分子生物学基本技术一
常用的分子生物学基本技术简介
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR 法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。
测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。
目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。
化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。
一般能读出200-250个核苷酸序列。
双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。
基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。
至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。
目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
分子生物学常用技术
HRP-链霉亲和素（100ul，37oC,20min) 基质液（100ul，37oC, 10min)
2mol/LH2SO450ul终止反应
490nm测定光密度值（以未加PCR产物 的空白为阴性对照，CUT OFF值为0.1)
三. 结果
人血清高密度脂蛋白亚类免疫印迹检测法
吴新伟，傅明德等（中国动脉硬化杂志 1999；7(3)：253）
纯化PCR产物与T-vector连接 重组质粒转化JM109大肠杆菌 增殖克隆株 提取质粒
PCR产物30ul
100oC变性5分钟，冰浴5分钟
单链PCR产物30ul加入100ul杂交液 单链PCR产物与预杂交微孔板上 特异DNA片段杂交42oC，1小时
洗涤 1min×5次
（酶切特异片段）
变性成单链 包被微孔板 洗涤 1min×4次 预杂交42oC,1小时
切点数目，但是不能排列出这些片段在DNA分子中的相对 位置。采用酶两两组合进行彻底降解，比较双酶和单一酶解 产物，可以确定酶切点的相对位置。
AJPI DNA的分子量为9.0兆道尔顿（≈13.6kb），有一
个XhoⅠ和一个PstⅠ切口，两个EcoRⅠ切口。它们的单酶 和双酶解结果示于下表。
AJPI DNA的三种酶单解和双解产物分析
三. DNA序列测定的策略
1. 鸟枪法
2. 套式缺失法
3. 引物延伸法
四. 自动测序
五. 应用举例
聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价
杨正林，傅明德等（华西医大学报 2001；32(1)：136-139）
一. 原理
利用PCR扩增、分子克隆、核酸杂交以及生物素-
亲合素酶联检测技术，灵敏、特异地检测结核杆菌。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成（无要求）一亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的3’-OH与固相载体成共价键，5’-OH被二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，下一个核苷酸的5’-OH亦被DMT保护3’-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化碱基上的氨基用苯甲酸保护。
每延伸一个核苷酸需四步化学反应（1）脱DMT游离出5’-OH。
⑵缩合（偶联反应）：新生成的5’-OH与下一个核苷活化的3’单体缩合成亚磷酸三酯使链增长（3）盖帽（封端反应）：有少量（小于0.5%）未缩合的5’-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
（4）氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5’方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一）PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP合成其互补链（延伸），在适宜的条件下,这种变性一复性一延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术一、引言分子生物学是研究生物体的分子结构、功能和相互关系的学科。
分子生物学基本技术是指在分子水平上进行研究的实验技术和方法。
本文将介绍几种常用的分子生物学基本技术。
二、聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应是一种用于扩增DNA片段的技术。
它可以从少量DNA样本中扩增出大量的目标DNA片段。
PCR的原理是通过不断重复DNA的变性、引物结合和DNA合成的过程，使目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR广泛应用于基因克隆、基因检测、遗传学研究等领域。
三、DNA电泳DNA电泳是一种通过电场作用使DNA分子在凝胶中迁移的技术。
DNA的迁移速度与其分子大小成反比，因此可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
在DNA电泳中，DNA样品首先经过限制性内切酶切割，然后在凝胶电泳中进行分离。
最后，通过染色剂染色，可观察到DNA片段的分离结果。
四、基因克隆基因克隆是指将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体等。
基因克隆技术可以用于基因的定位、表达和功能研究。
克隆的基本步骤包括DNA片段的切割、载体与DNA片段的连接、转化等。
五、蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
常用的表达系统包括原核表达系统（如大肠杆菌）和真核表达系统（如哺乳动物细胞）。
表达蛋白质的基本步骤包括构建表达载体、转化表达宿主细胞、诱导表达、蛋白质纯化等。
六、核酸杂交核酸杂交是一种通过DNA或RNA的互补碱基配对形成双链结构的技术。
核酸杂交可用于检测目标DNA或RNA的存在、定位和表达水平。
常用的核酸杂交技术包括Southern blotting、Northern blotting和in situ杂交等。
七、蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用是细胞内发生的重要生物学过程。
研究蛋白质相互作用可以揭示蛋白质的功能和信号转导机制。
常用的蛋白质相互作用研究技术包括酵母双杂交、共免疫沉淀、荧光共振能量转移等。
分子生物学中的基本实验技术
分子生物学中的基本实验技术分子生物学是生物学中的一个重要分支，它研究的是生物体中的分子结构和功能。
分子生物学的研究对于生物科学的深入发展具有非常重要的意义，因此有许多实验技术被应用于分子生物学的研究中。
今天我将为大家介绍分子生物学中的基本实验技术。
1. PCR技术PCR技术是分子生物学中最常见的实验技术之一，全名为聚合酶链式反应。
这个技术的主要作用是在一定时间内通过不断复制DNA分子，使其数量快速增加。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶逆转录DNA为RNA，然后复制RNA为DNA，从而使得DNA的数量快速增加。
这个技术对分子生物学的研究非常重要，因为可以快速扩增特定目标DNA序列，用于检测基因改变、氨基酸替换等。
2. 克隆技术克隆技术是一种基于DNA分子复制的实验技术，它通过将特定的DNA序列定位在DNA分子的特定位置，使其可以被快速复制。
这个技术对于分子生物学的研究也非常重要，因为可以通过克隆技术复制从许多不同物种中获得的DNA分子，从而使其进行深入研究。
现在，克隆技术已经成为了分子生物学中最常用的实验技术之一。
3. 基因测序技术基因测序技术是一种对DNA分子进行测序的技术，它对于分子生物学的研究也非常重要。
通过基因测序技术，可以快速测定DNA分子的序列，从而更好地了解其功能和结构。
基因测序技术也是现代医学研究中最常用的技术之一。
4. 基因编辑技术基因编辑技术是一种用于改变生物体内基因结构的实验技术。
现在，有一些高效的基因编辑技术被发明，其中最为热门的是CRISPR/Cas9技术。
通过这个技术，可以快速实现基因替换、氨基酸替换等，这对于生物医学研究来说非常重要。
5. 免疫印迹技术免疫印迹技术是一种检测特定蛋白质的实验技术，对于分子生物学的研究也非常重要。
通过免疫印迹技术，可以检测特定蛋白质的存在和表达水平，从而更好地了解它们在生物体内的作用。
总之，分子生物学中的实验技术非常多，但是以上几种技术是最为基础和常见的实验技术。
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术一．琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取的。
当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关（见表）。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间；而要分辨较小分子量的DNA片段，则要用聚丙烯酞胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小。
浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强，反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱，例如，20％的聚丙烯酰胺凝胶的分辨力可达1～6 bpDNA小片段，而要分离1000bp的DNA片段，则要用3％的聚丙烯酚胺的凝胶。
再如，2％的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子，而对于较大片段的DNA，则要用低浓度（0.3％～1.0％）的琼脂糖凝胶。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围(bp)0.3％琼脂糖 50 000 ～1 0000.7％琼脂糖 20 000 ～1 0001.4％琼脂糖 6000 ～ 3004.0%聚丙烯酰胺 1 000 ～ 10010.0%聚丙烯酰胺 500 ～ 2520.0%聚丙烯酰胺 50 ～ 1凝胶电泳既是一种分析的手段，也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。
有两种不同类型的琼脂糖凝胶，一种是常熔点的，另一种是低熔点的，而后者的价格却相当昂贵。
它们都是琼脂的衍生物，具有很高的聚合强度和很低的电内渗，因此都是良好的电泳支持介质。
LMP琼脂糖是一种熔点为62～65℃的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久，而在25℃下也可持续保持液体状态的10分钟， LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收ＤＮＡ分子。
分子生物学实验基本技术
分子生物学实验进程
实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化 实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化 实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR 实验六 Western印迹（上） 实验七 Western印迹（下） 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应 实验十 Northern印迹 实验十一 Southern印迹 考试
1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
段连接起来构成一个新的DNA分子的过程。
分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程。
分子生物学的实验技术
分子生物学的实验技术【分子生物学的实验技术】分子生物学作为现代生物科学领域的重要组成部分，以其独特的实验技术为研究人员提供了许多强有力的工具。
本文将对分子生物学中常见的实验技术进行介绍，包括DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、克隆和测序等。
一、DNA提取DNA提取是分子生物学研究的第一步，也是最基本的实验技术之一。
DNA提取的目的是从生物样本中分离出DNA，并纯化得到高质量的DNA溶液，以便后续实验使用。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、离心柱法和磁珠法等。
酚/氯仿法是一种传统的DNA提取方法，它利用酚和氯仿的不同密度分离DNA。
首先，将生物样本与裂解缓冲液混合并加入酚/氯仿混合液，通过离心分离出DNA在上层的细胞碎片，然后进行酚/氯仿再萃取和乙醇沉淀，最后得到纯化的DNA。
离心柱法是一种高效的DNA提取方法，它利用离心柱上的纤维素膜或硅胶膜对DNA进行捕获和纯化。
在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入离心柱进行离心，DNA能够通过纤维素膜或硅胶膜的作用被固定，而其他杂质则被洗脱掉，最后用纯化缓冲液洗脱得到高质量的DNA。
磁珠法是一种快速、高通量的DNA提取方法，它利用表面修饰的磁珠对DNA进行特异性捕获。
在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入磁珠混悬液，并利用磁力使磁珠与DNA结合，然后用磁力将磁珠与DNA一起沉淀到管壁上，洗脱杂质后得到纯化的DNA。
二、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种用于体外扩增DNA的技术，通过反复的循环性温度变化，可以扩增特定的DNA片段。
PCR由于其高度敏感和高效性，被广泛应用于基因分型、基因定量、基因突变分析等领域。
PCR反应的基本组成包括DNA模板、引物、聚合酶、四种脱氧核苷酸和缓冲液。
首先，将DNA模板与引物、脱氧核苷酸和缓冲液混合，并添加聚合酶，然后进行多次温度循环，包括变性、退火和延伸等步骤，从而使DNA模板经过反复扩增，最后得到目标DNA片段的数量大幅增加。
分子生物学常用技术(简化版)
Northern blot
类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测
in situ hybridization
原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布
FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色体定位
反 Northern 杂交与 DNA 芯片
DNA解旋解链
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
5’
3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
GGAUCG
5’
AUCGCG
5’
引物酶
引物酶
RNA引物
RNA引物
DNA解旋解链
引物合成
DNA的体内复制
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用
基本技术：
基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
综合技术：
基因诊断 基因治疗
应用技术：
第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补的未知核酸序列 用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
1.什么是耐热 DNA 聚合酶
早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I
在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶 延伸反应温度为 37℃，非特异性太多
目前常用 Taq DNA 聚合酶
纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticus) 可耐受 95℃ 高温，最适反应温度为 72℃ 左右
分子生物学实验基本技术
汇报人：
目录
分子生物学实验技 术概述
基因克隆和表达技 术
PCR技术和相关技 术
分子杂交和印迹技 术
基因编辑技术
蛋白质技术和蛋白 质组学
分子生物学实验技 术概述
添加标题
定义：分子生物学实验技术是指在分子水平上研究 生物现象和过程的技术，包括基因克隆、基因表达、 基因突变、基因重组等。
蛋白质组学在分子生物学实验中的应用：研究蛋 白质的功能、调控机制和疾病发生机制等
感谢您的观看
汇报人：
PCR技术和相关技 术
原理：通过DNA复制技术，将DNA片段扩增 步骤：包括模板DNA的制备、引物的设计、反应体系的配置、PCR反应的进行等 应用：广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域 相关技术：包括实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR等
原理：逆转录-聚合 酶链反应技术，将 RNA逆转录为cDNA， 再进行PCR扩增
添加标题
Northern印迹技术：用于检测RNA序列，通过电泳将RNA片段分离，然后用放射性标记的探 针进行杂交，最后通过放射自显影检测杂交信号。
添加标题
应用：Southern印迹和Northern印迹技术广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检 测等领域。
添加标题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优缺点：Southern印迹技术灵敏度高，但操作复杂，耗时长；Northern印迹技术操作简单， 但灵敏度较低。
基因编辑技术
应用：广泛应用于基因功能 研究、疾病治疗等领域
原理：利用Cas9蛋白对DNA进 行切割，形成双链断裂，从而 实现基因编辑
优势：操作简便、高效、精 确，可应用于多种生物体
局限性：存在脱靶效应，可 能导致非目标基因的突变
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术分子生物学是现代生物学研究的一个重要领域，通过对细胞分子结构和功能的研究，为生命科学的进一步发展提供了重要的思路和手段。
分子生物学常用技术是在研究这一领域中必不可少的工具，下面我将从不同角度介绍这些技术。
一、DNA 提取技术DNA 提取是分子生物学中的基本技术之一，通常用于从生物样品中提取纯净的 DNA。
提取后的 DNA 可以用于 PCR 扩增、基因测序、构建谱系树和基因克隆等研究。
常用的 DNA 提取方法包括：SDS 法、酚-氯仿法、纯物直提法、磁珠提取法等。
二、PCR 扩增技术PCR 扩增技术是一种高效、快速、精确的 DNA 复制技术，它可以将少量模板 DNA 扩增到数百万份，是分子生物学领域中最常用的技术之一。
PCR 扩增实验包括：反应体系的准备、扩增程序的设置、扩增产物的分离、测序和定量分析等步骤。
三、蛋白质电泳技术蛋白质电泳技术是一种将蛋白质分离、纯化、鉴定和定量的常用技术。
常见的蛋白质电泳实验包括：SDS-PAGE，氨基酸序列鉴定，二维凝胶电泳（2-DE）等。
蛋白质电泳技术可用于研究生物体内蛋白质的分布、结构、功能和相互作用关系。
四、基因编辑技术基因编辑技术是一种新兴的分子生物学技术，可用于修改细胞或生物体的基因组序列。
最常用的基因编辑技术是 CRISPR-Cas9 技术，它基于靶向特定 DNA 序列的小RNA和 Cas9 蛋白的结合，从而在特定的位置切割 DNA 分子，实现基因组修饰。
基因编辑技术在农业、医药、生物研究等领域具有广泛的应用前景。
五、RNAi 技术RNAi 技术是一种利用 RNA 干扰（RNA interference）机制抑制基因表达的技术。
RNAi 技术可以通过向细胞中导入或合成RNA 分子，干扰靶向基因的 mRNA 转录和翻译，从而抑制靶向基因的表达。
使用 RNAi 技术可研究基因功能、探索新型药物和开发生物技术等领域。
六、基因测序技术基因测序技术是一种将 DNA 或 RNA 分子序列确定下来的技术。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术是一门研究生物分子的结构、功能和相互作用的科学领域。
它通过一系列研究方法和实验技术，揭示生物体内分子的组成，研究其在生物规律中的作用，为生物科学的发展和应用提供了有力的支持。
本文将介绍几种常见的分子生物学技术及其在科学研究和应用中的重要性。
第一种技术是聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一种能够快速、准确地复制DNA片段的技术。
通过PCR，可以从微量的DNA模板扩增出大量的DNA片段，为后续的实验提供足够的样本。
PCR的过程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性过程中，DNA双链被加热分离为两条单链；在退火过程中，引物与目标DNA序列互补结合；在延伸过程中，DNA聚合酶通过合成新的DNA链。
PCR技术在基因克隆、基因检测和基因定量等领域得到广泛应用。
第二种技术是DNA测序。
DNA测序是确定DNA序列的方法。
通过对DNA分子进行测序，可以了解其中所包含的信息，以及基因在细胞中的功能。
测序的过程中，通常使用Sanger方法，也就是反复进行DNA聚合酶链式延伸反应，结果是生成一系列不同长度的DNA片段。
这些片段会被分离、检测和记录，得到DNA序列。
DNA测序技术对于遗传病的诊断和治疗、疾病基因的研究以及进化生物学的研究等有着重要意义。
第三种技术是凝胶电泳。
凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的方法。
凝胶电泳通过电场的作用，使带电粒子在凝胶基质中迁移，根据它们的大小和电荷进行分离。
凝胶电泳可实现DNA分子的分离和纯化，以及分析DNA片段的大小、形状和数量等信息。
凝胶电泳技术在基因分型、基因突变检测、DNA指纹鉴定等领域被广泛应用。
第四种技术是基因克隆。
基因克隆是指将DNA片段插入到载体DNA中，并通过细胞转化等方法使其复制。
基因克隆技术在分子生物学研究和基因工程中具有重要的应用价值。
通过基因克隆，可以扩大DNA 片段的数量，并将其引入到其他生物系统中进行研究。
分子生物学实验原理
分子生物学基本技术- -第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至10 00-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学是现代生物学的重要分支之一，其在疾病预防、治疗和生物科技等方面有广泛应用。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术，并讨论其原理和应用。
一、基本实验技术1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学实验中的基础技术之一。
DNA/RNA提取的目的是从细胞或组织中提取高质量的DNA或RNA，为其后续检测和研究做好准备。
现在市场上有多种DNA/RNA提取试剂盒，供实验室使用。
通常，提取DNA首先将组织/细胞裂解，然后进行蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和重溶等步骤。
而提取RNA则需要防止RNA酶的污染并保护RNA的完整性。
RNA提取常见的方法是直接裂解和三步酚-氯仿法等。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR反应是在一个热循环下进行的，包括退火、结合和扩增阶段。
其中，退火温度用于将引物与靶DNA结合，获得高特异性；扩增阶段用于扩增目标DNA片段，通常在72℃左右进行。
PCR技术广泛应用于疾病的诊断、基因多态性分析、DNA指纹鉴定和基因工程等方面。
对于基因工程，PCR技术在基因克隆、定量PCR、mutagenesis、突变扫描和芯片检测等方面也有重要应用。
3. 转染技术转染技术是指将外源基因或其他化合物转入目标细胞中的技术。
常用的转染方法包括：病毒介导的转染、电穿孔、化学转染及基于脂质体的转染等。
转染技术在基因治疗、模型建立、基因表达分析、药物筛选和基因敲除等方面都有广泛应用。
二、高级实验技术1. 基因测序技术基因测序是分子生物学中应用最广泛的技术之一，用于确定DNA序列。
常用的基因测序技术包括Sanger测序和新一代测序（NGS）技术。
Sanger测序是一种传统的测序技术，通过DNA聚合酶、DNA模板、引物和ddNTPs（二脱氧核苷三磷酸）来扩增和定序DNA。
此外，NGS技术的基本原理是平行测序，利用高通量测序技术对DNA样本进行重复测序，得到高质量的DNA序列。
分子生物学中的基本方法与技术
分子生物学中的基本方法与技术分子生物学是研究生命分子机制及其调控的一门学科。
基因作为生命的基本单位，从宏观上影响着生命的大小和形态，而分子生物学则通过一系列基本方法和技术，从微观层面研究基因的结构和功能，揭示生命现象的本质。
1. DNA的提取和纯化DNA是生命的重要分子，其结构和功能的研究是分子生物学的主要研究方向之一。
DNA的提取和纯化是DNA研究的第一步，常用的方法有基于盐、有机溶剂和柱层析等。
其中最常用的方法是盐提取法。
将细胞或组织破碎并混合盐水或Tris缓冲液，将其中的DNA片段与蛋白质分开，使DNA从物质混合物中分离出来。
接下来再用乙醇沉淀、柱层析或电泳等方法进行纯化。
2. PCR技术PCR技术是分子生物学最重要的技术之一，也是分子生物学发展的重要里程碑。
PCR技术是将DNA进行扩增，可以在较短时间内大量获得需要研究的靶标DNA。
PCR技术在分子生物学研究中具有广泛的应用，如基因克隆、基因突变和DNA测序等。
PCR技术的基本原理是利用特异性引物和DNA聚合酶，在体外模拟DNA的复制过程，将模板DNA中的特异性片段扩增数百倍。
PCR技术具有高度灵敏性，只需要极少量的模板DNA就可以进行扩增。
3. 蛋白质的分离与纯化蛋白质是生命活动的重要组成部分，其结构和功能的研究是分子生物学的另一个重要研究方向。
蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质结构和功能的前提，常用的方法有电泳法、柱层析和亲和层析等。
其中最常用的方法是电泳法。
电泳法是利用蛋白质在电场中的电性差异性，经过电泳分离、浓缩和纯化的过程。
电泳法分为凝胶电泳和毛细管电泳两种，二者原理不同，但是都具有分离蛋白质的优点，可以同时分离多个样品中的蛋白质。
4. RNA的提取和分析RNA是通过DNA转录生成的，具有传递基因信息和参与细胞转录调控等重要功能。
RNA的提取和分析是研究基因表达和调控的重要方法。
RNA的提取方法有多种，包括直接裂解法、载体分离法和正离子交换柱等。
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质粒提取的思路
质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质：
蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA
分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、
９． １２０００g ,4 ℃离心５分钟。
１０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠 倒数次，１２000g 于4 ℃离心２分钟。
１１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。
１２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶） 溶解DNA。
四．结果分析
１．质粒DNA OD260,OD280的值，由此 计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。
EDTA
ＡｍＰ 50mg/ml
溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）
试剂
溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA
实验仪器
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
Insert
EcoR1 1.9kb
Xho1
三．实验方法
１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含 AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度。
２．记录电泳结果并说明结果内容。
问题与讨论：
１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作 用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应 体系出现的现象及其成因。
２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现 的现象及其成因。
3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高 盐、低温条件下进行？
谢谢
２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒， 弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰 上放置5分钟。
４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容 物，冰上放置5分钟。
碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。
碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
☆原理示意图 返回目录 返回原理
——三个基本步骤：
细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化
实验试剂
ＬＢ培养基：
胰化蛋白胨 10g
酵母提取物 5g 定容
1000ml pH
7.5
NaCl
10g
ＳＴＥ：
0.1M
NaCl
10mMΒιβλιοθήκη Tris HCl(pH8.0)
1mM
2.严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的 拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。
质粒的应用
大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒
害致死的基因。
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的
Eppendorf管中。
(７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。)
８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
质粒类型
质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒
1.松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白， 完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白 质合成受抑制，质粒的复制依然进行。