生物技术前沿进展之二RTPCR

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Real Time PCR常用术语
• Cycle threshold （又称 Ct值） 扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数
This curve crosses the threshold at cycle 23.1
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Ct值的获得
• 自动分析 • 手动分析
− 基线决定阈值 − 阈值决定Ct值
Real-time 实时检测
Quantitative PCR
68
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
69 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 11/26/2020
• 优点 − 价格便宜
− 大部分基因以及少量样品均适 用
• 缺点 − 价格稍贵
• 缺点 − 特异性稍差 − 必须要做 Melt curves − 不支持多重荧光设计 − 实验方法通常需要优化
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Real Time PCR实际状态
线形图谱Linear
半对数图谱Log
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Real Time PCR常用术语
Real Time PCR是如何实现的?
在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence）
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Real Time PCR是如何实现的?
随着扩增的进行, 荧光信号会随着PCR产物的增加 而增加
PCR
PCR product
Lots of PCR
PCR
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Real Time PCR是如何实现的?
Real-time PCR仪会纪录每个循环的荧光信号变化
Cycle 3 Filter A Sample 1 Bin N
5
Real Time PCR是如何实现的?
最后，Real Time软件会对采集到的数据进行分析
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Real Time PCR化学原理
荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？
TaqMan®
SYBR® Green I
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TaqMan® 化学原理 (又称 5’-Nuclease )
TaqMan REAL-TIME PCR
什么是Real Time PCR?
实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术 Technology to monitor, in real-time, the PCR
amplification of specific nucleic acid targets
2
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Baseline 基线的设置
• 软件自动设置基线
− 每个样品单独设置基线。 − 可以使每个样品拥有 “完美” 基线。 − 可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。
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Real Time PCR常用术语
• Threshold 阈值 在扩增曲线上，可以调节的一条水平线 告诉软件到哪里获得分析数据
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TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
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TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
?
25
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 很特别……
具有核酸外切酶活性， 可以“吃掉”结合到模板上的
DNA片段
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TaqMan® 化学原理
可能产生 非特异性PCR产物信号
定量结果不准确
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SYBR® Green I 化学原理
• 使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反 应产物的特异性 原始图谱
Fluorescence
Temperature
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SYBR® Green I 化学原理
• 使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反应 产物的特异性 导数图谱
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TaqMan® 化学原理
• TaqMan® 中会使用到两段短片段序列，称为双向 特异引物
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TaqMan® 化学原理
• TaqMan® 中第三段短片段序列称为探针，结合到 序列中间
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TaqMan® 化学原理
• 探针标记两种 染料分子
报告染料 Reporter dye
淬灭染料 Quencher dye
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
39
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
40
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
41
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
42
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
11
TaqMan® 化学原理
• 完整的探针
报告染料 Reporter dye
淬灭染料 Quencher dye
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TaqMan® 化学原理
• 完整的探针
光 (激发)
能量
报告染料Reporter没有荧光信号
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TaqMan® 化学原理
• 如果探针断裂了……
光 (激发)
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TaqMan® 放映开始
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TaqMan® 化学原理
• Denaturating of template（模板变性）
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TaqMan® 化学原理
• Annealing of oligos（引物退火）
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 登场……
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TaqMan® 化学原理
• 找到引物序列……
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TaqMan® 化学原理
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Ct值的获得
• 基线决定阈值
− Linear图里找基线，基线 对应 曲线形状
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Ct值的获得
• 阈值决定Ct值
− Log图里找阈值，指数期 对应 阈值
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AB 支持3种技术应用
End-point 终点检测
ห้องสมุดไป่ตู้
Presence/Absence
++- +
Allelic Discrimination
嗝!
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TaqMan® 化学原理
• 新的序列，新的信号！
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SYBR® Green I 化学原理
45
SYBR® Green I 化学原理
46
SYBR® Green I 化学原理
47
SYBR® Green I 化学原理
• 新的序列，新的信号！
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SYBR® Green I 化学原理
非特异结合任意 双链DNA
• Extension of primers（序列延伸）
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TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
21
TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
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TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
• Baseline 基线
定义背景区域: cycle-to-cycle 的范围
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Baseline 基线的设置
• 通常基线起点为 Cycle 3 …
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Baseline 基线的设置
• 通常基线终点设置在实验信号脱离噪音信号上升前
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Baseline 基线的设置
• 软件自动设置基线
软件自动为您 选定基线区域
Threshold
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Threshold 阈值的设置
• 最佳位置: Xn = X0 ·2n 成立（指数/对数扩增期）
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Threshold 阈值的设置
• 软件自动设定阈值
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Threshold 阈值的设置
• 软件自动设定阈值
− 对于不同的批次的实验，需要单独设置阈值 因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
Fluorescence
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Temperature
Real Time PCR化学原理
• 每个循环之后
− 理论上，反应管里的目标片断数会加倍。 − 荧光信号相应成比例增长。
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Real Time PCR化学原理
TaqMan®, 还是 . . . SYBR® Green I ?
• 优点 − 更高的特异性 − 不会有引物二聚体干扰 − 支持多重荧光实验设计 − 实验方法易于优化