柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸
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Ｄ ｎｙ Ｃ 法检 测 极 限与 Ｏ Ａ 和 Ｆ Ｃ 法相 ａｓｌ ｌ － Ｐ ＭＯ
［］ ．ｅ ｇＧ Ｊ ｕｈ ，． ａ Ｗｉｉ ｅ，．． ｉ ２ Ｃ Ｄ Ｊ ，． Ｈ ｇｅ ＥＶｎ ｒｇ Ｋ ＪＷｌ ｏ ｎ ． ｓ ｅｎ ｎ －
ｓｎＪＣ ｒｍ ｔｇ．２１３５１８） ｏ ， ｈｏ ａ ｒ，４ ，４（９２． ． ｏ ［］ ． ． ｉ ｉ ｓ ａ ，Ａ ｖｎｅ ｉ Ｃ ｒｍ ｔ ｒｐｙ ， ３ ＪＣ Ｇｄ ｎ ｅ ｌ ｄ ｇ ｔ ． ｄａｃ ｎ ｏ ａｏ ａｈ ｓ ｈ ｇ
氨基酸不稳定， 特别是甘 氨酸、 赖氨酸衍生物的信号 衰减很快， 此法多用于全自动的在线衍生（ｎｌｅ。 ｏ－ｎ） ｉ ４Ｏ Ａ法分析配合饲料氨基酸回收率较低， ．Ｐ 这可能 是配合饲料中的盐分影响了衍生（） ０ ｌ。
一、 邻苯二甲醛 Ｏ Ａ） Ｐ 法
邻苯二甲醛（Ｐ 衍生法， Ｏ Ａ） 早在１７年就由 ９１ Ｒ ｔ 提出， ｏｈ 由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍， 故
Ａ － Ｈ ＋Ｄ ｎｙ Ｃ Ａ Ｎ － ａｓ －ｌ Ｃ Ａ Ｎ ２ ａｓｌ ｌ Ａ Ｈ Ｄ ｎｙ Ｃ＋Ｈ ｌ ｌ
从仪器设备上讲， 均采用两元梯度淋洗， 需要两 台高压液相色谱泵， 紫外或荧光检测器等。 分析柱多 采用反相Ｃ８ Ｆ Ｃ法以反相Ｃ柱居多。 １ ＭＯ 柱， ８ 从仪器 生产厂家看， 惠普公司和吉尔森公司采用 Ｏ Ａ与 Ｐ Ｆ Ｃ结合法（ ， ｔｓ ＭＯ ２ Ｗａ ｒ公司则建议采用 ＰＴ ５ ） ｅ ＩＣ 法， 并推出了专用的氨基酸分析柱Ｐｃ－ａ 及衍生 ｉ Ｔｇ ｏ 工作站，Ｋ Ｌ Ｂ公司则认为 Ｏ Ａ Ｆ Ｃ和 ＰＴ Ｐ ＭＯ ＩＣ三 法均可使用。 在实际应用中，Ｐ Ｏ Ａ和Ｆ Ｃ在生理 ＭＯ 体液中应用较多， 而在食品和饲料工业中ＰＴ ＩＣ法 占主导地位。 据Ｆｒ 统计结果表明， ｓ ｔ 每年采用Ｏ Ａ Ｐ 法大约分析８０个生理体液样品，ＭＯ ＩＣ和 ００ Ｆ ＣＰＴ
最初作 为 一种柱后 衍 生剂 ， 来才作 为柱 前衍 生剂 后
二、 氯甲酸药甲醋（ 药基 ９ － 甲氧基狱酞氯，ＭＯ ） Ｆ Ｃ
氯 甲酸药 甲 酯 ナ 是多 肽合成 的氨基保 护剂 。 它能
使用 Ｊｎｓ ７ ｏｅ等（提出的衍生方法如 下 ） ：
Ｏ Ａ在２巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅 Ｐ － 速反应生成１硫代－ 烷基异叫哚（， － ２ － ８ 加成物可产生 ）
化和样品制备条件下， 最多只能分析１０ ＩＣ样 ５个Ｐ Ｔ
品， 可能是 由于存在痕量的 ＰＴ 这 ＩＣ衍 生剂造成 的。
四、 丹酰氯（ 二甲氨基萘磺酰氯 Ｄ ｎｙ－ｌ ａｓｌ ） Ｃ
ＤｎｙＣ 原是检测一、 ａｓｌ ｌ － 二级氨基酸的著名荧光 剂， 生成氨基酸衍生物可用反相液相色谱分离（， ２２ ２３ ） 衍生是按照Ｔｐｈ（） ａｕｉ４ ２提出的方法进行的：
Ｖｏ． ２ Ｍａｃｌ ｋ ｅ Ｉｃ ， ｗ ｒ ， ． ７ １ ８． ｌ２ ， ｒｅ Ｄｅｋ ｒ ．Ｎｅ Ｙｏｋ Ｐ ３ ， ９３ ｎ
［ Ｇ Ｍ Ｃｕ ， Ｔ Ｆａ ｅ ｅ ｅ，．Ｊ ｉＣ ｒ ４ ． ｃｌ ｇＷ．．ｒ ｋｎ ｒ ｒ ｒ， Ｌ ．ｈｏ ］ ｎ ｎ ｂｇ Ｊ ． ｑ
ｍ ｔ ｒ，１３ ，１ （９８． ａ ｇ．１ （）６３１８） ｏ ［］ ． ｒ ，．ｏａｋ ａ ，． ｈｏ ａｏｒ，９ ，５ ５ Ｐ Ｆ ｓ Ｌ Ｐｌｃ ｅ ｌ ＪＣ ｒｍ ｔ ．４９５７ ｔ ｌ ｔ ． ｇ
邻 苯二甲醛 （ Ｐ ） 、 甲酸 药甲酯 （ 叫９芴基 甲 Ｏ Ａ法 氯 或 － 氧 基羰酰 氯 Ｆ Ｃ 法 、 ＭＯ 异硫氰酸 苯酯 （Ｉ Ｃ 法和 ＰＴ ）
Ｏ Ａ法最大缺点是：． Ｐ １不能与带有仲氨基团的 脯氨酸或羟脯氨酸反应， 歉 因此做全谱分析时需配以 其它技术（ 如与Ｆ Ｃ衍生剂一起使用） ． ＭＯ 赖氨酸
（９ ０ ． １９ ）
［］ Ｒ ｔ ，ｎｌ ｈｍ．４ ，８（９１． ６ Ｍ． ｏ Ａ ａ Ｃ ｅ ，３８０１７） ｈ ．
ＰＴ ＩＣ作为柱前衍生试剂， 它可以和一、 二级氨
基酸反应 ， 在室温下仅十分钟即可完成 ， 反应产物在
基 酸结构 稳定 ， 在室温 下放置数 小时、 冰箱 中放 置数
周后分析， 都可得到良好的结果。 是采用ＰＴ 图４ ＩＣ
衍 生法 分析蛋 白水解液色谱 图。
原来氨基酸结构上引入苯环产生紫外吸收， 使得能 够用紫外检测器（５ｎ 检测一 般说来，ＩＣ氨 ２４ｍ） ＰＴ －
三、 异硫氢酸苯酯（ＩＣ ＰＴ ）
作为Ｅ ｍ ｎ 试剂 ＰＴ ｄ ａ（ ） ＩＣ最初广泛用于多肽及 蛋白质序列分析，９２ ｏｐ１提出用ＰＴ （ｄ １８年Ｋ ｏ［］ ６ ＩＣＥ － ｍ ｎ试剂） ａ 分析氨基酸，ｅ ｒｏ［ 和Ｂｄｎｍｙ Ｈ ｉｉ ｎ ］ ｉｉ ｅ－ ｎｋ ｌｇ ｅ［］ ｒ８ １完善了方法的衍生步骤， 反应如下：
Ｃ Ｏ Ａ。 ｌ Ｐ
不能给出高的灵敏度， 检测极限为５ｐ ｏ， ０ｍ ｌ仅为 Ｏ Ａ法和 Ｆ Ｃ法的１５ ． Ｐ ＭＯ ／０３值得注意的是使用 ＰＴ ＩＣ易于降低柱寿命， ｓ等人提出在有保护柱 Ｆｒ ｔ
情况下， 根色谱柱可令人满意地分析８０ ＭＯ 、 一 ０Ｆ Ｃ
７０ Ａ和５０ ｓｌ ｌ而尽管在严格的真空净 ０Ｏ Ｐ ０ ＤｎｙＣ， ａ －
ＰＴ ＩＣ柱前衍生反相Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ法有很好的分辨率 和较短的分析时间， 但最初的一些报道指出ＰＴ ＩＣ 方法的再现性低于茚三酮法， 如果样品存在非挥发 性盐类和洗涤剂， 都会使结果受到影响（ ， ９尤其对 天门冬氨酸、 谷氨酸、 组氨酸和赖氨酸影响最大。 但
最 近 几年 研 究 已经 证 明 ＰＴ ＩＣ方 法准 确 性 可 以和
技 术的发展， 为氨基酸分析提供了广阔的前景 。 目
前不少方法已趋于成熟， 并且逐步被临床化学、 蛋白 质化学、 生理研究以及食品、 饲料营养分析者所认可 与 采用。 这些方法大多具有衍生操作简洁， 哂 徊产生或 易于排除干扰物、 色谱分离分辨率高， 灵敏度高， 分
析时间短 以及仪器 简单 、 一机 多用等优点 。 也可 但也
变异系数一般为２ ．％ （Ｖ ， －３４ Ｃ ） 生理体液为４ ７ 手动衍生ｏ－ｎ）酪氨酸和组氨酸的大些， ％（ ｆｌｅ ｆｉ 为 ８ ０ 表１ －１％ 给出了Ｏ Ａ等方法测定结果与理论值 Ｐ
的 比较 。
有各自的欠缺与不足。 本文就是根据我们的经验及 有关的文献［ ］对 前应用最广、 ４， ５ 影响最大的几种 柱前衍生反相高效液相色谱测定氨基酸的方法— —
的荧光， 一般需在上机前萃取净化。 最近Ｂｔ ｒ４ ｅ ｅ１ ｎ（ ）
提出采用１ － 氨基金刚烷（Ｄ Ｍ） Ａ Ａ 与过量Ｆ Ｃ试 ＭＯ
剂反应 ， 生成衍 生物 可在全部 氨基 酸衍生物 之后 出 峰 ， 就排除 了试剂 峰的 干扰 。 技术 的应用 ， 这 该 无疑 使该法衍生步骤 简化 ， 且易于实现在线 自 动化 。
ＩＥ法相媲美。 Ｃ 现今ＰＴ ＩＣ衍生法已广泛应用于生
物 、 及 分析 （１ 材料 饲料 食品 中０） ２。 ， ２
ＰＴ ＩＣ法分析蛋白水解液中氨基酸的变异系数 一般为２ －４ ， 生理体液为３ ％ －５ 但组氨酸和胱氨
酸稍大， 分别为６ ％和１％。 给出ＰＴ ０ 表１ ＩＣ法与 值及ＩＥ方法的结果比较。 Ｃ 但是该方法也具有三个劣势：． １氨基酸衍生时 需要真空干燥以除去过量试剂， 使得ＰＴ ＩＣ法很难
Ｄ ｎｙ Ｃ 法 则为５０－６０个 。 ａｓｌ ｌ － ００ ００ 参考文 献 ［］ ． ｏ ，． ．ｐ ｋ ａ， Ｈ Ｓ ｉ Ａ ａＣｅ ． １ ＳＭｏ ｅＤＨ Ｓａ ｍ ｎＷ． ．ｔｎ ｎｌ ｈｍ ， ｒ ｃ ｅ， ．
３ ， １５ ９ ８ ． ０ １８ ５）
ＤｎｙＣ 衍生方法比较简单， ａｓｌ ｌ － 尽管一些报道说 衍生物产率决定于 ＤｎｙＣ 与氨基酸比例， ａｓｌ ｌ － 但经 Ｔｐｈ等改变一些条件后， ａｕｉ 解决了这一问题， 最适 合的比例一般为５１ ０１ ：－１：。 ＤｎｙＣ 与氨基酸反应时间比较重要， ａｓｌ ｌ － 在室温 及避光条件下需３分钟左右。 ５ 反应产物转化率与反 应时间关系很大， 而且温度升高可以加速产物转化， 但最高不可超过６ ， ０ 否则Ｄ ｎｙＣ 会发生水解， ａｓｌ ｌ － 反而使产物转化率降低。 为ＤｎｙＣ 法测定氨 图５ ａｓｌ ｌ － 基酸的标准色谱图。 给出了ＤｎｙＣ 法测定结 表１ ａｓｌ ｌ － 果与离子色谱法比较。
干扰分离与检测， 不必除去过量试剂， 色谱图基线也 比较平稳。 为Ｏ Ａ衍生法测定蛋白水解液的色 图１ Ｐ
谱图。
Ｏ Ａ柱前衍生反相ＨＰＣ法比传统柱后衍生 Ｐ Ｌ 有更高的分辨率和灵敏度（ ９ ）多数氨基酸检测极限 为０５ｍ ｌ以信噪比２５１ ， ．ｐ ｏ（ ．：计）只有组氨酸和赖氨
酸较 高， 别 为２５ ３５ｍ ｌ Ｐ 法蛋 白水 解液 分 ． 和 ．ｐ ｏ Ｏ Ａ
与带有伯、 仲氨基团的氨基酸反应， 生成衍生物可被 反相高压液相色谱分离。 衍生物又具有荧光（ 也有紫 外吸收）使Ｆ Ｃ逐步成为 一 ， ＭＯ 个氨基酸分析中新 型柱前衍生剂。 该方法是Ｊｓｆｓ （） ｏｅｓ ｎ１提出的， ｅｏ １ 反应 式如图３ 所示。 Ｆ Ｃ与氨基酸反应迅速， ＭＯ 室温下约３ｓ ０即可 完成。 反应产物稳定， 在４ 避光条件下可储存１天 ３
（ 国家饲科 质量监督检验测 试中心 ， 北京 １０８ ） ００１
Hale Waihona Puke 测， 又可做一般的紫外吸收检测。 紫外检测线性范围
为 １－ ２０ｍ ｌ荧 光 为 ０８ １ｐ ｏ。 Ｐ 本身 不 ０ ０ｐ ｏ ．－ ５ｍ １ Ａ Ｏ
度以及 自动化程度有了很大的进步 ， 白 而且以此为 基础， 建立了食品、 饲料等有关 基酸分析的一系列 国际和国家标准。 然而， 随着氨基酸分析应用领域的 扩展， 氨基酸测定仪用途单 一结构复杂、 、 价格 贵 等缺点日显突出。 七十年代以来， 自 随着高效液相色 谱的发展， 特别是键合反相色谱的应用及柱前衍生
速度（１ Ｆ Ｏ １ ３ Ｍ Ｃ法最大优点是不受样品基质的干 ２） ，
扰（ 如盐分）图２ ＭＯ 。 为Ｆ Ｃ法分析蛋白水解液色谱
图。
Ｆ Ｃ法蛋白水解液的结果变异系数一般为 ＭＯ ２ ％， －３ 只有组氨酸变异系数较大， －９ 生理 为８ ％， 体液变异系数为３ ％， －５ 测定结果均与传统离子色 谱法和理论值相近（ 见表１ ） Ｆ Ｃ柱前衍 生反相 Ｈ Ｌ ＭＯ Ｐ Ｃ法的缺点是， Ｆ Ｃ在衍生过程中易产生试剂的水解反应， ＭＯ 过量 的Ｆ Ｃ与其水解产物均有和Ｆ Ｃ氨基酸类似 ＭＯ ＭＯ －
实现操 作全 部 自动化 ；． ＩＣ 氨基酸 不具 有荧光 ， ２ＰＴ －
的方法 ， 椒 各有其独到之处 。 蛋白水解液 四种方 法 分析
大约都需２分钟， ０ 检测极限：Ｐ Ｆ Ｃ Ｄｎｙ Ｏ Ａ ＭＯ ａｓｌ － Ｃ ＰＴ ， ｌ ＩＣ 衍生物稳定性：ＩＣ Ｆ Ｃ ａｓ－ ＰＴ ＭＯ 綝Ｄｎｙ ｌ Ｃ Ｏ Ａ， ｌ Ｐ 衍生所耗时间：ＭＯ ＰＴ Ｄｎｙ Ｆ Ｃ ＩＣ ａｓｌ －
柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸
梁冬生
自 从Ｍｏｒ等 提出色谱法定量分析氨基酸以 ｏ ｅ 来， 传统的离子交换色谱及柱后茚三酮衍生检测方 法始终占着主导地位。 三十多年来， 人们对该法及仪
器做 了大量 的研 究与改进工作 ， 使分析的灵 敏度 、 速
常碧影
荧光 ， 在紫外 区有较强 吸收 。 可做高 灵敏度荧光检 它
之久 ， 在酸性 条件下也可稳定３ｈ以上 。 ０ 反应有很 高
表１ 蛋白水解 ６ ｏＬ ｌ ） 液（ ｌ Ｈ ２ 理论值与测定值比较（ ｍ ／ Ｃ ４ ｈ 参考文献［６ ２］
的灵敏度， 检测极限为１ｍ ｌ ｐ ｏ（ 信噪比为２５１， ．： 可与 Ｏ Ａ法相媲美。 Ｐ 色谱分离中有很好的分辨率和分离
及胱氨酸衍 生物荧光较弱 ， 度低 ， 灵敏 近年来 有 人 提 出加 Ｂｉ５ ｒ３和碘 乙酸 酯使其 灵敏 度提 高 ３ Ｐ ｊ ． Ａ的 Ｏ
丹酰氯（ 二 即 甲氨基萘磺酰氯 ＤｎｙＣ） ａｓｌ ｉ法进行讨 － 论和研究， 介绍它们的基本原理、 特点， 列出各自的 色谱图和有关数据（ 与离子色谱法比较） 等。
［］ ．ｅ ｇＧ Ｊ ｕｈ ，． ａ Ｗｉｉ ｅ，．． ｉ ２ Ｃ Ｄ Ｊ ，． Ｈ ｇｅ ＥＶｎ ｒｇ Ｋ ＪＷｌ ｏ ｎ ． ｓ ｅｎ ｎ －
ｓｎＪＣ ｒｍ ｔｇ．２１３５１８） ｏ ， ｈｏ ａ ｒ，４ ，４（９２． ． ｏ ［］ ． ． ｉ ｉ ｓ ａ ，Ａ ｖｎｅ ｉ Ｃ ｒｍ ｔ ｒｐｙ ， ３ ＪＣ Ｇｄ ｎ ｅ ｌ ｄ ｇ ｔ ． ｄａｃ ｎ ｏ ａｏ ａｈ ｓ ｈ ｇ
氨基酸不稳定， 特别是甘 氨酸、 赖氨酸衍生物的信号 衰减很快， 此法多用于全自动的在线衍生（ｎｌｅ。 ｏ－ｎ） ｉ ４Ｏ Ａ法分析配合饲料氨基酸回收率较低， ．Ｐ 这可能 是配合饲料中的盐分影响了衍生（） ０ ｌ。
一、 邻苯二甲醛 Ｏ Ａ） Ｐ 法
邻苯二甲醛（Ｐ 衍生法， Ｏ Ａ） 早在１７年就由 ９１ Ｒ ｔ 提出， ｏｈ 由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍， 故
Ａ － Ｈ ＋Ｄ ｎｙ Ｃ Ａ Ｎ － ａｓ －ｌ Ｃ Ａ Ｎ ２ ａｓｌ ｌ Ａ Ｈ Ｄ ｎｙ Ｃ＋Ｈ ｌ ｌ
从仪器设备上讲， 均采用两元梯度淋洗， 需要两 台高压液相色谱泵， 紫外或荧光检测器等。 分析柱多 采用反相Ｃ８ Ｆ Ｃ法以反相Ｃ柱居多。 １ ＭＯ 柱， ８ 从仪器 生产厂家看， 惠普公司和吉尔森公司采用 Ｏ Ａ与 Ｐ Ｆ Ｃ结合法（ ， ｔｓ ＭＯ ２ Ｗａ ｒ公司则建议采用 ＰＴ ５ ） ｅ ＩＣ 法， 并推出了专用的氨基酸分析柱Ｐｃ－ａ 及衍生 ｉ Ｔｇ ｏ 工作站，Ｋ Ｌ Ｂ公司则认为 Ｏ Ａ Ｆ Ｃ和 ＰＴ Ｐ ＭＯ ＩＣ三 法均可使用。 在实际应用中，Ｐ Ｏ Ａ和Ｆ Ｃ在生理 ＭＯ 体液中应用较多， 而在食品和饲料工业中ＰＴ ＩＣ法 占主导地位。 据Ｆｒ 统计结果表明， ｓ ｔ 每年采用Ｏ Ａ Ｐ 法大约分析８０个生理体液样品，ＭＯ ＩＣ和 ００ Ｆ ＣＰＴ
最初作 为 一种柱后 衍 生剂 ， 来才作 为柱 前衍 生剂 后
二、 氯甲酸药甲醋（ 药基 ９ － 甲氧基狱酞氯，ＭＯ ） Ｆ Ｃ
氯 甲酸药 甲 酯 ナ 是多 肽合成 的氨基保 护剂 。 它能
使用 Ｊｎｓ ７ ｏｅ等（提出的衍生方法如 下 ） ：
Ｏ Ａ在２巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅 Ｐ － 速反应生成１硫代－ 烷基异叫哚（， － ２ － ８ 加成物可产生 ）
化和样品制备条件下， 最多只能分析１０ ＩＣ样 ５个Ｐ Ｔ
品， 可能是 由于存在痕量的 ＰＴ 这 ＩＣ衍 生剂造成 的。
四、 丹酰氯（ 二甲氨基萘磺酰氯 Ｄ ｎｙ－ｌ ａｓｌ ） Ｃ
ＤｎｙＣ 原是检测一、 ａｓｌ ｌ － 二级氨基酸的著名荧光 剂， 生成氨基酸衍生物可用反相液相色谱分离（， ２２ ２３ ） 衍生是按照Ｔｐｈ（） ａｕｉ４ ２提出的方法进行的：
Ｖｏ． ２ Ｍａｃｌ ｋ ｅ Ｉｃ ， ｗ ｒ ， ． ７ １ ８． ｌ２ ， ｒｅ Ｄｅｋ ｒ ．Ｎｅ Ｙｏｋ Ｐ ３ ， ９３ ｎ
［ Ｇ Ｍ Ｃｕ ， Ｔ Ｆａ ｅ ｅ ｅ，．Ｊ ｉＣ ｒ ４ ． ｃｌ ｇＷ．．ｒ ｋｎ ｒ ｒ ｒ， Ｌ ．ｈｏ ］ ｎ ｎ ｂｇ Ｊ ． ｑ
ｍ ｔ ｒ，１３ ，１ （９８． ａ ｇ．１ （）６３１８） ｏ ［］ ． ｒ ，．ｏａｋ ａ ，． ｈｏ ａｏｒ，９ ，５ ５ Ｐ Ｆ ｓ Ｌ Ｐｌｃ ｅ ｌ ＪＣ ｒｍ ｔ ．４９５７ ｔ ｌ ｔ ． ｇ
邻 苯二甲醛 （ Ｐ ） 、 甲酸 药甲酯 （ 叫９芴基 甲 Ｏ Ａ法 氯 或 － 氧 基羰酰 氯 Ｆ Ｃ 法 、 ＭＯ 异硫氰酸 苯酯 （Ｉ Ｃ 法和 ＰＴ ）
Ｏ Ａ法最大缺点是：． Ｐ １不能与带有仲氨基团的 脯氨酸或羟脯氨酸反应， 歉 因此做全谱分析时需配以 其它技术（ 如与Ｆ Ｃ衍生剂一起使用） ． ＭＯ 赖氨酸
（９ ０ ． １９ ）
［］ Ｒ ｔ ，ｎｌ ｈｍ．４ ，８（９１． ６ Ｍ． ｏ Ａ ａ Ｃ ｅ ，３８０１７） ｈ ．
ＰＴ ＩＣ作为柱前衍生试剂， 它可以和一、 二级氨
基酸反应 ， 在室温下仅十分钟即可完成 ， 反应产物在
基 酸结构 稳定 ， 在室温 下放置数 小时、 冰箱 中放 置数
周后分析， 都可得到良好的结果。 是采用ＰＴ 图４ ＩＣ
衍 生法 分析蛋 白水解液色谱 图。
原来氨基酸结构上引入苯环产生紫外吸收， 使得能 够用紫外检测器（５ｎ 检测一 般说来，ＩＣ氨 ２４ｍ） ＰＴ －
三、 异硫氢酸苯酯（ＩＣ ＰＴ ）
作为Ｅ ｍ ｎ 试剂 ＰＴ ｄ ａ（ ） ＩＣ最初广泛用于多肽及 蛋白质序列分析，９２ ｏｐ１提出用ＰＴ （ｄ １８年Ｋ ｏ［］ ６ ＩＣＥ － ｍ ｎ试剂） ａ 分析氨基酸，ｅ ｒｏ［ 和Ｂｄｎｍｙ Ｈ ｉｉ ｎ ］ ｉｉ ｅ－ ｎｋ ｌｇ ｅ［］ ｒ８ １完善了方法的衍生步骤， 反应如下：
Ｃ Ｏ Ａ。 ｌ Ｐ
不能给出高的灵敏度， 检测极限为５ｐ ｏ， ０ｍ ｌ仅为 Ｏ Ａ法和 Ｆ Ｃ法的１５ ． Ｐ ＭＯ ／０３值得注意的是使用 ＰＴ ＩＣ易于降低柱寿命， ｓ等人提出在有保护柱 Ｆｒ ｔ
情况下， 根色谱柱可令人满意地分析８０ ＭＯ 、 一 ０Ｆ Ｃ
７０ Ａ和５０ ｓｌ ｌ而尽管在严格的真空净 ０Ｏ Ｐ ０ ＤｎｙＣ， ａ －
ＰＴ ＩＣ柱前衍生反相Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ法有很好的分辨率 和较短的分析时间， 但最初的一些报道指出ＰＴ ＩＣ 方法的再现性低于茚三酮法， 如果样品存在非挥发 性盐类和洗涤剂， 都会使结果受到影响（ ， ９尤其对 天门冬氨酸、 谷氨酸、 组氨酸和赖氨酸影响最大。 但
最 近 几年 研 究 已经 证 明 ＰＴ ＩＣ方 法准 确 性 可 以和
技 术的发展， 为氨基酸分析提供了广阔的前景 。 目
前不少方法已趋于成熟， 并且逐步被临床化学、 蛋白 质化学、 生理研究以及食品、 饲料营养分析者所认可 与 采用。 这些方法大多具有衍生操作简洁， 哂 徊产生或 易于排除干扰物、 色谱分离分辨率高， 灵敏度高， 分
析时间短 以及仪器 简单 、 一机 多用等优点 。 也可 但也
变异系数一般为２ ．％ （Ｖ ， －３４ Ｃ ） 生理体液为４ ７ 手动衍生ｏ－ｎ）酪氨酸和组氨酸的大些， ％（ ｆｌｅ ｆｉ 为 ８ ０ 表１ －１％ 给出了Ｏ Ａ等方法测定结果与理论值 Ｐ
的 比较 。
有各自的欠缺与不足。 本文就是根据我们的经验及 有关的文献［ ］对 前应用最广、 ４， ５ 影响最大的几种 柱前衍生反相高效液相色谱测定氨基酸的方法— —
的荧光， 一般需在上机前萃取净化。 最近Ｂｔ ｒ４ ｅ ｅ１ ｎ（ ）
提出采用１ － 氨基金刚烷（Ｄ Ｍ） Ａ Ａ 与过量Ｆ Ｃ试 ＭＯ
剂反应 ， 生成衍 生物 可在全部 氨基 酸衍生物 之后 出 峰 ， 就排除 了试剂 峰的 干扰 。 技术 的应用 ， 这 该 无疑 使该法衍生步骤 简化 ， 且易于实现在线 自 动化 。
ＩＥ法相媲美。 Ｃ 现今ＰＴ ＩＣ衍生法已广泛应用于生
物 、 及 分析 （１ 材料 饲料 食品 中０） ２。 ， ２
ＰＴ ＩＣ法分析蛋白水解液中氨基酸的变异系数 一般为２ －４ ， 生理体液为３ ％ －５ 但组氨酸和胱氨
酸稍大， 分别为６ ％和１％。 给出ＰＴ ０ 表１ ＩＣ法与 值及ＩＥ方法的结果比较。 Ｃ 但是该方法也具有三个劣势：． １氨基酸衍生时 需要真空干燥以除去过量试剂， 使得ＰＴ ＩＣ法很难
Ｄ ｎｙ Ｃ 法 则为５０－６０个 。 ａｓｌ ｌ － ００ ００ 参考文 献 ［］ ． ｏ ，． ．ｐ ｋ ａ， Ｈ Ｓ ｉ Ａ ａＣｅ ． １ ＳＭｏ ｅＤＨ Ｓａ ｍ ｎＷ． ．ｔｎ ｎｌ ｈｍ ， ｒ ｃ ｅ， ．
３ ， １５ ９ ８ ． ０ １８ ５）
ＤｎｙＣ 衍生方法比较简单， ａｓｌ ｌ － 尽管一些报道说 衍生物产率决定于 ＤｎｙＣ 与氨基酸比例， ａｓｌ ｌ － 但经 Ｔｐｈ等改变一些条件后， ａｕｉ 解决了这一问题， 最适 合的比例一般为５１ ０１ ：－１：。 ＤｎｙＣ 与氨基酸反应时间比较重要， ａｓｌ ｌ － 在室温 及避光条件下需３分钟左右。 ５ 反应产物转化率与反 应时间关系很大， 而且温度升高可以加速产物转化， 但最高不可超过６ ， ０ 否则Ｄ ｎｙＣ 会发生水解， ａｓｌ ｌ － 反而使产物转化率降低。 为ＤｎｙＣ 法测定氨 图５ ａｓｌ ｌ － 基酸的标准色谱图。 给出了ＤｎｙＣ 法测定结 表１ ａｓｌ ｌ － 果与离子色谱法比较。
干扰分离与检测， 不必除去过量试剂， 色谱图基线也 比较平稳。 为Ｏ Ａ衍生法测定蛋白水解液的色 图１ Ｐ
谱图。
Ｏ Ａ柱前衍生反相ＨＰＣ法比传统柱后衍生 Ｐ Ｌ 有更高的分辨率和灵敏度（ ９ ）多数氨基酸检测极限 为０５ｍ ｌ以信噪比２５１ ， ．ｐ ｏ（ ．：计）只有组氨酸和赖氨
酸较 高， 别 为２５ ３５ｍ ｌ Ｐ 法蛋 白水 解液 分 ． 和 ．ｐ ｏ Ｏ Ａ
与带有伯、 仲氨基团的氨基酸反应， 生成衍生物可被 反相高压液相色谱分离。 衍生物又具有荧光（ 也有紫 外吸收）使Ｆ Ｃ逐步成为 一 ， ＭＯ 个氨基酸分析中新 型柱前衍生剂。 该方法是Ｊｓｆｓ （） ｏｅｓ ｎ１提出的， ｅｏ １ 反应 式如图３ 所示。 Ｆ Ｃ与氨基酸反应迅速， ＭＯ 室温下约３ｓ ０即可 完成。 反应产物稳定， 在４ 避光条件下可储存１天 ３
（ 国家饲科 质量监督检验测 试中心 ， 北京 １０８ ） ００１
Hale Waihona Puke 测， 又可做一般的紫外吸收检测。 紫外检测线性范围
为 １－ ２０ｍ ｌ荧 光 为 ０８ １ｐ ｏ。 Ｐ 本身 不 ０ ０ｐ ｏ ．－ ５ｍ １ Ａ Ｏ
度以及 自动化程度有了很大的进步 ， 白 而且以此为 基础， 建立了食品、 饲料等有关 基酸分析的一系列 国际和国家标准。 然而， 随着氨基酸分析应用领域的 扩展， 氨基酸测定仪用途单 一结构复杂、 、 价格 贵 等缺点日显突出。 七十年代以来， 自 随着高效液相色 谱的发展， 特别是键合反相色谱的应用及柱前衍生
速度（１ Ｆ Ｏ １ ３ Ｍ Ｃ法最大优点是不受样品基质的干 ２） ，
扰（ 如盐分）图２ ＭＯ 。 为Ｆ Ｃ法分析蛋白水解液色谱
图。
Ｆ Ｃ法蛋白水解液的结果变异系数一般为 ＭＯ ２ ％， －３ 只有组氨酸变异系数较大， －９ 生理 为８ ％， 体液变异系数为３ ％， －５ 测定结果均与传统离子色 谱法和理论值相近（ 见表１ ） Ｆ Ｃ柱前衍 生反相 Ｈ Ｌ ＭＯ Ｐ Ｃ法的缺点是， Ｆ Ｃ在衍生过程中易产生试剂的水解反应， ＭＯ 过量 的Ｆ Ｃ与其水解产物均有和Ｆ Ｃ氨基酸类似 ＭＯ ＭＯ －
实现操 作全 部 自动化 ；． ＩＣ 氨基酸 不具 有荧光 ， ２ＰＴ －
的方法 ， 椒 各有其独到之处 。 蛋白水解液 四种方 法 分析
大约都需２分钟， ０ 检测极限：Ｐ Ｆ Ｃ Ｄｎｙ Ｏ Ａ ＭＯ ａｓｌ － Ｃ ＰＴ ， ｌ ＩＣ 衍生物稳定性：ＩＣ Ｆ Ｃ ａｓ－ ＰＴ ＭＯ 綝Ｄｎｙ ｌ Ｃ Ｏ Ａ， ｌ Ｐ 衍生所耗时间：ＭＯ ＰＴ Ｄｎｙ Ｆ Ｃ ＩＣ ａｓｌ －
柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸
梁冬生
自 从Ｍｏｒ等 提出色谱法定量分析氨基酸以 ｏ ｅ 来， 传统的离子交换色谱及柱后茚三酮衍生检测方 法始终占着主导地位。 三十多年来， 人们对该法及仪
器做 了大量 的研 究与改进工作 ， 使分析的灵 敏度 、 速
常碧影
荧光 ， 在紫外 区有较强 吸收 。 可做高 灵敏度荧光检 它
之久 ， 在酸性 条件下也可稳定３ｈ以上 。 ０ 反应有很 高
表１ 蛋白水解 ６ ｏＬ ｌ ） 液（ ｌ Ｈ ２ 理论值与测定值比较（ ｍ ／ Ｃ ４ ｈ 参考文献［６ ２］
的灵敏度， 检测极限为１ｍ ｌ ｐ ｏ（ 信噪比为２５１， ．： 可与 Ｏ Ａ法相媲美。 Ｐ 色谱分离中有很好的分辨率和分离
及胱氨酸衍 生物荧光较弱 ， 度低 ， 灵敏 近年来 有 人 提 出加 Ｂｉ５ ｒ３和碘 乙酸 酯使其 灵敏 度提 高 ３ Ｐ ｊ ． Ａ的 Ｏ
丹酰氯（ 二 即 甲氨基萘磺酰氯 ＤｎｙＣ） ａｓｌ ｉ法进行讨 － 论和研究， 介绍它们的基本原理、 特点， 列出各自的 色谱图和有关数据（ 与离子色谱法比较） 等。