高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案

1、仪器与试药

1.1 仪器

1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国）

1.2 药品与试剂

16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。

脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013.

乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果

2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。

2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表

所示的混合溶液。

取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。

衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。

2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸

缓冲液旋涡混匀，边混匀边加入20ul衍生剂，封口放置1分钟，放入55℃恒温水浴锅中保温10分钟，取衍生的对照溶液及供试品溶液各5ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每1mg（以总氮量计）中氨基酸含量。

2.4 准确度精密称取16氨基酸分别配制成3个浓度级别的溶液，每个浓度3个样品依法测定，计算测定回收率。

2.5精密度试验

2.5.1系统精密度试验取同一浓度样品连续进样6次，记录峰面积与保留时间并计算RSD值（RSD≤2.0%）。

2.5.2方法精密度试验平行制备6份样品，分别检测，记录峰面积与保留时间并计算RSD值（RSD≤2.0%）。

2.6专属性试验取已知浓度样品检测，标明各成分在图中的位置，要求各成分基本分离。

2.7线性考察试验精密称取16种氨基酸对照品制备成5份浓度不同的供试液，按照检测方法检测，以测得的峰面积作为被测物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归。求其回归方程、相关系数和线性图。

2.8 范围取三批样品依法检测含量，应为测试浓度的80%～120%。

2.9耐用性试验

2.9.1稳定性

取一批样品分别在0h、2h、4h、6h测定其含量，看各组分是否发生显著性变化。

2.9.2样品测定

取三批样品测定其含量，看是否在含量规定的范围内。

起草人：钏助胜、杨茜