L天冬氨酸

L-天冬氨酸的制备、应用及市场前景

摘要：发酵法生产L-天冬氨酸，菌种及相关选育情况，所用原料的灭菌及预处理等情况，主要生产技术及关键控制点，主要分离纯化技术和分离、得率等，以及国内外的发展情况。

关键词：L-天冬氨酸，酶法制备，分离纯化，市场前景。

L-天冬氨酸又称L-天门冬氨酸，是一种常用的有机化工原料。常见的L-天冬氨酸为无色片状结晶或者白色结晶粉末，无臭，略带酸味，主要作为食品添加剂、化工产品中间体和医药原料来使用。目前国内L-天冬氨酸的生产均采用生物酶工程技术，本生产技术的原理是采用天冬氨酸酶将反丁烯二酸（即富马酸）氨解成L-天冬门氨酸。

HOOCCH=CHCOOH+NH 3HOOCCH 2CHNH 2COOH

其工艺生产流程图如下：

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

大肠杆菌，L-Asp 酶转化液，经活性炭脱色处理，质量分数为23％，二级种子 一级种子 杀菌 脱色 酶促反应 原料配制

无菌空气 菌种斜面

空压机 干燥 洗涤

过滤 结晶 离心 检验 包装

pH=8.87。

大肠杆菌分离纯化：配置牛肉膏蛋白胨培养基，配置后高压蒸汽灭菌并倒平板，将培养皿放入37℃的恒温培养箱中培养24-48小时，以检查是否灭菌彻底。确定灭菌完全的培养皿可用平板划线法或稀释涂布平板法接种微生物。大肠杆菌可从河道污水或者家禽、家畜生活附近的土壤中分离培养获得。

1.1.2培养基

斜面养基：蛋白胨6g/L，牛肉膏2g/L氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH7.0。

种子培养基：碳源和氮源成分以及浓度按照实验设定值，硫酸镁0.5g/L，硫酸二氢钾2g/L，氯化钠3.5g/L，pH7.0。

原始种子培养基：富马酸15g/L，玉米浆20g/L,硫酸镁0.5g/L，硫酸二氢钾2g/L，氯化钠3.5g/L，pH7.0。

转化培养基：富马酸氨溶液，pH8.5。

1.1.3仪器与试剂

分光光度计，恒温振荡器，阳离子交换树脂，自动旋光仪，数字熔点仪，离心机。

1.2方法

1.2.1培养条件

培养温度为37℃

培养时间为26h左右

1.2.2酶反应

取一环生长良好的斜面种子装于有30mL种子培养液的250mL培养摇瓶中，37℃、180r/min下恒温摇床培养16h得到种子液。取种子液10mL，在5000r/min下离心10min，用生理盐水冲洗2~3次，加入100mL富马酸氨溶液，在温度为37℃、转速为180r/min的条件下进行酶转化反应，用HPLC 测定反应液中富马酸含量，待富马酸含量降至较低值时需加底物溶液，直到转化速度较慢时结束反应。

1.2.3产物的分离

因为L-谷氨酸脱羧酶能专一的催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸和二

氧化碳而L-天冬氨酸不被作用，可用L-谷氨酸脱羧酶分离L-谷氨酸和L-天冬氨酸。

在100mL三角瓶中加入湿菌体，0.5g，混合物0.6g，0.2mol/L醋酸缓冲液（pH=5.0）30mL吐温-80 0.01g，于35℃，170r/min震荡反应30min。取2mL反应液，添加0.2mol/L硼酸缓冲液（pH=9.0)2mL,使酶反应终止，离心去除菌体。以berthelot显色法测定转化液中的γ-氨基丁酸。比活定义为在35℃，pH=5.0时1g湿菌体1h所转化产生的γ-氨基丁酸的μmol数，单位为U，1U=1.0μmol/g.h。

1.2.4测定方法

菌体生物量的测定通过发酵液OD值体现菌体的生物量，即样品菌液经摇匀后吸取菌液2mL定容于50mL容量瓶中，在640nm波长处测定吸光值。发酵液OD值与细胞干质量之间的线性关系为Y（干质量）=0.1709xX（OD 值）-0.0042，线性回归因子为0.997。

富马酸含量测定从酶反应中吸取0.4mL，定容于100mL容量瓶中，在280nm处测定吸光值。依据标准曲线计算出浓度。

L-天冬氨酸定性检测分析（纸层析法）用30cmx28cm层析滤纸，溶剂系统为正丁醇、冰乙酸及水的质量比为4:1:2。上行展开10~11h，展开至距顶端1~2cm处。用pH7.5的0.05％的溴酚蓝乙醇溶液显色。L-天冬氨酸用0.5％的茚三酮溶液显色。

转化率定义在底物富马酸溶液中，底物转化率=（底物初始浓度-底物终止浓度）/底物初始浓度。

1.2.5 L-天冬氨酸的结晶过程

加酸量与pH的关系取转化液100mL，恒温于80℃，滴加40％硫酸调节pH，记录pH随加酸量的变化，作pH值变化曲线。

L-天冬氨酸的结晶操作取转化液100mL，恒温于80℃，滴加40％的硫酸调节pH至4.3左右，加入一定量的晶种，再滴加40％硫酸至pH为2.8，控温冷却至室温，过滤，干燥至恒重。

2结果与讨论

2.1优化培养基成分的选定

目前都是采用富马酸作为直接碳源，蛋白胨、牛肉膏蛋白胨作为直接氮源进行发酵培养L-天冬氨酸的转化菌。

菌体培养--酶形成的过程曲线

从斜面上挑取一环菌苔接种到装有50mL培养基的500mL三角瓶中，37℃摇瓶培养，间隔取样，分别测定培养液的OD值、pH、基质富马酸含量及酶活，得到菌体培养。

2.2酶反应温度对富马酸转化量的影响

取50mL培养液分别于37℃和50℃温度下进行酶反应。50℃时开始酶活很高，第1、2d酶反应很快，转化富马酸的量占总量的90％，以后酶反应缓慢，说明50℃时第三天酶开始失活。而在37℃进行酶反应，前5d反应速度基本不变，第6d酶反应缓慢。比较底物的转化率，37℃转化率较高，考虑生产成本，选用37℃进行酶反应。

2.3酶的失活情况

将50mL培养液于37℃静置放置，每隔1d测其酶活，观察酶的失活情况，见图。

由酶失活曲线可知，当酶处于静置状态时，经4d，酶活剩余40％，第5d，