微生物鉴定之生化实验大全
微生物生理生化鉴定
提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产 气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。应该产 生什么现象？
大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，
大多数能分解乳糖，不产生H2S。应该是什
么现象？
沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳
糖，大多数产生H2S，多数产气。
沙门氏菌的TSI试验
吲哚试验：用来检测细菌对色氨酸的利用能力。
有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色 氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚本身无色，不能 直接观察到，当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂 时，可形成红色的玫瑰吲哚。
吲哚试验
大肠杆菌：+ 产气杆菌： –
阳性 阴性
甲基红试验：用来检测细菌发酵葡萄糖的产 酸能力。当细菌代谢糖大量产酸时，就会使 加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色 （pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红 反应阳性。
1、淀粉的水解试验
菌种：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌。 培养基：固体淀粉培养基。 溶液或试剂：卢戈氏碘液。 器材：无菌培养皿，接种环，试管架。
1、淀粉的水解试验
操作步骤：
（1）无菌操作制备淀粉固定培养基平板。
（2）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌分别在同一平 板不同的部分划线接种，在平板的反面分别写 上菌名。
使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后 形成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂8-10滴。 如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。
H2S试验
尿素酶（Urease）试验：
有些细菌能产生尿素酶， 将尿素分解、产生2个分子 的氨，使培养基变为碱性， 酚红呈粉红色。
1、未接种
微生物生理生化鉴定
1、淀粉的水解试验
微生物对大分子的淀粉不能直接利用，必 须靠产生的胞外淀粉酶将其分解后才能吸 收利用。
微生物的生理生化试验
一、糖类代谢试验
5、β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
二、蛋白质代谢试验
不同细菌分解蛋白质能力不同，可利用不 同氮源来合成菌体蛋白质，可通过检测加 入蛋白质分解后的产物或PH变化来鉴定细 菌。
二、蛋白质代谢试验
1、吲哚（indole）试验（又称靛基质试验） 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸生成的吲哚与试剂 中的二甲氨基苯甲醛作用生成红色的玫瑰吲哚。 方法：纯培养物接种蛋白胨水后35℃培养24-48h沿 管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml观察。 结果：两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴 性。
2、凝固酶试验
目的：常用于鉴别葡萄球菌。 原理：金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维 蛋白原转变为纤维蛋白附着于细菌表面产生凝固。分为 与细胞壁结合的凝固酶（玻片法）与菌体生成后释放在 培养基中的游离凝固酶（试管法）。 玻片法：在玻片上加生理盐水与血浆个一滴，观察凝集 情况 试管法：三只含1：4血浆0.5ml的试管各接种待检菌、 阳性菌株和肉汤阴性菌株，待检菌出现凝固且阴性对照 不凝固为阳性。
三、碳源和氮源利用试验
2、丙二酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：某些细菌将丙二酸盐作为唯一的碳源时，丙 二酸盐被分解成为碳酸钠，使培养基变碱性。 结果：培养基变蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
三、碳源和氮源利用试验
2、丙二酸盐利用试验
三、碳源和氮源利用试验
3、醋酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源同时利用醋酸盐 作为唯一碳源时，分解醋酸钠产生二氧化碳和水与 钠离子结合生成碳酸钠使培养基呈碱性，指示剂由 绿变蓝。 结果：斜面上有菌落生长且培养基变蓝色为阳性。
微生物学检验细菌的生物化学实验
所致疾病
侵袭性疾病 化脓性感染：疖、痈、甲沟炎、中耳炎、 脑膜炎、败血症等 毒素性疾病： 食物中毒、假膜性肠炎等
免疫性
有一定天然免疫力 病后获得的免疫力作用不强、不持久
微生物学检验
细菌鉴定的基本程序
标本
直接涂片 革兰染色镜检
分离培养 取可疑菌落
鉴定试验和药敏试验
结果报告
标本采集
根据病种不同，采集不同标本 脓液、创伤分泌液、穿刺液、血液、尿 液、痰液、脑脊液、粪便
抗原构造
★葡萄球菌A蛋白（SPA） 存在于金黄色葡萄球菌细胞壁 可与人和其它哺乳动物IgGFc段非特异性 结合，应用于协同凝集试验 抵抗吞噬细胞的吞噬
★多糖抗原 具有型的特异性,有助于金葡菌感染的诊 断
分类和分型
葡萄球菌包括32种及亚种 根据产生色素的不同分类 根据产生凝固酶与否进行分类 按噬菌体分型法分类
检验方法—分离培养
血标本－→增菌（葡萄糖肉汤）－→分 离培养（血平板） 生长现象：混浊、胶胨状凝固、溶血
金葡菌的鉴定依据
血平板上金黄色色素、β-溶血环 血浆凝固酶 + 发酵甘露醇 + 耐热核酸酶 +
凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）
条件致病菌 医院内感染的重要病原菌 对多种抗生素耐药
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 （MRCNS）是院内感染的重要病原菌之 一，MRSA、MRCNS对多种抗生素耐药， MRSA不仅对青霉素类、头孢菌素类等β－ 内酰胺类抗菌药物耐药，同时也对四环素、
红霉素、氯霉素、克林霉素及庆大霉素等
常用抗菌药物耐药，对利褔平和磺胺的耐 药率也达30％，但通常对万古霉素敏感。 MRSA、MRCNS常常引起院内感染与播散， 且难于治疗和控制，病死率高。
微生物生化鉴定3篇
微生物生化鉴定【微生物生化鉴定】微生物生化鉴定是一种鉴定微生物种类和特性的方法，它通过检测微生物代谢产物和酶的活性等生化特性来对微生物进行鉴定。
在微生物的研究、诊断和治疗等方面都有着广泛的应用。
下面我们将分别介绍鉴定细菌、真菌和病毒的微生物生化鉴定方法。
一、细菌的微生物生化鉴定1. 常规生化试验：包括氧化-发酵试验、铁锰试验、利用光对紫杆菌的鉴别、胶原酶酶切试验等。
2. 抗生素敏感试验：对于致病菌的抗生素敏感试验是非常重要的生化鉴定方法。
在临床上，通过检测微生物对各种抗生素的敏感性来确定选用哪种抗生素进行治疗。
3. 酸碱度试验：对于肠道菌等产生乳酸的菌株，可以通过酸碱度试验来鉴定其种类。
4. 糖代谢试验：细菌不同的糖代谢方式也是一种微生物生化鉴定方法。
二、真菌的微生物生化鉴定1. 吸附凝集实验：可用于白色念珠菌的鉴定。
2. 纸片扩散法：可用于真菌药物敏感性试验。
3. 不同培养基的试验：对于不同种类的真菌，它们对不同培养基有不同的适应性，可以通过这种方法来进行鉴定。
4. 营养需求试验：真菌的营养需求也不同，通过对真菌在培养基上的生长情况进行观察，可以对其种类进行初步鉴定。
三、病毒的微生物生化鉴定1. 免疫荧光试验：通过对病毒进行免疫染色等手段来进行鉴定。
2. 基于PCR技术的鉴定：包括标准PCR、荧光PCR和荧光定量PCR等方法。
3. 细胞培养法：将病毒在细胞培养基上培养，观察病毒在细胞上的生长和变化，以进行鉴定。
总之，微生物生化鉴定方法是一种基础的、重要的微生物鉴定方法，对于微生物的研究、诊断和治疗等方面都具有重要的意义。
不同类型的微生物鉴定方法不同，需要根据具体的情况进行选择和操作。
通过合理地运用微生物生化鉴定方法，可以更准确地鉴定不同类型的微生物，为其应用提供有力的支持。
实验十 微生物鉴定中常用的生理生化试验
实验十微生物鉴定中常用的生理生化试验摘要本次实验包括大分子水解试验、糖发酵试验和IMViC试验（吲哚、甲基红试验）三类试验，根据要求本实验使用六种培养基分别对所需菌种组合进行了大约24h的培养，之后按照实验要求进行各个试验。
最后观察到了实验现象，了解了所用菌种鉴别的方法和原则。
关键词微生物鉴定；生理生化试验；大分子水解试验；糖发酵试验；IMViC试验前言类的微生物有着不同的代谢类型，例如对一些物质的分解能力及分解代谢的产物的不同反映出他们不同的生理特征，这些特征可以用来对不同种类微生物进行鉴定和分类。
因此可以对微生物的不同生化反应进行试验，以此证明微生物生理特征的多样性，证明微生物分类鉴别的依据。
生理生化试验相比其他鉴别方法而言相对简便、快捷、经济实用，在一般的实验室中都可以进行，因此在微生物种类的初步鉴别中被广泛使用。
一、实验目的1、大分子水解试验证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统，掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
2、糖发酵试验了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
3、IMViC试验了解IMViC的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、实验原理在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。
代谢过程主要是酶促反应过程。
具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes）.许多细菌产生胞外酶(exoenzymes)，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。
各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1、大分子水解试验：微生物对大分子如淀粉、蛋白质和油脂不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能被微生物吸收利用。
微生物鉴定中的生理生化试验
微生物鉴定中的生理生化试验摘要：试验包括对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的大分子物质的水解试验，大肠杆菌、产气肠杆菌的糖发酵试验以及大肠杆菌和普通变形杆菌的IMViC试验，证明了不同菌种在生理生化方面的多样性。
关键词：生理生化水解实验糖发酵 IMiC实验前言：活细胞代谢过程主要是酶促反应，有胞内酶和胞外酶之分。
各种微生物在代谢类型上表现出很大差异，如对大分子物质的分解能力和代谢产物的不同，反应出它们具有不同的酶系和生理特性，可以用来作为菌种鉴定和分类的内容。
某些细菌能够产生分解淀粉的酶，通过碘液对淀粉的显色反应，这样就可以通过对菌落周围是否有透明圈来鉴别出产淀粉酶的菌种；类似的，脂肪水解后产生脂肪酸后可以改变培养基的pH值，使pH值降低，加入培养基中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，则说明细胞外存在脂肪酶；在进行糖发酵实验中，当发酵产酸时，指示剂会改变颜色，是否产气可以通过倒置的徳汉氏小管来观察，通过这样来鉴定不同细菌在分解糖类物质时能力差异。
有些微生物具有分解分解色氨酸产生吲哚的能力，吲哚实验是通过吲哚与二甲基氨基苯甲酸的反应来检测吲哚的产生。
甲基红实是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，通过对pH的区别来区别不同菌种。
1材料和方法1.1 材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌普通变形杆菌产气肠杆菌铜绿假单胞菌1.1.2 溶液、试剂和仪器卢戈氏碘液乙醚吲哚试剂甲基红试剂无菌平板无菌试管接种环试管架滴瓶滴管无菌平板、无菌试管、接种环、试管架、滴瓶、滴管1.2.1淀粉水解实验1.2.1.1固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右，无菌制作平板。
平板底部划分为四部分。
1.2.1.2将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别写上菌名。
将平板倒置在37℃温箱中培养48h。
1.2.1.3观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
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(一）碳水化合物代谢实验糖(醇、苷）类发酵实验（1)原理：细菌分解糖得能力与该菌就是否含有分解某种糖得酶密切相关,故分解糖得能力各不相同，细菌分解糖类后得终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气,使培养基颜色改变，从而判断细菌就是否分解某种糖或其她碳水化合物。
（2)基本培养基：在培养基中加入0、5％-1％得糖类(单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类(水杨苷、菊糖等）、培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型.（3)实验方法：取某一种细菌得２4h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内,37℃培养2４h，观察结果并记录.（4)结果判定：如果接种进去得细菌可以发酵某种糖或醇,则可产酸,使培养基由紫色变成黄色,如果不发酵,则仍保持紫色。
如发酵得同时又产生气体,则在微量发酵管顶部积有气泡。
（5)应用:就是鉴定细菌最主要最基本得实验,特别就是对肠杆菌科细菌得鉴定尤为重要。
氧化型与发酵型（Ｏ/F）得测定（1）原理:细菌在分解葡萄糖得过程中，必需有氧得参加，称为氧化型(O),细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解得,称为发酵型(F）。
发酵型细菌无论在有氧无氧得环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖得细菌称为产碱型（-)。
这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义.（2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5ｇ,磷酸氢二钾0、３g,葡萄糖10g,琼脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水10００mL。
将蛋白胨、盐、琼脂与水混合,加热溶解，校正PH至7、2，然后加葡萄糖与指示剂，加热溶解,分装试管，３-4ｍL/管；115℃,高压蒸汽灭菌20m ｉn,取出冷却成琼脂柱。
（3）试验方法：挑取18—2４h得幼龄斜面培养物,穿刺接种,每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1ｍL液体石蜡，3７℃培养２4h或更长时间。
（4）结果判定:(５)应用:O／F试验主要适用于G—肠道杆菌得鉴别。
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微生物鉴定之生化实验大全Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】（一）碳水化合物代谢实验糖（醇、苷）类发酵实验（1)原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。
（2)基本培养基：在培养基中加入%-1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等).培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
（3)实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。
（4)结果判定：如果接种进去的细菌可以发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。
如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。
（5)应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
氧化型与发酵型（O/F)的测定（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加，称为氧化型（O），细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解的，称为发酵型(F)。
发酵型细菌无论在有氧无氧的环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型(-)。
这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。
（2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾，葡萄糖10g，琼脂3g，1%溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。
将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正PH至，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解，分装试管，3-4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出冷却成琼脂柱。
（3）试验方法：挑取18-24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1mL液体石蜡，37℃培养24h或更长时间。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应汇总因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变，产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果半乳糖甘露糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）菊糖（多分子果糖）淀粉侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇肌醇．葡萄糖代谢类型鉴别试验原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分O/F或－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开。
置35℃孵箱孵育48h以上。
(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。
微生物常用生化实验
微生物常用生化实验胆汁-七叶苷试验原理：培养基中的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。
肠球菌和D群链球菌都能在含有胆汁的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe3+反应形成黑色沉淀，使培养基变黑。
65g/L NaCl生长试验原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在上述培养基生长，并且分解培养基中的葡萄糖产酸，使指示剂溴甲酚紫变黄。
而链球菌的耐盐能力较弱，在此培养基不能生长。
原理：培养基中葡萄糖和乳糖的比例为1︰10，指示剂为酚红，酚红变色范围在pH6.4~8.2（黄~红），而KIA的pH为7.4，产少量的酸就可导致颜色改变。
斜面部分为有氧环境，底层与空气隔绝是相对厌氧的环境。
如接种的是能发酵葡萄糖和乳糖的细菌，因产生大量的酸，使斜面与底层均成黄色。
如接种的是只发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有0.1%葡萄糖可产酸。
开始的8~12h时，产生的酸足以引起斜面和底层的颜色变黄。
在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分所生成的酸可因接触空气而氧化挥发，细菌在有氧的条件下开始分解蛋白质，氧化降解氨基酸，产生碱性化合物，18~24h整个斜面又转换成碱性颜色—红色。
底层（相对缺氧状态），细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化而氨基酸降解产生的碱性化合物不足以中和形成的酸，所以培养基仍为黄色。
细菌如分解蛋白质产生硫化氢，则与培养基中枸橼酸铁形成黑色的硫化铁。
细菌产气时，在底层还可看到有气泡或裂口现象。
苯丙氨酸脱氨酶试验培养基：苯丙氨酸微量液体培养基2）原理：细菌分解氨基酸可通过脱氨或脱羧基生成反应物。
某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与10%三氯化铁试剂产生深绿色反应。
3）方法：待检菌用接种针以无菌操作接种于上述培养基中，35 ℃培养18~24h，滴加入10%三氯化铁试剂3-4滴。
4）结果：立即（延长时间颜色会退去）观察结果，出现绿色环者为阳性，阴性为黄色。
微生物生化鉴定
常用生化试验一．糖、醇发酵试验1.糖、醇发酵试验原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。
有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。
有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气,有的仅产酸，而不产气。
根据这些特点，可鉴别细菌。
培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。
可根据试验的要求和细菌的特性来选择。
2.乙酰甲基甲醇试验（V—P试验）原理：某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下,被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物.故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。
试验中加入的α—萘酚为催化剂,可加速此反应，使反应颜色增加，提高反应的敏感性。
大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V—P试验呈阴性。
培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基3.甲基红试验（MR试验）原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH降至4.5以下。
这时加入甲基红指示剂呈红色。
若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等)，则培养基的酸度仍在PH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。
培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基MUG葡萄糖醛酸苷酶试验原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4—甲基伞形酮—β—D葡萄糖醛酸甘(4—Methylumbelliferyl-β-D—glucuronide简称MUG）的β葡萄糖醛酸甘键，使其水解,释放的4-甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
培养基：MUG培养基4.β-半乳糖苷酶试验原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶两种不同的酶作用，能水解邻硝酸酚—β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl—β-D-galactopyranoside,ONPG），而释放出黄色的邻硝酸酚。
微生物学检验细菌的生物化学实验
检测对象：特异性抗原
方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿
胀伤寒试杆验菌诊断血清 + 待检测细菌
（含抗伤寒杆菌抗体）
细菌凝集
玻片凝集试验：阳性
报告：检出伤寒杆菌
血清学诊断
试剂：含已知抗原 应用：检测待检者血清中有无相应的抗 体以及抗体的效价
球菌
种类: 革兰阳性 葡萄球菌属、链球菌属（链球菌、肺炎 链球菌）、肠球菌属、微球菌属等 革兰阴性 奈瑟菌属、布兰汉菌属
四种革兰阳性菌的比较
葡萄球菌属 微球属 链球菌属 气球菌属
排列方式 葡萄串状、 四联或成对 链状 成双或四联
触酶试验
+
+
-
弱+
氧化/发 酵
厌氧生长
发酵 +氧化 源自生长发酵 +发酵 弱
葡萄球菌属
最常见的化脓性球菌 医务人员的葡萄球菌带菌率高 革兰阳性、葡萄串状排列 产生不同的脂溶性色素 触酶试验阳性 发酵葡萄糖 金黄色葡萄球菌是主要致病菌
培养基不变色： － 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验， 主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
伏－普试验（V-P试验）
原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮 酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙 酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白 胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化 合物。
培养基：葡萄糖蛋白胨水
结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： －
应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
甲基红试验
丙酮酸 大量混合酸
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红
葡萄糖
V－P试验
细菌的常用生化试验
2.氧化-发酵试验（0/F试验）
原理： 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因 是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发 酵。 方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加 无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lcm。将培养基于 35℃培养48h或更长。 结果：
结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
应用：肠杆菌科中属间及种的鉴 别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸
杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌
属中有些菌种也呈阳性，其他菌 属均为阴性。
四、酶类试验
1.氧化酶试验 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系 统的最终呼吸酶。
1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力 各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅 产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。 方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中， 置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。 结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸 性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体 培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他 变化。 应用：是鉴定细菌最主要和最基本的 试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤 为重要。
菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴
性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。
4.尿素分解试验
原理 方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养l8～24h 观察结果。 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变 为阴性。
微生物检测生化鉴定方法
三糖铁（TSI）琼脂试验
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢 （变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸 ，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物， 故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍 保持黄色。
甲基红（Methyl Red）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步 分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量 酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
靛基质（Imdole）试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反 应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化 合物。
枸椽酸盐试验 某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源， 将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于 指示剂的作用，培养基变为兰色。
尿素酶（Urease）试验
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为 碱性，酚红呈粉红色。
1、未接种 2、尿素酶阳性 3、尿素酶阴性
ห้องสมุดไป่ตู้
slant color/butt color/ gas production/hydrogen sulfide production
a. uninoculated b. little change/alkaline/-/c. alkaline/acid/-/+ d. acid/acid/+/+ e. acid/acid/+/-
微生物生化反应： 生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来 鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。 糖酵解试验 淀粉水解试验 V-P试验 甲基红（Methyl Red）试验 靛基质（Imdole）试验 枸椽酸盐试验： 尿素酶（Urease）试验 三糖铁（TSI）琼脂试验
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（一）碳水化合物代谢实验糖（醇、苷）类发酵实验（1)原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。
（2)基本培养基：在培养基中加入0.5%-1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等).培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。
（3)实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。
（4)结果判定：如果接种进去的细菌可以发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。
如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。
（5)应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。
氧化型与发酵型（O/F)的测定（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加，称为氧化型（O），细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解的，称为发酵型(F)。
发酵型细菌无论在有氧无氧的环境中都能分解葡萄糖。
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型(-)。
这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。
（2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1%溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。
将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正PH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解，分装试管，3-4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出冷却成琼脂柱。
（3）试验方法：挑取18-24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1mL液体石蜡，37℃培养24h或更长时间。
（4）结果判定：（5）应用：O/F试验主要适用于G-肠道杆菌的鉴别。
肠杆菌科的细菌为发酵型，其他肠道菌为非发酵型，非发酵型细菌为氧化型或产碱型。
该试验也用于鉴别葡萄球菌（F）和微球菌（O）。
β-半乳糖苷（ONPG)实验（1）原理：有的细菌可以产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷,而生成黄色的邻-硝基酚，在很低的浓度下也可以检测出。
（2）培养基：邻硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01moL/L PH7.5的灭菌1%蛋白胨水300mL。
先将前两种成分混合溶解，过滤除菌，在无菌条件下与1%蛋白胨水混合，分装试管，每管2-3mL。
无菌检验后备用。
（3）实验方法：取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1-3h或24h如有β-半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。
（4）应用：该试验常用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定。
如埃希菌属枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属等为阳性；不发酵乳糖的沙门菌属、变形杆菌属等为阴性。
ONPG试验不能代替乳糖发酵试验，只能测定β-半乳糖苷酶的活性。
七叶苷水解实验（1）原理：有的细菌可以将七叶苷分解为七叶素和葡萄糖，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的Fe2+反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。
（2）应用：主要用于肠球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性，也可用于革兰氏阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。
甲基红实验（MR）（1）原理：细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4.5以下时，加入甲基红指示剂而变红，为甲基红试验阳性。
若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等）则培养基的pH仍在PH5.4以上，故加入甲基红试剂呈橘黄色，为阴性。
（2）实验方法：一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中置37℃培养48-72h，取出后加甲基红试剂3-5滴，凡培养液呈红色者为阳性，橙色为可疑，黄色者为阴性。
（3）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌（+）与产气肠杆菌（-），前者为阳性后者为阴性。
沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属阳性，肠杆菌属、哈夫尼亚菌属阴性。
V-P实验（1）原理：有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基发生反应生成红色化合物。
若培养基中的胍基含量过少，则可加入少量含胍基的化合物等。
（2）V-P试剂：肌酸0.3%或原粉。
40%的NaOH溶液。
（3）实验方法：接种实验菌于葡萄糖蛋白胨水培养基（与甲基红实验相同）中，每次两个重复，置适温培养2-6d，取培养液和40%NaOH 等量想混，加入少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为实验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。
（4）应用：本实验常与甲基红实验一起用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。
（二）蛋白质和氨基酸的代谢实验明胶液化实验（1）原理：某些可以产生一种胞外蛋白水解酶（明胶酶），能使明胶分解为氨基酸，使明胶失去凝固能力而液化，因而使半固体的明胶培养基成为流动的液体。
（2）实验方法：取18-24h的斜面培养物穿刺接种，并有两支未接种的空白对照。
（3）结果观察：与30℃培养20天后观察，明胶液化的为阳性。
由于室温下明胶培养基呈液状，因此在观察结果时，应将其放置于4℃的冰箱中30min后拿出观察。
若明胶仍能全部凝固为阴性，有部分或全部不能凝固为阳性。
吲哚实验（Ind）（1）原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂（对二甲氨基笨甲醛）后形成红色的玫瑰吲哚。
该试验也称靛基质试验。
（2）培养基：蛋白胨水培养基。
（3）实验方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24-48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂，观察结果。
（4）结果：于两夜面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的鉴别。
大肠埃希菌为阳性，沙门菌属则为阴性。
H2S实验（1）原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产酸硫化氢，硫化氢遇亚铁离子或铅离子则结合形成黑色沉淀物（硫化铁或硫化铅（2）实验方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，于35℃孵育24-48h，观察有无黑色沉淀出现。
（3）结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。
（4）应用：主要用于鉴别肠杆菌科中属及种的鉴别，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其他菌属大多为阴性。
但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。
尿素分解试验（1）原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。
（2）培养基：尿素培养基。
（3）实验方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃孵育18-24h 观察结果。
（4）结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。
（5）应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。
奇异变形杆菌的普通变形杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。
苯丙氨酸脱氢酶实验（1）原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氢酶。
细菌产生的苯丙氨酸脱氢酶使苯丙氨酸脱氢后生成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿（2）培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。
（3）实验方法：将待检菌大量接种于苯丙氨酸琼脂培养基中，于35℃孵育18-24h，滴加10%三氯化铁试剂3-4滴，自斜面上方流下。
（4）结果：有绿色出现为阳性。
应立即观察结果，延长反应时间会引起退色。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其他细菌均为阴性。
氨基酸脱羧试验（1）原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和CO2。
由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。
（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。
（3）试验方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸（赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸）脱羧酶试验管一支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖液体石蜡油，35℃孵育1-4d每日观察结果。
（4）结果：对照管应为黄色，若为溴甲酚紫指示剂，则测定管呈紫色为阳性，若测定管呈黄色为阴性。
若对照管呈现紫色则实验无意义，不能做出判断。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。
如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。
志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。
（三）碳源利用实验枸橼酸盐利用试验（CIT）（1）原理：某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠为唯一碳源而获得能量，能利用枸橼酸盐的细菌也能利用铵盐作为氮源，分解后生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性，导致溴麝香草酚蓝pH指示剂由淡绿色变为深蓝色。
（2）培养基：含有枸橼酸盐的铵盐的西蒙氏和柯氏培养基。
（3）实验方法：将待检菌接种于含有枸橼酸盐的铵盐的西蒙氏和柯氏培养基。
（4）结果：培养后变蓝为阳性，培养7天仍无细菌生长，培养基不变色者为阴性。
（5）应用：该试验用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别。
埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属均为阴性。
（四）各种酶类实验氧化酶试验（OX试验）（1）原理：氧化酶（即细胞色素氧化酶），是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。
具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，生成醌类化合物。
因此，本实验结果与细胞色素C的存在有关。
（2）实验方法：直接法：四甲基对苯二胺盐酸盐（紫色为阳性）或二甲基对苯二胺二盐酸盐（红色为阳性），二者分别配成1%的溶液，取2-3滴直接滴加试剂于被捡菌落上，或用滤纸沾取待检菌落，滴加试剂观察结果；滤纸法：将滤纸浸泡在试剂中制成试剂纸片，取足够菌落涂于其上观察结果。
（3）结果：有细胞色素氧化酶的菌落，10S内呈深紫色为阳性。
10-60S 内出现紫色者则不属于肠杆菌科，要进一步鉴定。
为保证结果的准确性，可分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。
（4）应用：如奈瑟菌属、假单胞菌属、莫拉菌属呈阳性，肠杆菌科呈阴性。
本试验不宜用生锈的接种环，避免火焰灭菌时表面形成氧化物而引起假阳性反应。
过氧化氢酶试验（触酶试验）（1）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和初生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。
（2）实验方法：取洁净玻片（或滤纸），用接种环挑取细菌，加入3%过氧化氢数滴，立即观察结果。
（3）结果：若立即出现大量气泡为阳性。
无气泡为阴性。
（4）应用：G+球菌中，葡萄球菌的微球菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故该试验常用于G+球菌的初步分群。
本实验不宜用在血琼脂培养基上的菌落（易出现假阳性），每次试验应设立对照，阳性反应对照菌为金黄色葡萄球菌，阴性对照菌为链球菌。