PITC法氨基酸的测定
乳制品中L-羟脯氨酸的测定
乳制品中L-羟脯氨酸的测定1 引言皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。
对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。
L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即为“皮革奶”。
本实验提供两种L-羟脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测，可根据实际情况进行选择。
2 仪器与试剂2.1 仪器、器皿2.1.1 HPLC+紫外检测器2.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱（CAT#: 99751）。
2.1.3 11 mL水解瓶（CAT#: 55354）2.1.4 1.5 mL塑料离心管。
2.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.7 0.22 μm针式过滤器（CAT#:37177）。
2.1.8 2 mL样品瓶（瓶：CAT#:5323，盖CAT#:5325）2.2 试剂2.2.1 甲醇（CAT#:50102）。
2.2.2 乙腈（CAT#:50101）2.2.3 正己烷（CAT#:50115）2.2.3 三乙胺（CAT#:50131）2.2.4 冰醋酸（CAT#:50132）2.2.5 三乙胺（CAT#:50131）2.2.6 磷酸氢二钠（CAT#:50158）2.2.7 磷酸二氢钠（CAT#:50157）2.2.8 L-羟脯氨酸（CAT#:46587）2.2.9 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L），然后加水定容至100 mL。
2.2.10 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL。
2.2.11 衍生剂PITC溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。
葡萄酒中游离氨基酸的测定 高效液相色谱法(编制说明)
《葡萄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》行业标准编制说明（征求意见稿）一、工作简况1、任务来源本项目是根据工业和信息化部2010年第二批行业标准制修订计划，《葡萄酒中氨基酸测定方法》(计划号：2010-2865T- QB)，列入轻工行业标准计划。
主要起草单位：中国食品发酵工业研究院等。
本标准由全国食品发酵标准化中心归口，计划应完成时间为2011年。
在标准起草阶段，起草工作组确定以高效液相色谱法作为葡萄酒中氨基酸的测定方法，且该方法适用于游离态的氨基酸。
根据相关起草专家建议，为更准确、完整的说明标准中所采用的标准方法以及方法的适用对象，将原标准计划名称进行调整。
标准名称由《葡萄酒中氨基酸测定方法》变更为《葡萄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》。
2、主要工作过程起草阶段：2011年1月-2013年12月计划下达后起草工作组查阅国内外上有关葡萄酒中氨基酸测定的文献的基础上，拟建立液相色谱测定葡萄酒氨基酸的方法的方案，该方法操作方便，仪器普及率高。
但是葡萄酒中氨基酸含量较低（脯氨酸除外），给方法的研究带来较大的困难。
起草组采用过异硫氰酸苯酯（PITC ）、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸（AQC）和OPA 等不同的衍生剂开展了样品直接稀释，或氮吹浓缩、冷冻干燥等不同样品处理方法，以及比较外标、内标的等定量方法，测定方法的回收率或重复性都难以满足方法应用的要求。
2014年1月-2015年12月起草工作组重新考虑研究方案的思路通过查阅国际上有关葡萄酒中氨基酸测定的文献，结合葡萄酒中氨基酸含量较低的特点，决定采用柱前衍生-液相色谱-荧光检测器测定葡萄酒中氨基酸。
通过对不同衍生试剂的特点进行对比分析，结合葡萄酒中氨基酸的含量，选择丹黄酰氯-柱前衍生高效液相色谱法-荧光法进行葡萄酒中氨基酸测定。
对样品的处理方法、衍生反应条件、色谱分离条件等进行了优化，通过回收率、稳定性及精密度等一系列的研究，建立了高效液相色谱法-荧光法同时测定精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly) 、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr) 、脯氨酸(Pro)、γ-氨基丁酸（Gaba）、缬氨酸(Va1)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸(Phe)等14种氨基酸分析方法, 2015年12月，起草工作组在前期工作基础上形成标准征求意见稿。
氨基酸含量分析法
新增附录附录XX 氨基酸分析法氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。
根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。
进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。
蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。
本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。
不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。
由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。
在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。
在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。
第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
本方法的线性浓度范围为0.025～1.25µmol/ml。
试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
2010版药典氨基酸检测方法
附录XX 氨基酸分析法氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。
根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。
进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。
蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。
本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N －羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。
不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。
由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。
在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。
在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。
第一法PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。
本方法的线性浓度范围为0.025～1.25μmol/ml。
试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
氨基酸分析原理与方法
• 离子树脂分离柱。
（二）离子交换树脂：
• 用作氨基酸分离柱的固定相一般都是固体的合 成离子交换剂。作为理想的离子交换剂应符合 下列要求：
• 1.机械强度好 • 2.不溶解且具有很好的化学稳定性 • 3.均匀球状颗粒 • 4.当装入柱子后应有良好的透通性 • 5.交换容量大 • 6.离子交换基应是单一的官能性的
酸性氨基酸：天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺。 碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸。
2.按人体营养的需要又可分为必需氨基酸、半必 需氨基酸及非必需氨基酸（见下表）。
必需氨基酸 赖氨酸
色氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 蛋氨酸 缬氨酸
半必需氨基酸 组氨酸 精氨酸 甘氨酸 胱氨酸 酪氨酸
（（二二））氨氨基基酸酸的的分分类类：：
有两种分类： 1.按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：
中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨 酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱氨酸、半 胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨基酸类）。
• 二军大、天津总医院多家医学单位利用氨基酸分析技术 叙述了人体血高半胱氨酸含量的升高可导致动脉硬化及血 栓的形成。为医疗诊断病因提供了可靠的依据。
（二）饲料上的应用
• 1.质量控制：
• 各种饲料均由不同种类原料按一定比例配置而成，其中必 需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当，才能满足畜 禽身体合成蛋白质的需要。测定原料和产品中的氨基酸含 量，以达到保证质量的目的。同时氨基酸分析技术即可对 产品质量进行简单又防止伪劣产品进入市场。
氨基酸的分析方法综述
氨基酸的分析方法综述曾念辉(江西万安实验中学)摘 要:氨基酸电分析研究是生命科学中令人关注的课题。
本文就各种氨基酸的分析化学研究的最新进展进行了综述。
关键词:氨基酸 分析方法 综述0 前言氨基酸是生物体中重要的生命物质,是组成酶和蛋白质的基本单元。
作为小分子,氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用;作为配体,它可与多种金属离子配位,为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。
各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能,如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系,L一半胱氨酸能增强生物体的抗病能力,因此,准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
目前,对氨基酸的分析测定多采用离了交换色谱(IEC)、高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)等仪器,这些仪器所用的检测器包括紫外可见光谱吸收、荧光、化学发光等。
然而,由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱,自身又无荧光,因此不能直接检测。
通常需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性。
电化学方法以其简单、灵敏、无放射、无污染等特点越来越受到人们的关注。
本文对近年来各种化学方法分析氨基酸已获得的进展进行评述。
1 氨基酸的直接电化学分析对于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等电活性的氨基酸一般采用直接电分析法。
使用循环伏安法可以直接测定L-半胱氨酸,在pH值小于7的磷酸盐缓冲溶液中,在金电极上于0.96V处有一氧化峰,在-0.75V左右有一还原峰,氧化峰和还原峰的峰电流的大小与半胱氨酸的浓度成正比。
有研究报道,不经衍生化处理,可以直接检测色氨酸和酪氨酸的含量,分别置聚酰胺修饰的碳糊电极于以0.2mol/LHCl-C H3COONa(p H=3.0)为底液的色氨酸和酪氨酸溶液中,从0.5V- 1.50V进行循环伏安扫描,色氨酸和酪氨酸分别在0.94V和0.92V 呈现一个稳定的氧化峰,随扫描次数的增多,两个氧化峰的峰电流都减小,结合2.5次微分技术,色氨酸和酪氨酸的检测限可达到0.024mol/L和0.034mol/L,相对标准偏差分别为5.2%和7.%。
HPLC—PITC衍生法测定新疆葡萄树伤流液氨基酸含量的研究
２ Ｏ １ ３年 １ １月
新 疆 医 科 大 学 学 报 Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｘ ｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Hale Waihona Puke Ｖｏ ｌ ｜ ３ ６ Ｎｏ． １１
ＮＯＶ ２ Ｏ１ ３
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氨基酸分析解决方案及原理
氨基酸分析解决方案序列号：L009 作者：孔维超，顾春艳摘要氨基酸组成测定是蛋白质组学、食品质量检测以及药品质量检测中的重要分析项目。
由于该分析项目涉及的化合物种类繁多，且需要柱前或柱后衍生技术，对分析方法和分析产品具有较高要求。
迪马科技应用实验室分别以异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯作为衍生剂对蛋白质水解液和游离氨基酸注射液进行衍生，然后使用Diamonsil AAA柱进行分离，能够满足19种天然氨基酸的分析，各组分分离度较高、定量结果准确而稳定。
引言从化学角度讲，同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪酸均可称为氨基酸。
自然界存在300多种氨基酸，但构成天然蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸又称为天然氨基酸。
氨基酸通过氨基和羧基形成肽键(酰胺键)相互联结成多肽和蛋白质。
天然氨基酸上的氨基与羧基连在同一个C上，所以这些氨基酸均为α-氨基酸。
天然氨基酸分析是食品、饲料和药品分析的重要项目。
目前氨基酸分析常常采用这样两种方式：离子交换色谱分离-柱后衍生和柱前衍生-反相色谱法分离。
后者以操作灵活、费用低廉而被广泛应用。
在柱前衍生-反相色谱法分离中，异硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可与一级胺、二级胺反应，是理想的柱前衍生剂。
尽管天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，因而对于含蛋白食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸，PITC和DNFB均能与这些氨基酸生成稳定的衍生物。
氨基酸分析指导原则
附件：氨基酸分析指导原则草案公示稿氨基酸分析指导原则氨基酸分析系指采用适宜的方法测定蛋白质、多肽或其他药物制剂中氨基酸组成和/或含量。
药品中氨基酸分析通常采用基于高效液相色谱法分离的衍生化法，涉及样品的水解、衍生化反应、分离检测和数据处理等操作。
本指导原则概述了药品中氨基酸分析的基本要求、蛋白质和多肽样品的水解、常用测定方法及其数据分析，为药品中氨基酸的分析提供指导。
1 基本要求1.1仪器氨基酸分析使用的仪器通常是高效液相色谱仪或氨基酸分析仪。
高效液相色谱仪适用于柱前衍生化产物的分离检测；对于柱后衍生化法，由于离子交换分离过程的复杂性和对柱后衍生化反应装置的特殊要求等，一般使用商品化的氨基酸分析仪。
1.2内标物氨基酸分析常采用内标法，内标物应是非天然存在的一级氨基酸，易于获取且价格便宜，在水解过程保持稳定，其色谱响应应与浓度成线性关系，具有独特的保留时间且与待测氨基酸能有效分离。
常用的内标物包括正亮氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸、肌氨酸和硝基酪氨酸等。
内标物应在水解前或衍生化反应前添加到氨基酸混合物中，以消除由于水解、衍生化、取样、进样、溶液稳定性和色谱条件变化所导致的差异。
1. 3方法验证用于品种项下的氨基酸分析方法，包括样品水解，应参照分析方法验证指导原则（通则9101）进行方法学验证。
1.4水解管的清洗与要求为避免如手套粉末和指纹残留物等对分析结果的影响，水解管应清洗干净。
或使用一次性的水解管。
清洗方法：将水解管用1mol/L盐酸溶液中煮沸1小时，或将其浸泡在浓硝酸或浓盐酸-浓硝酸（1：1）混合液中1小时，再依次用高纯水、HPLC级甲醇冲洗，烘干并密封保存，以免再次污染。
2 蛋白质和多肽样品的水解蛋白质或多肽样品中的氨基酸是以结合形式存在，必须经过水解处理，形成游离氨基酸后才能进行氨基酸分析。
水解方法主要有酸水解，同时辅以碱水解。
酸水解中使用最广泛的是盐酸水解，所得氨基酸不消旋，但该方法引起一些氨基酸的破坏或部分破坏，如色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸被部分破坏，门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺分别转化为门冬氨酸和谷氨酸。
多肽类药物的氨基酸检测方法
多肽类药物的氨基酸检测方法多肽类药物的氨基酸组分测定步骤：多肽的水解方法→衍生→HPLC检测。
简述多肽药物的水解方式及衍生方法。
标签：氨基酸组分；柱前衍生法；多肽药物多肽类药物是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键、二硫键连接成一长链或环状结构，常具备α螺旋、β折叠或不规则卷曲的二级结构。
多肽的一级结构决定了药物的高级结构及功能。
分析多肽类药物的氨基酸组成是进行多肽类药物结构确证不可缺少的部分。
氨基酸组成分析的步骤：多肽的水解方法→衍生→HPLC检测。
1 多肽的水解方法虽然多肽的氨基酸组成分析方法较多，且趋向更灵敏、更精确、更简便、更快速，但还没有一种方法可以单独适用于所有氨基酸残基的检测，并且很多因素如温度、时间、水解试剂、水解方法及多肽样品中添加剂等对水解程度均有影响。
常用的水解方法作简要介绍如下：1.1 酸性水解[1]酸性水解是应用最为广泛水解方法，可以使大多数氨基酸残基完全水解，最通用的水解剂是6 mol/L HCl。
条件：6 mol/L HCl、真空、110℃，水解时间为20～24h。
即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。
但在该条件下，天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸先用二硫代二丙酸、4-乙烯吡啶或碘代乙酸保护后水解方可测定，酪氨酸部分被水解液所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解。
有些脂肪族氨基酸残基间的肽键难于裂解，可以通过延长水解时间如水解92h甚至120h来解决。
1.2 碱性水解碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。
该水解方法是HCl水解的互补法。
因为碱水解时，多数氨基酸遭到破坏或外消旋化，仅色氨酸是稳定的。
所以此法仅限于测定色氨酸。
1.3 酶水解用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。
水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。
但是因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用，且反应需要较长的时间，水解不完全，酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰。
柱前衍生高效液相色谱法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量
柱前衍生高效液相色谱法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量梁卫青，魏克民，浦锦宝，祝永强，郑军献，胡轶娟（浙江省中医药研究院，杭州310007）摘要：目的用柱前衍生法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量，方法以磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-CL）作衍生剂，采用柱前衍生高效液相色谱法（RP-HPLC），YMC-Pack ODS-A柱(250×4.6mm，5µm)，流动相A为25mol/L KH2PO4，流动相B为乙腈：甲醇=70：30；流速1.5 ml/min梯度洗脱，检测波长436nm，柱温35℃，结果：各种氨基酸均具有良好的线性关系（相关系数r=0.9989～0.9999）、精密度（RSD＜1.50%）、稳定性（RSD＜3.50%）、平均回收率（98.83%～107.83%），测定蚕蛹提取物中氨基酸含量，其含有人体必需氨基酸占总氨基酸含量的40%以上，结论：该方法简便实用，分析结果准确可靠，适用于动植物中富有氨基酸含量的测定。
关键词：柱前衍生；蚕蛹提取物；氨基酸；高效液相色谱Determination of Amino Acids in silkworm extract by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization. Liang Weiqing, Wei Kemin, Pu Jinbao, Zhu Yongqiang, Zheng Junxian, Hu Yijuan, Zhejiang Academy Of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou, 310007, ChinaAbstract: Objective Determination of Amino Acids in silkworm extract by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization. Methods The technology of precolumn derivatization, along with high performance liquid DABS-CL, A high-efficiency YMC-Pack ODS-A column(250×4.6mm, 5 μm), The mobile phase was A: 25mol/L KH2PO4 and B: acetonitrile : methyl alcohol =70:30, at flow rate of 1.5 ml/min, peaks were detected at 436 nm, column temperature 35℃. Results All kinds of amino acids have a nice linear relations (r=0.9989~0.9999), precision (RSD<1.50%), stability (RSD<3.50%), the average recovery rate of amino acids (98.83%~107.83%), it contains more than 40% essential amino acid. Conclusio n The method is simple, precise and reliable. It can be used to determine Amino Acids in animal and plant.Key words: precolumn derivatization; silkworm extract; amino acid; RP-HPLC蚕蛹蛋白系全价蛋白，是理想的天然优质氮源，蚕蛹水解提取物中含有人体生长发育，新陈代谢所需要的十八种氨基酸，包括不能在体内合成的8种必需氨基酸，蚕蛹提取物的应用十分广泛，为能更好控制蚕蛹提取物中复合氨基酸[1-2]的质量，以确保作为高附加值药品、保健食品、化妆品的原料资源，需对其中各个氨基酸的含量作出准确可靠的分析。
柱前衍生化RP—HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量
柱前衍生化RP—HPLC测定鸡内金中16种氨基酸的含量采用酸水解法制备水解氨基酸样品溶液，以异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生化后进行HPLC分析。
采用Ultimate Prime C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A 0.1 mol·L-1醋酸钠溶液（调pH至6.5）-乙腈（93∶7），流动相B乙腈-水（8∶2）；流速1.0 mL·min-1；柱温40 ℃；检测波长254 nm；梯度洗脱。
氨基酸衍生溶液在36 h内保持稳定，16种氨基酸线性相关系数均大于0.999 5，加样回收率在98.01%～101.8%。
该方法操作简便，精密度和重复性良好，可用于鸡内金中16种水解氨基酸含量的测定。
标签：鸡内金；氨基酸；衍生化；异硫氰酸苯酯；高效液相色谱现代研究表明，鸡内金主要含有蛋白质、多种氨基酸、维生素和微量元素等。
氨基酸作为蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，是人体的必需营养成分之一。
笔者利用PITC柱前衍生化方法针对鸡内金中16种氨基酸类成分进行了测定。
1 材料Agilent HPLC1100系统：四元泵、真空在线脱气机、二极管阵列检测器（DAD）、Agilent ChemStation 工作站；BT25S電子天平（1/10万，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；FE20 pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。
16种氨基酸对照品，批号分别为L-天冬氨酸（Asp）110103，L-谷氨酸（Glu）110109，L-丝氨酸（Ser）120116，L-甘氨酸（Gly）120301，L-组氨酸（His）120112，L-精氨酸（Arg）101201，L-苏氨酸（Thr）120113，L-丙氨酸（Ala）120117，L-脯氨酸（Pro）100311，L-酪氨酸（Tyr）120201，L-缬氨酸（Val）120113，L-蛋氨酸（Met）110125，L-异亮氨酸（Ile）110801，L-亮氨酸（Leu）120117，L-苯丙氨酸（Phe）090712，L-赖氨酸（Lys）100423，以上对照品均购自上海友思生物技术有限公司，纯度均≥98%；10批鸡内金分别购买于安徽（1）、湖南（2）、浙江（3）、上海（4）、内蒙古（5）、广东（6）、江苏（7）、云南（8）、河北（9）、山东（10），由上海中医药大学修彦凤副教授鉴定为雉科动物家鸡G. gallus domesticus的干燥沙囊内壁。
PITC柱前衍生HPLC氨基酸比值测定
PITC柱前衍生高效液相法测定缩宫素氨基酸比值.、八、-一. 刖言目前，氨基酸检测主要应用氨基酸自动分析仪和HPLC随着HPLC勺发展，使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展。
HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。
HPLC检测氨基酸时，使用不同衍生剂反应后产生不同的衍生物，不同的衍生物所需色谱条件也有差别。
查阅相关的研究报告，所使用的衍生剂及色谱条件也不尽相同。
每种方法各有自己的优缺点，应根据所测样品的特性和仪器、试剂条件作出选择，最后选择异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法测定缩宫素氨基酸比值。
二•准备工作主要设备和试剂1.氨基酸分析专用柱（ 4.6 X 250，5um) 1支Agela 公司2.咼效液相检测仪 1 台安捷伦3.十八种氨基酸 1 套中检所4.异硫氰酸苯酯10 瓶Agela 公司5.三乙胺2 瓶Agela 公司试剂配制1.三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6ml，混匀。
2.异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2ml，混匀。
4 C 3天3.流动相A:称取三水醋酸钠25.3g （或无水醋酸钠15.2g ），加水1400ml，用冰醋酸调节pH6.5，用水使成1860ml，再加乙腈140ml，使成2000ml，0.45um醋酸纤维膜过滤。
4.流动相B: 80汇腈，0.45um有机膜过滤。
5.氨基酸标准贮备液中检所十八种氨基酸，105C 3小时。
使用十万分子一天平。
半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。
用0.1mol/L盐酸溶解至250ml。
衍生方法取标准品（样品）0.2ml，力卩100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液0.1ml，力卩1mol/L三乙胺乙睛溶液0.1ml，混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷，振摇，放置10分钟，取下层清液过滤后进样。
三•实验部分1.色谱条件选择1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。
氨基酸的pitc反应
氨基酸的pitc反应氨基酸的螯合反应（PITC反应）是一种氨基酸的化学定量方法，它基于氨基酸和2,4,6-三硝基苯基色氨酸（PITC）之间的反应，生成氨基酸- PTC 倍半胱氨酸衍生物。
该反应广泛应用于氨基酸序列分析、计算机模拟和分析氨基酸的物理化学性质。
实验方法实验所需试剂和仪器有：PITC、氨基酸标准物质、甲醇、三氯乙酸（TCA）、无水乙腈和高性能液相色谱仪（HPLC）等。
具体实验步骤如下：1.将待测氨基酸粉末称取一定量，加入2ml的6M HCl中。
然后用氮气吹干，使其转化为HCl盐酸盐。
2. 将HCl盐酸盐转到10ml烧杯中，加入1ml的甲醇、0.5ml的PITC溶液（浓度为2.5mg/ml）、3ml的甲醛，混合均匀并加热于水浴中（温度控制在60-70°C）反应30分钟。
3. 加入1ml三氯乙酸混匀，离心除去上层并取下下层，加1ml无水乙腈稀释。
4. 取10μl样品注入HPLC，用柱温控制在65-70°C，流速为1.0ml/min，检测波长为254 nm，可得到氨基酸衍生物的峰。
数据分析在HPLC图谱中，每种氨基酸衍生物在特定的保留时间出现。
通过使用标准的氨基酸，可建立氨基酸衍生物与浓度之间的线性关系，从而测定待测样品中氨基酸的浓度。
PITC反应的优点1. 只需少量样品即可进行定量分析，并且该方法对氨基酸有良好的选择性。
2. 该方法无需完全水解氨基酸，可减少水解所引起的样品损失和样品处理时间。
3. 该方法测定精确，且具有快速、简单等优点。
4. 它是一种广泛应用的定量方法，可以用于研究氨基酸的结构和功能，以及研究生化反应和代谢过程。
1.其中，若测定的氨基酸中含有暴露的二硫键，则测定结果将误高。
2. PITC反应是谷氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等化合物容易产生游离偏酸基，因此结果会出现偏差。
3. 氨基酸的 PITC 反应也需要强酸和有机试剂。
总结PITC反应是确定氨基酸浓度的一种可靠、高效和精确的方法，具有许多重要的应用价值。
PITC法氨基酸的测定
氨基酸的测定（）检验标准：□ GB/T 5009.124-2003 □其他检验日期：年月日温度：℃湿度： %仪器名称和编号：电子天平（编号：）高效液相色谱仪（编号：）氨基酸对照品溶液和供试品溶液的配制：正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸 mg，加0.02mol/L盐酸溶液100ml溶解。
（每1ml 相当于 1.0 mg）对照品溶液：取氨基酸贮备溶液（含各种氨基酸µmol/ml，公司、批号） 0.6 ml，加色氨酸对照品溶液〔取色氨酸（中检所，批号）mg置50ml量瓶中，加0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀〕 0.2 ml，加正亮氨酸内标溶液加 0.1 ml，再加 0.1 ml0.02 mol/L盐酸溶液, 混匀，得对照品溶液。
供试品溶液：取本品，按下述方法试验：□方法1 □方法2。
取样量（单位：□g□ml）□方法1：置顶空瓶中，加入6mol/L盐酸溶液 ml，抽真空或充氮气，封管，放入110℃烘箱中，水解24小时，冷却，打开封口，将水解液转移到 ml量瓶中，用水洗涤顶空瓶，合并洗涤液至量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.02 mol/L盐酸溶液溶解并定容至 ml。
□方法2：置 ml量瓶中，再加正亮氨酸内标溶液 ml，用0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
溶液配制：（1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，加乙腈（色谱纯）8.6ml，混匀（1mol/L三乙胺乙腈溶液）。
（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25µl，加乙腈（色谱纯）2ml，混匀（0.1mmol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液）。
氨基酸对照品溶液和供试品溶液的衍生：精密量取氨基酸对照品溶液及供试品溶液各200µl，分别置1ml离心管中，每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100µl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400µl，振摇后放置10分钟，取下层溶液（PTC－AA），用0.45µm微孔滤膜滤过。
PITC柱前衍生HPLC法测定黄精红曲酒中游离氨基酸含量
PITC柱前衍生HPLC法测定黄精红曲酒中游离氨基酸含量张孟; 吕启梅; 苏晓岚; 洒荣波【期刊名称】《《酿酒科技》》【年(卷),期】2019(000)011【总页数】5页(P65-69)【关键词】黄精红曲酒; 衍生化; 氨基酸; 检测【作者】张孟; 吕启梅; 苏晓岚; 洒荣波【作者单位】山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院山东泰安271000【正文语种】中文【中图分类】TS262.4; TS261.7红曲酒是中国传统名酒，属于汉代制曲酿酒的一个重大发明[1]。
红曲酒作为黄酒中的一种传统保健酒，具有活血化瘀、健脾暖胃之疗效，现代医学证实它还具有降血脂[2]、降血糖[3]、抗氧化[4]、降血压[5]等功效。
在红曲酒生产工艺的基础上，加入一种或多种中药材混合发酵，可以酿制保健红曲酒，在很大程度上迎合了人们对低度保健酒的需求。
黄精是我国传统的中草药，性平、味甘，具有补血益气、滋肾润肺、生津补脾等功效[6]。
泰山医学院酿造协会经过两年潜心研究，研发出了一种工艺成熟的具有保健功能的黄精红曲酒，相对于市场上的同类产品，具有独特的工艺特点和优势。
黄精红曲酒中含有多种生理活性物质和营养元素，如红曲色素[7]、MonacolinK[8-10]、氨基酸[11-12]、γ-氨基丁酸[13]等。
黄精红曲酒中的氨基酸一部分来自原料黄精，一部分来自微生物的代谢作用，是评价红曲黄酒风味和营养质量的一项重要指标[14]。
目前，氨基酸的测定方法有显色法、氨基酸自动分析仪、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等[15]。
其中，高效液相色谱法测定氨基酸以其灵敏度高、重复性好应用最为广泛，其原理是使用衍生试剂对氨基酸进行衍生后在检测器下的响应值进行定性和定量。
以异硫氰酸苯酯（PITC）作为柱前衍生剂的氨基酸分析方法以其反应速度快，产物单一、稳定性好等优点而得到广泛的应用，其与紫外检测器结合，可提供较高的灵敏度，检出限约为1 pmol/L[16]。
L-异亮氨酸高效液相色谱检测方法的研究
L-异亮氨酸高效液相色谱检测方法的研究唐艳;李晶;吴涛【摘要】L-异亮氨酸在紫外光区无吸收峰,需将其进行衍生后才能测定.通过对比两种柱前衍生方法,建立高效液相色谱法柱前衍生检测L-异亮氨酸质量分数的方法.OPA自动衍生法检测耗时15 min,R=1,加标回收率99%~100.1%,RSD<1.0%;PITC手动衍生法检测耗时30 min,加标回收率96%~98%,RSD<1%.O PA自动衍生法在检测的时效性和准确性方面均具有明显优势,可用来高效地检测L-异亮氨酸的质量分数,在生物发酵、饲料添加剂、食品添加剂和制药等领域具有较高的应用价值.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2017(046)004【总页数】4页(P220-223)【关键词】异亮氨酸;高效液相色谱;OPA;自动衍生;手动衍生【作者】唐艳;李晶;吴涛【作者单位】梅花生物科技集团股份有限公司 ,河北廊坊 065001;梅花生物科技集团股份有限公司 ,河北廊坊 065001;廊坊梅花生物技术开发有限公司 ,河北廊坊065001【正文语种】中文【中图分类】O657.72L-异亮氨酸(L-isoleucine)是人体必需氨基酸，是支链氨基酸的重要一员，具有促进体内蛋白质、酶和肽类激素合成等功能，在肌肉蛋白代谢中尤为重要[1]，主要用于治疗神经障碍、食欲减退和贫血等，有增强机体免疫力的功能，是氨基酸输液、氨基酸口服剂不可缺少的组分[2].此外，L-异亮氨酸被广泛运用于食品工业、化妆品、光化学和电化学等领域[3-4].L-异亮氨酸主要通过发酵法生产[5]，在生产中准确、高效地检测L-异亮氨酸质量分数显得至关重要.目前，介绍L-异亮氨酸测定方法的文献较少，采用纸层析法[6]、化学比色法[7]测定L-异亮氨酸准确度低，使用氨基酸分析仪测定成本较高[8]，不适用于生产测定.笔者对比了两种柱前衍生方法，建立了一种高效液相色谱法柱前衍生检测L-异亮氨酸质量分数的方法.1.1.1 主要仪器高效液相色谱仪(Agilent technologies 1200)，Mili-Q超纯水机(元原科贸)，电子天平(精度±0.000 1 g)(梅特勒-托利多)，真空泵磁力搅拌器、pH计FE20(梅特勒-托利多).1.1.2 主要试剂二水合磷酸二氢钠(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，邻苯二甲醛试剂(OPA)，硼酸缓冲液(安捷伦公司)，L-异亮氨酸标准物质(Sigma公司)，三乙胺、异硫氰酸苯酯(PITC)，蛋氨酸(生化试剂)，乙酸钠(色谱纯).1.2.1 OPA自动衍生法流动相A：称取6.24 g二水合磷酸二氢钠，转移到1 000 mL玻璃烧杯中，加入1 000 mL超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解，用氢氧化钠调节溶液pH值至7.80.流动相B：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10.1.2.2 PITC手动衍生法三乙胺乙腈溶液(1 mol/L)：取三乙胺695 μL，加乙腈4.30 mL.异硫氰酸苯酯乙腈溶液(1 mol/L)：取60 μL PITC，加乙腈4.94 mL.流动相A：V(乙腈)∶V(水)=80∶20.流动相B：乙酸钠水溶液50 mmol/L.1.3.1 OPA自动衍生法准确称取样品0.100 0 g，用蒸馏水定容至200 mL，备用.准确称取L-异亮氨酸标准物质0.100 0 g，用蒸馏水定容至100 mL，稀释成不同质量浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L).1.3.2 PITC手动衍生法内标物溶液制备：准确称取蛋氨酸0.400 0 g于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容，备用.对照品溶液制备：称取L-异亮氨酸适量，加水溶解，配制质量浓度为1 mg/mL的溶液.移取5 mL L-异亮氨酸标准物质溶液和2 mL内标物溶液，加水20 mL，混匀，备用.样品溶液制备：称取1 g异亮氨酸成品于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容.移取5 mL样品溶液和2 mL内标物溶液，加水20 mL，混匀，备用.1.4.1 OPA自动衍生色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron，柱温40 ℃，检测波长338 nm，进样量0.5 μL，流动相A为磷酸二氢钠溶液，流动相B为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10，流速为2 mL/min；梯度洗脱：0～1 min，0% B；1～9.8 min，57% B；9.8～10 min，100% B；10～12 min，100% B.1.4.2 PITC手动衍生色谱条件:色谱柱：Hypersil 5 AA-ODS 200 mm×2.1 mm，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm，进样量3 μL.梯度洗脱条件：φ(流动相A)∶φ(流动相B)=24%∶76%，保持20 min；φ(流动相A)∶φ(流动相B)=10%∶90%，保持10min.1.5.1 OPA自动衍生法将样品和标品稀释液过膜上机，自动衍生化反应，吸取硼酸缓冲液2.5 μL，样品0.5 μL，OPA 0.5 μL，混合空气3 μL，最大速度混合5 次，再吸取水32 μL，混合空气18 μL，最大速度混合2 次，注入色谱柱，进行色谱分析.1.5.2 PITC手动衍生法吸取对照品溶液及样品溶液各300 μL，分别置于1.5 mL离心管中，向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液150 μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液150 μL，混匀，室温放置1 h，然后加入正己烷600 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，用0.22 μm 水相针式过滤器过滤.待液相色谱稳定后，取上述溶液进行色谱分析.2.1.1 进样量的选择采用0.2，0.5，1.0，1.5 μL进样量进行衍生化反应，其中0.5 μL反应完全，平行测定样品RSD<1%，其他三种RSD>2%.综合考虑反应程度、结果精密度和准确度，确定进样量为0.5 μL.2.1.2 检测波长的选择用紫外检测器测定异亮氨酸质量分数，在波长338 nm有最大吸收峰，基线稳定，灵敏度高，在<262 nm处无峰.综合考虑待测组分最大吸收波长、灵敏度、分离度、基线稳定性，最终确定检测波长为338 nm.利用自动衍生方法，对不同质量浓度的标品(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L)进行色谱分析，出峰谱图见图1，X轴为标品浓度，Y轴为峰面积，出峰时间为7.5 min.制作标准曲线见图2，线性方程为Y=1 445.024 4X-2.090 2，相关系数R2=1.按本测定方法所确定的实验条件，对L-异亮氨酸标准品作质量分数验证，测定样品加标回收率，确保检测系统无影响，质量分数为99.5%的标准品，检测结果为99.2%，样品检测RSD<2%，加标回收率>99%，此方法准确度高、结果可靠.具体检测结果见表1.采用手动衍生方法测定L-异亮氨酸质量分数，蛋氨酸与异亮氨酸分离度高且稳定.选用蛋氨酸作为内标物质，采用加内标物质计算样品质量分数，排除系统进样量不精确导致的结果不准确.蛋氨酸出峰时间为10.5 min，L-异亮氨酸出峰时间为14.8 min，具体谱图见图3.采用加内标物蛋氨酸来计算结果：加标回收率为96%～98%，RSD<2%，检测结果见表2.通过上述结果可以得出：与PITC手动衍生法相比，采用OPA自动衍生法操作简单，引入人为误差小，检测耗时短，加标回收率高，检测结果更可靠.笔者建立的OPA自动衍生高效液相色谱法可准确、高效地检测L-异亮氨酸质量分数.【相关文献】[1] 王小生.必需氨基酸对人体健康的影响[J].中国食物与营养,2005(7):48-49.[2] 姜大勇,伊廷存.氨基酸生产应用现状与展望[J].中国果蔬,2014(10):55-58.[3] SUZUKI M, OWA S, KIMURA M, et al. Supramolecular hydrogels and organogels based on novel, L-valine and L-isoleucine amphiphiles[J]. Tetrahedron letters, 2005,46(2):303-306.[4] SUZUKI M, SATO T, KUROSE A, et al. New low molecular weight gelators based on L-valine and L-isoleucine with various terminal groups[J]. Tetrahedron letters,2005,46(2):2741-2745.[5] 龙辉.发酵法生产L-异亮氨酸的优化与控制策略研究[D].天津:天津科技大学,2014.[6] 陈吉宝,剑振.纸层析法分离氨基酸实验条件的优化[J].南阳师范学院学报,2014,13(12):28-31.[7] 张邦建,宋文军,张克旭.化学比色法测定发酵液中L-异亮氨酸的研究[J].天津师范大学学报(自然科学版),2005,25(2):29-32.[8] 齐建双,铁双贵,韩小花,等.氨基酸分析仪法快速测定玉米籽粒中赖氨酸含量[J].中国农学通报,2014(30):199-202.。
氨基酸的pitc反应
氨基酸的pitc反应
氨基酸的PITC反应是一种常用的氨基酸分析方法，它可以用于测定氨基酸的含量和组成。
PITC是一种具有亲电性的试剂，它可以与氨基酸中的氨基反应生成氨基酸-PITC衍生物，这种衍生物可以通过高效液相色谱（HPLC）进行分离和检测。
PITC反应的原理是利用PITC与氨基酸中的氨基反应生成氨基酸-PITC衍生物，这种衍生物具有良好的稳定性和较强的紫外吸收性，可以通过HPLC进行分离和检测。
在反应中，PITC首先与氨基酸中的氨基发生亲电加成反应，生成氨基酸-PITC中间体，然后中间体发生消旋反应，生成两种对映异构体，它们可以通过HPLC进行分离和检测。
PITC反应的步骤包括样品制备、反应、提取和检测。
样品制备是将氨基酸样品溶解在缓冲液中，然后加入PITC试剂，使其与氨基酸中的氨基反应生成氨基酸-PITC衍生物。
反应后，需要进行提取和纯化，以去除杂质和未反应的试剂。
最后，通过HPLC进行分离和检测，可以得到氨基酸的含量和组成。
PITC反应具有许多优点，如灵敏度高、选择性好、操作简便等。
它可以用于测定各种氨基酸的含量和组成，包括天然氨基酸、非天然氨基酸和蛋白质水解产物等。
此外，PITC反应还可以与其他分析方法结合使用，如毛细管电泳、质谱等，以提高分析的灵敏度和准确性。
氨基酸的PITC反应是一种常用的氨基酸分析方法，它可以用于测定氨基酸的含量和组成。
该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，可以广泛应用于生物化学、食品科学、医药等领域。
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氨基酸的测定（）
检验标准：□ GB/T 5009.124-2003 □其他
检验日期：年月日温度：℃湿度： %
仪器名称和编号：电子天平（编号：）
高效液相色谱仪（编号：）
氨基酸对照品溶液和供试品溶液的配制：
正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸 mg，加0.02mol/L盐酸溶液100ml溶解。
（每1ml 相当于 1.0 mg）
对照品溶液：取氨基酸贮备溶液（含各种氨基酸µmol/ml，公司、批号） 0.6 ml，加色氨酸对照品溶液〔取色氨酸（中检所，批号）mg置50ml量瓶中，加0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀〕 0.2 ml，加正亮氨酸内标溶液加 0.1 ml，再加 0.1 ml0.02 mol/L盐酸溶液, 混匀，得对照品溶液。
供试品溶液：取本品，按下述方法试验：□方法1 □方法2。
取样量（单位：□g□ml）
□方法1：置顶空瓶中，加入6mol/L盐酸溶液 ml，抽真空或充氮气，封管，放入110℃烘箱中，水解24小时，冷却，打开封口，将水解液转移到 ml量瓶中，用水洗涤顶空瓶，合并洗涤液至量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.02 mol/L盐酸溶液溶解并定容至 ml。
□方法2：置 ml量瓶中，再加正亮氨酸内标溶液 ml，用0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。
溶液配制：
（1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，加乙腈（色谱纯）8.6ml，混匀（1mol/L三乙胺乙腈溶液）。
（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25µl，加乙腈（色谱纯）2ml，混匀（0.1mmol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液）。
氨基酸对照品溶液和供试品溶液的衍生：
精密量取氨基酸对照品溶液及供试品溶液各200µl，分别置1ml离心管中，每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100µl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400µl，振摇后放置10分钟，取下层溶液（PTC－AA），用0.45µm微孔滤膜滤过。
色谱柱（分析柱）：Venusil XBP-C18柱（）
柱温：40℃
检测器：紫外、检测波长：254nm
流动相配制：
流动相A：称取25.2g三水醋酸钠，加水1850ml，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140ml，混匀，用0.45µm滤膜滤过。
流动相B： 80％乙腈溶液
流速：1.0 ml/min 进样量：2µl
梯度程序：
含量=平均f×供试品峰面积/内标峰面积/供试品浓度
结论判断依据：□企业标准□其他
检验结论：□符合规定□不符合规定。