有机磷酸酯类中毒及解救

有机磷酸酯类中毒及解救

Toxication and Detoxication of Organophosphates

【目的和原理】观察有机磷酸酯类（ organophosphates）中毒的症状，理解解救药阿托品、解磷定的解救作用及机制。掌握家兔耳缘静脉注射的方法。

Organophosphates通过抑制胆碱酯酶（ cholinesterase，AChE）活性，使乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）在体内堆积，产生中毒症状。抗胆碱药阿托品能解除有机磷酸酯类中毒的 M样症状，而解磷定可复活 AChE，恢复其水解ACh的能力，对M及N 样症状均有效，以缓解骨骼肌震颤的效果最快，两药合用可提高解救效果。

【实验动物】家兔，体重2.5～3.0kg。

【实验器材和药品】兔固定箱、测瞳尺、听诊器、注射器（5ml、10ml、20ml）、针头、兔耳夹、脱脂棉球、台秤、722分光光度计、恒温水浴箱、试管及试管架、加样器、 effendorff 管、滤纸。

10%美曲膦酯[敌百虫( depterex)]、0.05%硫酸阿托品（ atropine sulfate）、2.5%解磷定（pyridine aldoxime methiodide,PAM）、生理盐水（ saline）。

【实验步骤和观察项目】

1．健康家兔5只，称体重，分为5组，分别为空白对照组（甲）、模型组（乙）、给

解救药组：atropine组（丙）、PAM组（丁）、atropine + PAM组（戊），观察并记录各组家兔

的活动情况：呼吸（频率、幅度、肺呼吸音、有无呼吸困难，呼吸道有无分泌物等），瞳孔大小（ pupillary size），唾液分泌（ salivary secretion），大小便（ urination and defecation），肌

张力（muscular tension）及有无肌肉震颤（muscle tremor）等。

2．将甲、乙、丙、丁、戊、五只家兔分别放于兔固定箱内，甲兔由耳缘静脉给予 saline（1ml/kg）；乙、丙、丁、戊兔分别由耳缘静脉缓慢注入depterex（1ml/kg），给药后密切

观察上述指标的变化并记录。待 M样、N样中毒症状均较明显时，乙兔不予解救药，使其中毒症状充分表现出来，如果死亡，分析死亡原因；丙兔耳缘静脉注射 atropine（2ml/kg），丁

兔耳缘静脉缓慢注射 PAM（4ml/kg），戊兔耳缘静脉先 atropine（2ml/kg），而后注射 PAM （4ml/kg），观察中毒症状有何变化， atropine和PAM分别改善了哪些症状？

3. 实验结果记录:

一般呼吸心率瞳孔唾液大小便肌张力肌震颤

状态次/min 次/min 大小分泌

给药前

给敌百虫

给阿托品

附：胆碱酯酶活性测定（ determination of activity of AChE）

【目的和原理】学习 AChE活性的测定方法 ,观察中毒前后及使用不同解救药后 AChE活性的变化。

ACh在血液中被 AChE水解，产生醋酸和胆碱。在一定范围，水解的 ACh量与 AChE的

活性成正比。故在反应体系中，加入定量的 ACh使之参加

反应，通过测定剩余的 ACh即可

计算出水解 ACh的量，从而推算出 AChE活性。

ACh的呈色反应

ACh可与羟胺反应生成乙酰羟肟酸，后者在酸性条件下与三价铁离子形成褐色的羟肟

酸铁络合物，其颜色的深浅可反映 ACh含量。反应过程如下：

(1)

盐酸羟胺与氢氧化钠作用释放出游离羟胺

NH2OH·HCL+NaOH→NH2OH+NaCL+H2O

(2) 剩余 ACh与游离羟胺作用，生成羟肟酸化合物

（CH3）≡N—(CH2)2OCOCH3+NH2OH→CH3CONHOH +（CH3）3≡N—（CH2）2OH

(3)羟肟酸化合物在酸性环境中与三氯化铁生成褐色复合物（羟肟酸铁络合物）

酸性 Fe/3

FeCL3+CH3CONHOH

CH3CONHO+HCL

(棕红色)

【实验药品】

(1) 7×10-3mol/L氯化 ACh：取 ACh用蒸馏水配成 2.54％溶液，冰箱保存。用前以蒸

馏水 20倍稀释即成 7×10-3mol/L ACh溶液。

(2) 1mol/L盐酸羟胺（ NH2OH·HCL）：取 25g盐酸羟胺，加蒸馏水 359ml，冰箱保存。

(3) 3.5N NaOH。

(4) 4N HCL。

(5) 3.7×10-1mol/L三氯化铁（FeCL3·6 H2O ）：取 10g三氯化铁，加蒸馏水至 20ml，浓 HCl 0.84ml，加温溶解，最后加蒸馏水至 100ml制成 3.7×10-1mol/L三氯化铁（FeCL3 0.1N HCl）溶液。

(6) PH7.2的磷酸缓冲液：取Na2HPO4·12H2O16.72g和KH2PO42.72g加蒸馏水至100ml，冰箱保存。

【实验步骤】

(1)家兔在给药前、中毒症状明显后、给atropine待症状明显缓解后、给予 PAM解救后

0min、10min、20min、30min等时间点分别由兔耳缘静脉或股静脉取血0.5ml，测定 AChE 活性。具体步骤见表 1。

(2)取 20ml试管若干个，按表加入磷酸缓冲液 0.85~1ml，血样 0~0.15ml，置 37℃±1℃恒温水浴中预热 3~5min。

(3)加入 7×10-3mol/L ACh溶液 1.0ml（用加样器），于 37℃±1℃水浴中反应 40min，每隔 10min摇动一次。

(4)反应 40min后立即加入碱性羟胺（ 1mol/L NH2OH·HCL与 3.5N NaOH溶液在用前

20min等容混合，并不断震荡）4.0ml。

(5)依次加入 4N HCL和 3.7×10-1mol/L FeCL3各 2ml，每加入一种试剂都要充分振荡。

(6)上述反应液均用滤纸过滤，将滤液倒入比色杯中，以 530nm的波长比色。

(7)对照管（标准 ACh值）：为反应体系中全量 ACh对照。

空白管：为无血、无 Ach的其它试剂对照。

对照管与空白管操作步骤同其它样品（见表）。

以上操作顺序见表。

【实验结果】

1.计算酶活性：全血 AChE活性值以 0.15ml全血在 40min内水解 ACh的μmol数表示（μmol/0.15ml/40min）

①酶活性计算：

OD标准管—OD测定管

全血 AChE活性值 = ×7

OD标准管

②酶活性值百分数计算

样本 AChE活性值

×100%

正常全血 AChE活性值

1．绘制时效曲线

根据给予 PAM解救后几个时间点的 AChE活性值制图。

酶活性（％）

时间

【注意事项】

1.Depterex属于剧毒杀虫

剂，且可从皮肤吸收，如与手等接触后，应立即用清水清洗。

2.给家兔 depterex后，15min仍未出现中毒症状，可再追加 1/3剂量的 depterex溶液。

3.测定 AChE活性时，加入每种试剂时剂量一定要准确。