测定氨基酸的方法以及试剂

一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸
1.氨基酸测定原理：
食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。

2.测定氨基酸所用仪器:
真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。

用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。

3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法:
3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。

浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。

3.2试剂配制方法：
3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。

3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。

pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。

pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。

pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。

3.2.3. 茚三酮溶液
pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。

茚三酮溶液：取150mL二甲基亚砜(C2H6OS)和乙酸锂溶液(3.6.1)50mL加入4g水合茚三酮(C9H4O3·H2O)和0.12g还原茚三酮(C18H10O6·2H2O)搅拌至完全溶解。

二.液相法测定氨基酸
柱前衍生法：参见文献（高效液相色谱柱-前衍生化法测定饲料中的含硫氨基酸
柱前衍生化反相高效液相色谱法测定板蓝根中的氨基酸
高效液相色谱法测定酶促反应液中的L-半胱氨酸含量）
1.仪器:Waters2695 HPLC; Waters2998 PDA检测器；电热恒温鼓风干燥箱
色谱柱：Phenomenex Luna C18 (250mm×4.6mm,5μm)
试剂：流动相A：0.1mol/L醋酸钠缓冲液（以醋酸调pH6.5）-乙腈（93:7）
流动相B：乙腈-水（4:1）
梯度洗脱
检测波长：254nm
2.试剂：衍生试剂：PITC(异硫氰酸苯酯)；浓盐酸；三乙胺；正己烷；苯酚；氨基酸标准品衍生化试剂的配制方法：1mol/L三乙胺-乙腈溶液：取三乙胺7mL加乙腈稀释至50Ml
0.01mol/L PITC-乙腈溶液：取PITC 60μL加乙腈稀释至50mL
柱后衍生法：参见文献（高效液相色谱法同时测定糯米酒中17种氨基酸）
1.仪器：ShimadzuLC-20A高效液相色谱仪（在线脱气机，荧光检测器，柱温箱）；电子天平分析柱：钠离子交换柱（4.0×150mm,5μm）
保护柱：钠离子交换柱（3.0×20mm,5μm）
检测波长：350-450nm
梯度洗脱
2.试剂
流动相A：0.20mol/L柠檬酸钠（高氯酸调配pH至3.2）；
流动相B：0.60mol/L柠檬酸钠与0.20 mol/硼酸，（4mol/LNaOH调配pH至10.0）
流动相C: 0.2mol/LNaOH溶液；
OPA（氨基甲酸酯）衍生化试剂；
氨基酸标准品
三国标饲料中氨基酸测定GB/T18246-2000
详见国标。