实验八 植物微核检测技术23页PPT文档
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现在一般都采用细菌、离体培养的哺乳动物和 人类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有： ①以基因突变为指标的检测法 ②以染色体为指标的方法
以染色体为指标的“三致效应”的检测方 法：
1. 经典的染色体畸变分析方法； 2. 姐妹染色单体互换测试法； 3. 微核测试法。
（1）断片 （2）双着丝点 （3）环
3. 环磷酰胺有毒，使用时要注意。
智能全自动微核分析系统：
法国IMSTAR
谢谢
微核测试法的应用：
辐射损伤； 辐射防护； 化学诱变剂； 食品添加剂； 新药试验； 染色体遗传疾病； 癌症前期诊断等。
实验目的：
1. 通过植物根尖微核试验，掌握微核的制片 技术、识别及计数方法。
2. 了解评价理化因子对机体遗传损伤的快速 筛选方法。
实验原理：
微核（micronucleus, MN）是真核生物细胞中的一 种异常结构。由于细胞经辐射或化学药物等作用使染 色体受到损伤，在有丝分裂中、后期细胞中形成丧失 着丝粒的染色体单体或染色体断片，这些断片或染色 体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核 ，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分 裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。 游离于细胞质中形成的次核。在间期细胞中，常常见 到比普通细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直 径大约相当于细胞直径的1/20~1/5。
4. 镜检及观察，检查400个细胞/片。
结果及分析：
1. 细胞学观察：
在细胞分裂间期，微核 呈圆形或椭圆形，游离 于主核之外，大小在主 核的1/3以下，折光率 及细胞化学反应性质和 主核一样。
毛葱根尖微核
2. 微核率计算
微核率（MCN%o）=
微核数 细胞数
×1000%o
片号 第1片 第2片 第3片 总计
微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。
实验材料：
毛葱（Allium fistulosum）根尖。
实验器材：
显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子， 刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精 灯，指管等。
试剂
1. 环磷酰胺（CP） 2. 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 3. 希夫（Schiff‘s）试剂 4. 45%醋酸 5. 1 mol/L盐酸
微核检测记录表
细胞数
微核数
微核千分率
作业和思考题：
1. 叙述微核形成原理。 2. 统计微核细胞数，计算微核细胞千分率。 3. 画出具有微核的细胞示意图。
注意事项：
1. 处在分裂过程中的细胞对不同理化因素的 敏感时期和敏感剂量是不同的，需要进行 试验摸索。
2. 观察与识别微核要准确，统计细胞数至少 1000个/3张片。
实验步骤： 根尖的培养
环磷酰胺处理
诱变处理
固定 解离
染色
压片
镜检及观察
实验材料 准备
细胞学鉴定
临时装片 制片
实验材料准备 —— 诱变处理
1. 毛葱沙培生根，室温下2~3天即长出0.5 ~ 1cm长的根；
2. 置于100mg/L、150mg/L环磷酰胺溶液中
处理24小时； 3. 从药液中取出，水洗后清水培养22~24小时； 4. 水洗后用Carnoy’s固定液固定24小时，水洗，
ห้องสมุดไป่ตู้
肿瘤的发生和类型
遗传毒理评价所用的材料：
1. 植物、昆虫、水生动物等，如紫露草花序、蚕豆 根尖、鱼红细胞遗传毒性试验。
2. 动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。 3. 人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、头皮
毛囊细胞、痰液细胞等。
“三致效应”的检测方法：
早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物 或涂布在动物皮肤上，观查动物是否因此而患 肿瘤或出现畸胎等。
背景知识——毒理遗传学：
又称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素 对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支 学科。
环境中可产生诱变的因素：
1. 物理诱变：如紫外线，X-射线，γ-射线，快 中子，激光，微波，离子束等。如空间诱变。
2. 化学诱变：如烷化剂、碱基类似物、氯化锂、 亚硝基化合物、叠氮化物、抗生素和吖啶等 嵌入染料。
微核
微核测试法： （micronucleus test, MNT）
20世纪70年代初由Matter和Schmid首先建 立了一种简便、快速、评价客观地检测来自环 境中的各种理化及生物因子对机体产生潜在的 遗传损伤方法，即用哺乳动物骨髓嗜多染红细 胞（polychromatic erythrocyte, PCE） 微核率的实验方法。
转入70%乙醇中保存。
临时装片制片 —— 细胞学鉴定
1. 解离：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用1 mol/L HCl 在60℃处理根尖8~10min后，水洗 3~4次，每次5min。
2. 染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（Schiff ）试剂 染色30min~2h。
3. 压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一滴 45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体，一手 压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片至组织呈云 雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在盖玻片上覆滤纸条， 用拇指垂直按压制片。
环境因素造成的遗传毒理效应： “三致效应”
1. 突变形成：诱发生殖细胞的基因突变和染色体畸 变，造成子代遗传性疾病发生频率增加;
2. 癌形成：诱发体细胞基因突变或在亲代遗传突变 形成的背景上诱发体细胞突变引起的体细胞恶性 转化为癌细胞;
3. 致畸效应：作用于发育中的胚胎细胞干扰基因的 正常作用,影响胚胎细胞分化和器官系统的发育导 致畸胎的发生。
以染色体为指标的“三致效应”的检测方 法：
1. 经典的染色体畸变分析方法； 2. 姐妹染色单体互换测试法； 3. 微核测试法。
（1）断片 （2）双着丝点 （3）环
3. 环磷酰胺有毒，使用时要注意。
智能全自动微核分析系统：
法国IMSTAR
谢谢
微核测试法的应用：
辐射损伤； 辐射防护； 化学诱变剂； 食品添加剂； 新药试验； 染色体遗传疾病； 癌症前期诊断等。
实验目的：
1. 通过植物根尖微核试验，掌握微核的制片 技术、识别及计数方法。
2. 了解评价理化因子对机体遗传损伤的快速 筛选方法。
实验原理：
微核（micronucleus, MN）是真核生物细胞中的一 种异常结构。由于细胞经辐射或化学药物等作用使染 色体受到损伤，在有丝分裂中、后期细胞中形成丧失 着丝粒的染色体单体或染色体断片，这些断片或染色 体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核 ，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分 裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。 游离于细胞质中形成的次核。在间期细胞中，常常见 到比普通细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直 径大约相当于细胞直径的1/20~1/5。
4. 镜检及观察，检查400个细胞/片。
结果及分析：
1. 细胞学观察：
在细胞分裂间期，微核 呈圆形或椭圆形，游离 于主核之外，大小在主 核的1/3以下，折光率 及细胞化学反应性质和 主核一样。
毛葱根尖微核
2. 微核率计算
微核率（MCN%o）=
微核数 细胞数
×1000%o
片号 第1片 第2片 第3片 总计
微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。
实验材料：
毛葱（Allium fistulosum）根尖。
实验器材：
显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子， 刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精 灯，指管等。
试剂
1. 环磷酰胺（CP） 2. 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 3. 希夫（Schiff‘s）试剂 4. 45%醋酸 5. 1 mol/L盐酸
微核检测记录表
细胞数
微核数
微核千分率
作业和思考题：
1. 叙述微核形成原理。 2. 统计微核细胞数，计算微核细胞千分率。 3. 画出具有微核的细胞示意图。
注意事项：
1. 处在分裂过程中的细胞对不同理化因素的 敏感时期和敏感剂量是不同的，需要进行 试验摸索。
2. 观察与识别微核要准确，统计细胞数至少 1000个/3张片。
实验步骤： 根尖的培养
环磷酰胺处理
诱变处理
固定 解离
染色
压片
镜检及观察
实验材料 准备
细胞学鉴定
临时装片 制片
实验材料准备 —— 诱变处理
1. 毛葱沙培生根，室温下2~3天即长出0.5 ~ 1cm长的根；
2. 置于100mg/L、150mg/L环磷酰胺溶液中
处理24小时； 3. 从药液中取出，水洗后清水培养22~24小时； 4. 水洗后用Carnoy’s固定液固定24小时，水洗，
ห้องสมุดไป่ตู้
肿瘤的发生和类型
遗传毒理评价所用的材料：
1. 植物、昆虫、水生动物等，如紫露草花序、蚕豆 根尖、鱼红细胞遗传毒性试验。
2. 动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。 3. 人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、头皮
毛囊细胞、痰液细胞等。
“三致效应”的检测方法：
早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物 或涂布在动物皮肤上，观查动物是否因此而患 肿瘤或出现畸胎等。
背景知识——毒理遗传学：
又称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素 对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支 学科。
环境中可产生诱变的因素：
1. 物理诱变：如紫外线，X-射线，γ-射线，快 中子，激光，微波，离子束等。如空间诱变。
2. 化学诱变：如烷化剂、碱基类似物、氯化锂、 亚硝基化合物、叠氮化物、抗生素和吖啶等 嵌入染料。
微核
微核测试法： （micronucleus test, MNT）
20世纪70年代初由Matter和Schmid首先建 立了一种简便、快速、评价客观地检测来自环 境中的各种理化及生物因子对机体产生潜在的 遗传损伤方法，即用哺乳动物骨髓嗜多染红细 胞（polychromatic erythrocyte, PCE） 微核率的实验方法。
转入70%乙醇中保存。
临时装片制片 —— 细胞学鉴定
1. 解离：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用1 mol/L HCl 在60℃处理根尖8~10min后，水洗 3~4次，每次5min。
2. 染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（Schiff ）试剂 染色30min~2h。
3. 压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一滴 45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体，一手 压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片至组织呈云 雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在盖玻片上覆滤纸条， 用拇指垂直按压制片。
环境因素造成的遗传毒理效应： “三致效应”
1. 突变形成：诱发生殖细胞的基因突变和染色体畸 变，造成子代遗传性疾病发生频率增加;
2. 癌形成：诱发体细胞基因突变或在亲代遗传突变 形成的背景上诱发体细胞突变引起的体细胞恶性 转化为癌细胞;
3. 致畸效应：作用于发育中的胚胎细胞干扰基因的 正常作用,影响胚胎细胞分化和器官系统的发育导 致畸胎的发生。