放线菌的常温培养

放线菌的活菌计数与分离纯化

摘要：本次试验使用了含放线菌的固体制剂，在培养基中获取放线菌，并用平板涂布法进行活菌计数，然后挑取单菌落进行了纯培养，获取纯种的放线菌。

关键词：放线菌活菌计数平板分离技术

前言：本实验采用了活菌计数法中的平板涂布菌落技术法，通过梯度稀释和涂布平板，最终观察平板上的菌落数来计算原制剂中单位质量内含菌的数目，但由于不能绝对保证一个菌落只是有一个活细胞所形成的，计算出的活菌数称为菌落形成单位（CFU），CFU并不完全等同于样品种的活菌数。

由于放线菌的菌落形态与其他菌种的菌落形态大相径庭，所培养出的菌落通过观察即可大致的辨认出。通过对平板上单菌落的划线培养，获得由单一细菌形成的单菌落，再接入试管斜面上进行菌落的保存。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌种

固体菌制剂

1.1.2培养基

高氏1号培养基（可加如氯霉素作为放线菌分离培养基）

1.1.3溶液及试剂

氯霉素，盛9ml和4.5ml无菌水的试管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶

1.1.4仪器及其他用品

无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿等。

1.2方法

1.2.1稀释涂布平板法

1.2.1.1倒平板：将高氏1号琼脂培养基（含氯霉素1ml/1000ml）加热融化，冷却至55~60℃时，倒平板10个。

1.2.1.2制备土壤稀释液：称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，使细胞分散。用一支1ml无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中混合均匀，此为10-1 稀释液,10-2,10-3,10-4,10-5,和10-6几种稀释度的土壤溶液.

1.2.1.3涂布:将上述每种培养基的平板底部或培养皿盖周边用记号笔分别写上10-4,10-5,和10-63种稀释度字样,每种培养基的每稀释度标记3皿,然后用无菌吸管分别由10-4,10-5,和10-63管土壤稀释液中吸取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入0.2ml,用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀,然后改变方向90°沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处可改变方向用涂棒载涂布几次,室温下静置5-10min.

1.2.1.4:培养：将含高氏Ι号培养基倒置于28°C温室中培养3~5d.

1.2.1.5挑菌落：将培养后长出的单菌落分别挑去少量菌苔接种到高氏Ι号培养基的斜面上,置于28°C下温室培养;待菌苔长出后,检查其特征是否一致,同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物细胞.若发现有杂菌.需再次进行分离纯化,直到获得纯培养.

1.2.2平板划线分离法

1.2.2.1倒平板:按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。

1.2.2.2划线：在近火炎处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环。先在平板培养基的一边做第一次平板划

线，再转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线，再用相同的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线或再穿过第三次划线进行第四次划线划线完毕后，盖上培养皿，倒置于温室培养。

1.2.2.3挑菌落：从分离的平板上单个菌落挑取少许菌苔，涂在载玻片上，在显微镜下观察细胞的个体形态，结合菌落形态特征，综合分析。如为不纯，仍需平板分离法进行纯化，直至确认纯培养为止。