PCR方法在性病检测中的应用

4 ．扩增产物的灭活：工作前后或发现污染可 能时应及进行消毒清洁和紫外线灭活DNA。其 次对扩增产物用酶灭活，光化学灭活，稀盐酸 浸泡等处理清洁实验室及废弃物，力求减少污 染。
性病是一个特殊的医学领域，是社会性很 强的一组传染病，患者具有特殊的社会背 景和心理状态。性病诊断及到个人声誉、 夫妻感情和家庭和睦，因此性病诊断应该 十分慎重。性病实验方法的选择和实验结 果，对临床诊断有着十分重要的作用，否 则将导致误诊误治，甚至乱诊乱治。近几 年来，国内由于某种商业行为造成滥用 PCR对性病诊断的教训，是值得深思的。
由于PCR等对基因检测的高敏感性，近 几年来，国内外的实践说明，实验过程 中的带转污染造成的假阳性率甚高，临 床标本的成分或在标本采集、运送和处 理过程中介入外源性干扰物抑制了扩增 所造成的假阴性也是常见的，因此实验 条件要求十分严格，需在以下几个方面 不断完善和控制：
1 ．实验室设置：应有 3~4 间严格封闭独立的 PCR 前区、 PCR 后区和检测区，各区内衣、物 和实验用具等互不交换；日常工作流程：工作 人员先后顺序由前区进入后区，再进入检测区， 不能逆转，检测区DNA污染最严重，应尽量远 离的两区。试剂制备和标本处理应在生物安全 箱（超净台）内进行。
现将国内外基因检测在性传播疾病实 验诊断的进展情况介绍如下:
PCR的基本原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核 糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促 合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。反应分三步：
①变性（denaturation）,通过加热使DNA双螺旋的 氢 键 断 裂 ， 双 链 解 离 形 成 单 链 DNA 。 ② 退 火 （ annealling ） , 当温度突然降低时由于模板分子 结构较引物复杂的多，而且反应体系中引物DNA量 大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部 形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。 ③延伸（ extension ），在 DNA 聚合酶、4 种脱氧糖 核苷三磷酸底物及 Mg++ 存在的条件下，5’→3’的聚 合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上 三步为一个循环，每一个循环为下一循环的模板。 数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段 得到了大量复制，数量可达2×106拷贝。
PCR法用于临床诊断的瑕瑜互见。它的优点敏感性 高，不需放射性核素标记，以检测不能培养的病原 体。但是，它所需的仪器设备和试剂在一般实验室 尚不能配备。更重要的是，实验过程中有可能因外 界污染而出现假阳性结果。因此，严格无菌操作、 选用高纯度试剂及设制对照是保证试验成功的必要 条件。
1．沙发衣原体的PCR检测 PCR法诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性高 ，有时在细胞培养阴性者也能检测出沙眼衣原体感 染。在一项比较研究中，PCR、培养和Gen-probe 的敏感性分别是95%、86%和65%。另一项研究中 PCR特异性达到100%。一种PCR（以不同的质粒 DNA顺序为引物）证实，说明可能并非是PCR的 假阳性结果。然而，也有报告由于累积性污染而造 成PCR阳性，或因标本中含有抑制衣原体生长的物 质或衣原体失活而致培养假阴性。因此，PCR的结 果还应该结合临床病史和治疗情况进行分析，必要 时重复取材或在另一部位取材作试验。
2 ．各种类型标本的采集、储存、运送以 及实验前的妥善处理，以减少污染、排除 抑制剂和干扰物，必须不断探讨。
3 ．实验过程需有严格的质量控制与对照：通 常需设置阳性对照（低水平阳性对照），阴性 对照（不含靶核酸），所有反应试验，应每15 个反应管设一个阴性对照；扩增和抑制物对照， 双份标本，其中一份加入靶DNA和引物；内对 照：同源内对照，异源内对照。
1996年底，在广东召开的全国性病学术交流会上， 有关专家强烈呼吁：在目前条件下，不要滥用 PCR作性病诊断，并规定不准用PCR实验结果报 病。1998年4月15日卫生部卫医发[1998]第9号文 件，发出，《关于暂停临床基因扩增（PCR）检 验的通知》，明确规定“各医疗机构不得使用未 经正式批准的试剂且不得以任何形式向患者收取 费用”。目前多数医疗单位已停用PCR检查性病， 并正探索按国际NCCLS分子诊断方法使用规则进 行PCR质量控制，完善实验条件，提高准确性。
PCR法还可用于检测其他类型的沙眼衣原体感染。 如沙眼，用直接免疫荧光法检查一组儿童，阳性率 为 22%，而 PCR 为 48% 。也有报道用 PCR 法检测精 液、Байду номын сангаас性附睾炎或Reiter病中的沙眼衣原体感染。 沙 眼 衣 原 体 PCR 法 已 有 商 品 化 试 剂 盒 （ Amplicor,Roche Molecular Syetems）。此法扩增位 于衣原体隐蔽性质粒中的 DNA 序列，扩增片段大 不上为207个碱基对。这个试剂盒检测泌尿生殖道 沙眼衣原体感染的敏感性达78.8%/~98.6%，特异性 达99.7%~100%。
PCR方法在性病检测中的应用
性病实验室涉及许多学科：主 要技术为：1.镜检 NG,滴虫等 2.培养 NG UU 3. 血清学 SY 4. 酶免疫学检查 CT HSV HIV 5. 分子诊断技术 各种性病病原 体
利用基因检测方法对各种传染病进行病原学诊 断，是近年来的主要进展之一。它的优点是极 大地提高了检测的敏感性。比如，在检测标本 中只有一个基因拷贝存在时也可以用聚合酶链 反应（PCR）或连接酥链反应（LCR）检测出 来。其次，分子生物学方法可以诊断那些培养 困难的病原微生物，如HPV感染。此外，它还 可以用来进行流行病学，发病机理及药物治病 监测的研究等。
4．HPV感染的PCR检测 PCR检测HPV感染具有快速、方便、高度敏感和高 度特异的优点。它的敏感性比现有的诊断方法要高 1000倍。采用通引物可以一次检测多种型别的 HPV 。而选择特定型别的特异部位合成引物，扩增后可 直接区分型别或亚型。它在诊断HPV感染和致癌研 究中有着广阔的应用前景。