要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。
用量不足，则不能达到理想的感染效率；用量过大，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。
最佳用量因不同的细胞类型而有显著差异。
为了确定最适病毒用量，可使用携带报告基因的阴性对照腺病毒做预实验。
用不同稀释倍数的阴性对照腺病毒感染细胞，在感染1-3 天后检测感染效率。
通过在显微镜下观察细胞的报告基因的表达情况来确定既达到所需感染效率又不会引起细胞表型变化的病毒浓度范围病毒滴度复核（有限稀释法测定）1)滴度检测前一天，对293A 细胞传代，96 孔板每个孔加入约0.5-10×103个细胞，体积100 μl。
2)第二天，准备7-10 个无菌EP 管，在每个管中加入90 μl 的新鲜完全培养基（高糖DMEM+10% FBS）。
3)取待测定的病毒原液10 μl 加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10 μl 加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管。
4)选取所需的细胞孔，吸弃90 μl 培养液，然后将稀释好的病毒液，从低浓度到高浓度依次加入，放入37°C 5% CO2培养箱中培养。
5)24 小时后，每孔换入100 μl 新鲜培养液，小心操作，不要吹起细胞；放入37°C 5% CO2培养箱中继续培养。
6)1-3 天后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最后二个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数，将得到的数值除以各自相应的稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值（通常以倒数第二个孔中的读数值更为准确）。
靶细胞感染预实验1)试验前一天分别接种3-5×103个目的细胞于96 孔培养板每孔中，所加培养基体积为100 μl。