柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸
柱前衍生化-超高效液相色谱法快速测定酱油中的18种氨基酸
酱油 中 １ ８种 氨 基 酸 的加 标 回收 率 为 ９ ．％ ～】３ ７ ０２ ０ ． ％。该 方 法 前 处 理 过 程 简 单 ， 离时 间 短 ， 检 测 酱 油 中 氨 基 酸 分 是
的 有 效 手 段 ， 用 于 酱油 的质 量 评 定 。 可 关 键 词 ： 前 衍 生 ； 高 效 液 相 色 谱 ；一 基 喹 啉 基一 羟 基 琥 珀 酰 亚 氨 基 甲酸 酯 ； 基 酸 ； 油 柱 超 ６氨 Ⅳ一 氨 酱 中图分类号 ：６８ ０ ５ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ —７ ３ ２ ｌ ） ２ ｌ ５ —４ １ ０ ８ ｌ （ ０ ０ １ 一 ｌ ４０ ０
摘 要 ： 立 了一 种 ６ 氨基 喹啉 基 一 羟 基 琥 珀 酰 亚 氨 基 甲酸 酯 （ Ｑ 柱 前 衍 生 ， 高 效 液 相 色 谱 （ Ｌ 对 酱 油 中 建 一 Ⅳ一 Ａ Ｃ） 超 ＵＰ Ｃ） １ 氨 基 酸 进 行 快 速 分 离 检 测 的方 法 。采 用 Ｂ Ｈ Ｃ ８色 谱 柱 分 离 ， ２ ０ ｎ ｔ 长 下 检 测 ， 乙 酸 铵 一 酸一 腈 － ８种 Ｅ １ 在 ６ ｌ 波 Ｔ 以 乙 乙 水 和 乙腈 一 乙酸 为流 动相 ． 流 动 相 梯 度 和 流 速 梯 度 相 结 合 ， ｌ ｎ内实 现 了 ｌ 将 在 ２ ｍｉ ８种 氨 基 酸 衍 生 物 的 分 离 。方 法 的线 性 回归 系数 （ 均 大 于 ０ ９ ９， 出 限 为 ０ ０ ２～ ． ２ ｍｇ Ｌ， ｒ） ．９ 检 ．３ ０ １ ／ 日间 相 对 标 准 偏 差 （ Ｓ 为 ０ ７ ％ ～ ． ５ 在 Ｒ Ｄ） ．２ ４ ０ ％，
２ ０年 １ ０１ ２月
Ｄｅｃ ｍ ｂｅ ０１ ｅ ｒ２ ０
色
谱
柱前衍生_高效液相色谱快速测定皮革和头发水解液中的氨基酸
Abstract Ob jec tive : T o deve lo p a fast H PLC m ethod for deter m ining 17 comm on am ino acids in hydro ly sate o f leather and ha ir . M ethods : Am in o acids w ere separated on D ionex A ccla i m C18 ( 4 . 6 mm
-1
150 mm, 5 m ) co lu mn
w ith in 32 m in using 140 mm o l L sod ium acetate buffer so lution at pH 4 . 45 and 4 . 95 for grad ien t elution w ith acetonitrile- w ater( 60 40 , v /v ) and UV for detection after derivatization w ith A ccQ T ag derivatization reagen. t Re sults : The RSDs( n = 5) of retention t i m e and peak area of all am in o ac id sw ere less than 1 . 1 % and 5 . 0% , respec t iv e ly. T he li m it of detect io n( S /N = 3) w as in th e range o f 2 . 92- 4 . 51 pm o,l the linear range w as in the range o f - 1 - 1 2 2 . 5- 500 m o l L ( 1 . 25- 250 m o l L for cystine) w ith R 0 . 998 . T he spiked recovery of leather and ha ir w ere in the range of 80 . 1 % - 102 . 3 % and 85 . 3% - 103 . 2 % , respect iv ely. Conclusion: T he m ain advantages of the m ethod are si m p lified for the preparatio n o f m ob ile phase , cost sav in g , h ig h speed and less m atrix in terfer ence . It can be used for am ino acids deter m in ation in hydro ly sate of leather and ha ir effective ly . K ey w ord s : a m ino ac id s ; H PLC; pre- co lum n derivatizatio n ; leather ; hair 随着现代皮革工业的发展, 皮革化工材料及制 革理论都不断向现代化迈进 , 由于生皮的主要组成 是蛋白质, 整个制革过程离不开对蛋白质的研究, 氨 基酸是构成蛋白质的基本单元 , 因此分析氨基酸可 对蛋白质与皮化材料的相互作用作深入研究 , 从而 可推动现代皮革工业的快速发展。而毛发是提取各 种天然氨基酸的原料, 因此对皮革与毛发中氨基酸
异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相法同时测定18种氨基酸
文对其实验过程进行了改进， 不用常规的两次蒸发， 仅以正己烷除去干扰因素， 过滤后直接进样分析， 从 而简化了实验步骤， 既节约了时间， 又降低了费用。 将该方法应用于测定含无机离子及小分子肽 （相对 分子质量小于 ） 、 氨基酸、 核苷酸、 低聚糖、 脂类 % " " " 等小分子有机物的小牛血去蛋白注射液中的游离氨 基酸， 结果令人满意。
# 结果
# " ! 对照品混合溶液和实际样品的分离结果 对照品混合溶液和小牛血去蛋白注射液中游离 氨基酸的色谱分离结果见图%和图0 。
图 ! 异硫氰酸苯酯衍生化法测定! %种氨基酸对照品混合溶液的色谱图 & ’ " ! ) * + , . / , + . -, 0 ! %. ’ 1 ,. 2 ’ 3 4 / . 1 3 . + 3 4 3 5 + ’ 6 . / ’ 7 5 38 ’ / *9 * 5 1 ; ’ 4 , / * ’ , 2 . 1 . / 5 ( ( : : ： （ ） ； ： ： ： * D C R B L . 9 D B @ < 7 C * 1! B， 0 & &B BE F ? GB B7 H I H : D C R B L S 8 B 8 9 @ S R 9 8 J 5K； I 8 S 8 : S 7 D LT @ ( 8 C 8 L S = 0 1 FL B； B D U 7 C = @ < 8 8 C R 8 L S’， ) Q ) % 5 ／ ； ， ； ： ， ； ， ； J P@ : 8 S D L 7 S 9 7 C 8 7 L& ? %B D C-< D I 7 R B@ : 8 S @ S 88 C R 8 L S2 5 & P@ : 8 S D L 7 S 9 7 C 8 7 LT @ S 8 9C 7 L 8 @ 9Q 9 @ I 7 8 L S 8 C R S 7 D L& ? &B 7 L& P2 % JB 7 LN P2 0 J ， ； ， ； ， ； ， ； ， ； ， ； ： ／ B 7 L0 J P2 0 MB 7 LJ 1 P2 J 1B 7 LF & P2 F &B 7 L% & & P2 F 1B 7 L% & & P2 F NB 7 L& P2 V C D T9 @ S 8% ? &B -B 7 L H （’ ） ； （W ） ； （ ） ； （W ） ； （Y ） ； （’ ） ； （+ ） ； % H @ < @ 9 S 7 : @ : 7 I < 0 H C R S @ B 7 : @ : 7 I C R J H < 8 9 7 L 8 ! 8 9 F H C : 7 L 8 C 1 H = 7 < S 7 I 7 L 8 7 < G H @ 9 7 L 7 L 8 9 N H S = 9 8 D L 7 L 8 = 9 ) ) Q Q X X Q Q （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； 5 H @ C @ L 7 L 8’ C @ M H 9 D C 7 L 8" 9 D % & H S 9 D < 7 L 8+ 9 % % H ( @ C 7 L 8Z @ C % 0 HB 8 S = 7 D L 7 L 8[ 8 S % J H : < S 8 7 L 8* < % F H 7 < D C 8 R : 7 L 86 C 8 % 1 H ) X X X X （） ； ； （" ） ； （+ ） ； （） 8 R % G H L D 9 C 8 R : 7 L 8 % N H = 8 L C @ C @ L 7 L 8 = 8 % 5 H S 9 S D = @ L 9 % M H C < 7 L 8 < H C 8 R : 7 L 8 ) X X ) ) ) X X
柱前衍生高效液相色谱法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量
摘 要 目的 用 柱前 衍 生 法 测 定 蚕 蛹 提取 物 中氨 基 酸 含 量 ，方 法 以磺 酰 氯 二 甲胺 偶 氮 苯 （ Ａ Ｓ—Ｃ ） 衍 生 剂 ， 用 ＤＢ Ｌ作 采
柱 前 衍 生 高效 液 相 色谱 法 （ Ｐ— Ｐ Ｃ ， ＭＣ—Ｐｃ Ｄ Ｒ Ｈ Ｌ ）Ｙ ａｋＯ Ｓ—Ａ柱 （５ ｍｍ× ． ｍ ５ ２０ ４ ６ ｍ， ｍ） 流 动 相 Ａ为 ２ ｍｏ ＬＫ Ｐ 流 动 相 ， ５ ｌ Ｈ２Ｏ ， ／ Ｂ为 乙腈 ： 醇 ＝ ０ ３ ； 速 １５ｍ／ ｉ 梯 度 洗 脱 ， 测 波 长 ４ ６ ｍ， 温 ３ ℃ ， 果 各种 氨基 酸 均 具 有 良好 的线 性 关 系 （ 关 甲 ７ ：０ 流 ． ｌｍ ｎ 检 ３ｎ 柱 ５ 结 相 系数 ｒ ０ ９８ ０ ９９ ） 精 密 度 （ Ｓ ＝ ．９ ９～ ．９ ９ 、 Ｒ Ｄ＜１５ ％ ）稳 定性 （ Ｓ ３ ５ ％ ）平 均 回收 率 （ ８ ８ ％ ～１７ ８ ％ ） 测 定 蚕 蛹 提 取 物 ．０ 、 Ｒ Ｄ＜ ．０ 、 ９ ．３ ０ ．３ ， 中 氨基 酸 含 量 ， 含 有 人 体 必 需 氨基 酸 占总 氨 基 酸 含量 的 ４ ％ 以上 ， 论 该 方 法 简 便 实 用 ， 析 结 果 准 确 可 靠 ， 用 于 动 植 物 其 ０ 结 分 适 中 富 有氨 基 酸 含 量 的测定 。
邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量
邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量【摘要】目的测定珍珠粉中的氨基酸含量。
方法邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法，采用荧光检测，梯度洗脱。
结果该法在28 min之内分离出15种氨基酸。
结论该法样品用量少、灵敏度高、线性范围宽、重现性好，适于分离大量样品。
【关键词】高效液相色谱；柱前衍生法；氨基酸；珍珠粉Determination of the Contents of Amino Acids in Pearl Powder by RP-HPLC after Pre��column Derivation with O��Phthaldialdehyde (OPA)Abstract：ObjectiveIn this paper， we determined amino acids in pearl powder. Methods A manual pre-column derivation procedure has been developed by reversed-phase HPLC with O-phthalaldehyde and fluorescence detector. Results More than 15 amino acids were separated within 28 min. Conclusion The method is sensitive， precise and shows good repeatability.Key words：High��performance liquid chromatography；Pre��column derivation； Amino acids； Pearl powder随着生命科学和生物工程的发展，氨基酸作为组成生物大分子的基本单元，其分析方法受到重视。
20世纪70年代以后，反相高效液相色谱技术在氨基酸分析中得到广泛应用，使分离时间缩短。
柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量
㊀基金项目:山东省重点研发计划(Ｎｏ.２０１８ＧＳＦ１１８１３２)㊀作者简介:邓红英ꎬ女ꎬ研究方向:药学ꎬＥ－ｍａｉｌ:８４２６７１９７３＠ｑｑ.ｃｏｍ㊀通信作者:李永贵ꎬ男ꎬ高级工程师ꎬ研究方向:新药研发ꎬＴｅｌ:１３５０５４０２３９０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｇ－１２３０＠１６３.ｃｏｍ柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量邓红英１ꎬ张永文２ꎬ李永贵３ꎬ４(１.山东大学齐鲁医院药品调剂科ꎬ山东济南２５００１２ꎻ２.济南市中心医院药剂科ꎬ山东济南２５００１４ꎻ３.山东省药学科学院ꎬ山东省化学药物重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１ꎻ４.山东省药学科学院ꎬ山东省医用高分子材料重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１)摘要:目的㊀建立以２ꎬ４－二硝基氟苯为衍生化试剂ꎬ高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中各氨基酸含量的方法ꎮ方法㊀采用ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８色谱柱ꎬ乙腈－水(６０ʒ４０)为流动相Ａꎬ乙腈－磷酸盐缓冲液(９ʒ９１)流动相Ｂꎬ梯度洗脱ꎬ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ检测波长３６０ｎｍꎬ柱温２７ħꎮ结果㊀复方氨基酸注射液中各氨基酸分离度良好ꎬ线性相关系数均大于０.９９８９ꎬ平均回收率均在９８％~１０２％之间ꎬＲＳＤ％均小于２％ꎮ结论㊀本方法可以用于复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸检测ꎮ关键词:柱前衍生ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯ꎻ复方氨基酸注射液ꎻ１８ＡＡꎻ含量测定中图分类号:Ｒ９２７.２㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０１－００２７－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０１.００６ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣａｆｔｅｒｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎＤＥＮＧＨｏｎｇｙｉｎｇ１ꎬＺＨＡＮＧＹｏｎｇｗｅｎ２ꎬＬＩＹｏｎｇｇｕｉ３ꎬ４(１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｉｓｐｅｎｓｉｎｇꎬＱｉｌｕＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＪｉｎａｎＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｒｕｇꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ)ｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ)ｗｉｔｈ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｒｅａｇｅｎｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＡｎＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎｗａｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｗａｔｅｒ(６０ʒ４０)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ(９ʒ９１)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢ.Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ３６０ｎｍａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ２７ħ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｇｏｏｄ.Ａｌｌｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ０.９９８９.Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ９８％ａｎｄ１０２％ｗｉｔｈＲＳＤｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２％.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ).Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎꎻ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅꎻＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎꎻ１８ＡＡꎻＤｅｔｅｒｍｉ￣ｎａｔｉｏｎ㊀㊀复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)是一种含有合成人体蛋白质所需要的１８种氨基酸与其他辅料配制而成的灭菌水溶液ꎬ临床上主要用于蛋白质摄入不足以及吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要患者的治疗ꎬ也常用于改善手术后患者的营养状况[１]ꎮ由于氨基酸具有高极性㊁低挥发性㊁大部分无强发色基团的特性ꎬ因此其分离和检测都较为困难ꎬ目前常用的检测方法有氨基酸分析仪检测法㊁离子色谱法㊁柱前衍生高效液相色谱(ＨＰＬＣ)法等ꎮ方法存在仪器昂贵㊁运行费用高㊁衍生物不稳定且有一定毒性㊁各组分分离效果差㊁样品检测时间长等诸多问题[２－７]ꎮ本研究建立了２ꎬ４－二硝基氟苯作为衍生化试剂[８－９]ꎬ高效液相色谱法检测复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸的方法ꎬ该方法分离效果好ꎬ且重现性稳定ꎮ１㊀仪器与试药１.１㊀仪器㊀高效液相色谱仪(ＬＣ－２０ＡＴ型泵㊁ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ型检测器ꎬＬａｂｓｏｌｕｔｉｏｎ液相色谱数据工作站ꎬ日本岛津公司)ꎻＢＴ１２５Ｄ分析天平(Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ)ꎻＰＨＳＪ－３Ｆ精密酸度计(上海雷磁仪器厂)ꎻ超纯水机(艾柯)ꎮ１.２㊀试药㊀门冬氨酸(批号:１４０６９１－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ谷氨酸(批号:１４０６９０－２０１２０３ꎬ纯度:１００％)ꎻ丝氨酸(批号:１４０６８８－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ甘氨酸(批号:１４０６８９－２０１６０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ苏氨酸(批号:１４０６８２－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ盐酸精氨酸(批号:１４０７８１－２００８０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ脯氨酸(批号:１４０６７７－２０１５０７ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ丙氨酸(批号:１４０６８０－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ缬氨酸(批号:１４０６８１－２０１２０２ꎬ纯度:９９.６％)ꎻ甲硫氨酸(批号:１４０６８４－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ胱氨酸(批号:１４０６３２－２００５０２ꎬ纯度:９９.３％)ꎻ异亮氨酸(批号:１４０６８３－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ亮氨酸(批号:１４０６８７－２０１５０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ色氨酸(批号:１４０６８６－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ苯丙氨酸(批号:１４０６７６－２００４０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸组氨酸(批号:１４０６９３－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸赖氨酸(批号:１４０６７３－２０１５０９ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ酪氨酸(批号:１４０６０９－２０１５１３ꎬ纯度:９９.８％)对照品均购自中国食品药品检定研究院ꎮ复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)(自制中试品ꎬ批号:２０１６０５０１㊁２０１６０５０２㊁２０１６０５０３)ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯(批号:２０１５１２２７１ꎬ纯度:９９.０％ꎬ成都艾科达化学试剂有限公司)ꎻ乙腈为色谱纯ꎻ碳酸氢钠㊁磷酸二氢钾㊁氢氧化钠㊁磷酸为分析纯ꎮ２㊀方法与结果[１０]２.１㊀溶液制备㊀配样溶剂:ｐＨ７.０磷酸盐缓冲液ꎮ混合对照品储备溶液:精密称取氨基酸对照品各适量ꎬ加水溶解ꎬ制成每１ｍＬ中含有门冬氨酸６２.４５μｇ㊁谷氨酸１８.８３μｇ㊁丝氨酸２５.１１μｇ㊁甘氨酸１９０.０２μｇ㊁苏氨酸６２.５０μｇ㊁盐酸精氨酸１２５.０２μｇ㊁脯氨酸２５.０８μｇ㊁丙氨酸５０.０６μｇ㊁缬氨酸８９.９５μｇ㊁甲硫氨酸５６.２５μｇ㊁胱氨酸２.６５μｇ㊁异亮氨酸８８.０５μｇ㊁亮氨酸１２２.１５μｇ㊁色氨酸２２.５０μｇ㊁苯丙氨酸１３３.２０μｇ㊁盐酸组氨酸６２.５２μｇ㊁盐酸赖氨酸１０７.５８μｇ㊁铬氨酸６.３０μｇ的混合溶液ꎮ混合对照溶液:精密量取混合对照品储备溶液２ｍＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ供试品溶液:精密量取复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴中ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ空白溶液:按处方称取除氨基酸外的各组分ꎬ加水配成空白对照溶液ꎮ精密量取空白对照溶液５０μＬ至１０ｍＬ量瓶中ꎬ照供试品溶液配制方法配制成空白溶液ꎮ２.２㊀色谱条件㊀色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相Ａ为乙腈－水(６０ʒ４０)ꎬ流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２)(９ʒ９１)ꎻ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ柱温２７ħꎬ检测波长:３６０ｎｍꎻ进样体积１０μＬꎮ梯度程序见表１ꎮ表１ 梯度洗脱程序表时间/ｍｉｎ流动相Ａ(％)流动相Ｂ(％)００１００２１５８５１２２４７６１４３１６９３２４１５９４０８０２０２.３㊀专属性试验㊀分别取 ２.１ 项下混合对照品溶液㊁供试品溶液及空白溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎮ记录色谱图及峰面积ꎮ试验结果表明ꎬ在本检测条件下ꎬ空白溶液对氨基酸检测无干扰ꎬ且１８种氨基酸分离良好(见图１)ꎮ２.４㊀定量限与检测限㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ加配样溶剂稀释ꎬ制成不同浓度梯度的溶液ꎬ按上述色谱条件进行测定ꎬ分别取各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎮ计算各氨基酸的定量限与检测限ꎮ２.５㊀线性试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照品储备溶液１㊁１.５㊁２㊁２.５㊁３ｍＬꎬ分别置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入对应比例的５％碳酸氢钠溶液与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液ꎬ摇匀ꎬ分别置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为线性试验溶液ꎬ分别取上述各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图及峰面积ꎬ以浓度Ｃ为横坐标ꎬ峰面积Ａ为纵坐标做线性回归ꎬ求得线性方程及相关系数ꎬ结果见表２ꎮ２.６㊀精密度试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液１０μＬꎬ注入液相色谱仪ꎬ连续进样６次ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ表明仪器精密度良好ꎮ２.７㊀溶液稳定性试验㊀取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ分别于０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２㊁２４ｈ精密量取１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ说明混合对照品溶液２４ｈ内稳定ꎮ２.８㊀回收率试验㊀精密量取空白基质５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ分别加入１８种氨基酸对照品适量(约相当于处方量的８０％㊁１００％㊁１２０％)ꎬ照 ２.１ 项下供试品配制方法配制成回收率试验溶液ꎬ平行配制３份ꎮ依法测定ꎬ计算平均回收率及ＲＳＤꎬ结果见表３ꎮ㊀Ａ.空白溶液ꎻＢ.混合对照品溶液ꎻＣ.供试品溶液㊀１.门冬氨酸ꎻ２.谷氨酸ꎻ３.丝氨酸ꎻ４.甘氨酸ꎻ５.苏氨酸ꎻ６.盐酸精氨酸ꎻ７.脯氨酸ꎻ８.丙氨酸ꎻ９.缬氨酸ꎻ１０.甲硫氨酸ꎻ１１.胱氨酸ꎻ１２.异亮氨酸ꎻ１３.亮氨酸ꎻ１４.色氨酸ꎻ１５.苯丙氨酸ꎻ１６.盐酸组氨酸ꎻ１７.盐酸赖氨酸ꎻ１８.酪氨酸图１㊀ＨＰＬＣ图谱表２㊀各氨基酸组分线性方程㊁相关系数㊁线性范围㊁定量限与检测限名称线性方程相关系数线性范围/μｇ ｍＬ－１定量限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ３)检测限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ１０)门冬氨酸Ａ＝６９７７０Ｃ＋４７４０６０.９９９５６.２４５０~１８.７３５００.１２０.０４谷氨酸Ａ＝５７０５５Ｃ＋１１９２００.９９９２１.８８３０~５.６４９００.０９０.０４丝氨酸Ａ＝８７２１４Ｃ＋１３２０４０.９９９２２.５１１０~７.５３３００.０５０.０２甘氨酸Ａ＝１２４６０２Ｃ＋１７９５６８０.９９９６１９.００２０~５７.００６００.１３０.０３苏氨酸Ａ＝８２４５８Ｃ＋５４４３００.９９９６６.２５００~１８.７５０００.１３０.０４盐酸精氨酸Ａ＝４４７０８Ｃ＋５５２７００.９９９２１２.５０２０~３７.５０６００.２５０.０９脯氨酸Ａ＝６０９７５Ｃ＋１７５３５０.９９９４２.５０８０~７.５２４００.１３０.０５丙氨酸Ａ＝１０４７８０Ｃ＋５６３７７０.９９９４５.００６０~１５.０１８００.１００.０４缬氨酸Ａ＝５８３１４Ｃ＋５６３７７０.９９９４８.９９５０~２６.９８５００.１８０.０６甲硫氨酸Ａ＝６３８０３Ｃ＋３４２８７０.９９９２５.６２５０~１６.８７５００.２８０.１１胱氨酸Ａ＝１ˑ１０６Ｃ＋３４２８７０.９９９２０.２６５０~０.７９５００.１５０.０６异亮氨酸Ａ＝７２２６１Ｃ＋６６２９６０.９９９３８.８０５０~２６.４１５００.１８０.０６亮氨酸Ａ＝７１２５６Ｃ＋８９５９５０.９９９３１２.２１５０~３６.６４５００.２５０.０９色氨酸Ａ＝３４７７８Ｃ＋９０５１.７０.９９９１２.２５００~６.７５０００.３５０.１２苯丙氨酸Ａ＝５７５９９Ｃ＋７１０４６０.９９９５１３.３２００~３９.９６０００.２３０.０８盐酸组氨酸Ａ＝２４５４３４Ｃ＋７１０４６０.９９９５６.２５２０~１８.７５６００.６１０.１２盐酸赖氨酸Ａ＝２３３１８Ｃ＋４９２２３０.９９９７１０.７５８０~３２.２７４００.０８０.０２酪氨酸Ａ＝５４８７８Ｃ＋２３０４０.９９９１０.６３００~１.８９０００.９４０.３１表３㊀回收率试验结果名称平均回收率(％)ＲＳＤ(％)门冬氨酸９９.８００.７８谷氨酸１００.１９０.７９丝氨酸１０１.０９１.９３甘氨酸９９.５６１.３８苏氨酸１０１.２４１.４２盐酸精氨酸１００.１２１.０３脯氨酸９８.７３０.５２丙氨酸９９.９５０.６８缬氨酸９８.８７０.９９甲硫氨酸１００.３４１.３９胱氨酸９９.１６１.８２异亮氨酸９９.５８０.９２亮氨酸１００.２２１.８０色氨酸１００.０８１.４５苯丙氨酸９９.９３１.１７盐酸组氨酸９９.８０１.７０盐酸赖氨酸１００.２３１.２７铬氨酸９９.７７１.４０２.９㊀样品检测㊀取本品３批ꎬ照 ２.１ 项下方法制备混合对照溶液及供试品溶液ꎬ照 ２.２ 项下色谱条件检测各氨基酸含量ꎬ结果见表４ꎮ表４㊀样品测定结果名称含量(％)２０１６０５０１２０１６０５０２２０１６０５０３门冬氨酸９９.６８１００.２７１００.９９谷氨酸９９.１９９９.１５１００.１７丝氨酸１００.４３９９.５０１０１.５５甘氨酸９９.９５１００.０７１０１.３１苏氨酸１００.２９１００.４３１０１.８７盐酸精氨酸１００.５１１００.６０１０１.７８脯氨酸９９.６７１００.４８１０１.０１丙氨酸９９.６８１００.７２１０１.０２缬氨酸９９.７０９９.７０１０１.０３甲硫氨酸１００.２４１００.０８１０１.３０异亮氨酸１００.０６９９.０３９８.２９亮氨酸１０１.２３１０１.２９１０２.５４色氨酸９９.９７１００.８２１０１.２６苯丙氨酸１００.７９１０１.０５１０２.７９盐酸组氨酸９９.９４９９.８６１０１.４７盐酸赖氨酸１０１.４２１０１.１５１０１.１８酪氨酸１０１.１７１００.９５１０２.０５３ 讨论３.１㊀衍生化条件选择㊀本研究分别对衍生化试剂用量㊁衍生化温度及衍生化时间进行研究ꎬ结果使用１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ在６０ħ条件下衍生化１ｈꎬ样品中各氨基酸均能衍生化完全ꎬ样品检测重复性好ꎮ３.２㊀流动相研究㊀本研究流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２) (９ʒ９１)ꎬ９％的乙腈能防止流动相长菌㊁沉淀ꎬ延长流动相使用时间ꎻ磷酸盐浓度对氨基酸的分离效果有改善作用ꎻｐＨ值８.２要求选用耐碱色谱柱进行试验ꎮ３.３㊀柱温研究㊀本研究最佳柱温为２７ħꎬ研究发现柱温波动对色氨酸与组氨酸分离影响较大ꎬ当柱温在(２７ʃ１)ħ时ꎬ各氨基酸能较好地分离ꎮ３.４㊀本检测方法胱氨酸可以与其他氨基酸完全分离ꎬ但是由于其含量低ꎬ检测浓度接近定量限浓度ꎬ因此含量测定时未做计算ꎮ参考文献:[１]㊀李莉ꎬ崔红艳ꎬ钟佳琪ꎬ等.ＨＰＬＣ法同时直接测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中的蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜[Ｊ].分析实验室ꎬ２０１８ꎬ３７(１１):１３０９－１３１４.[２]谢升谷ꎬ胡楚楚ꎬ黄巧巧ꎬ等.ＨＰＬＣ法测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中焦谷氨酸的含量[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２０１５ꎬ３４(４):７０５－７０９.[３]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版(二部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:８１１－８１２. [４]ＬＩＷꎬＨＯＵＭꎬＣＡＯＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ２０ｆｒｅｅａ￣ｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎａｓｐａｒａｇｕｓｔｉｎｂｙｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄａｆｔｅｒＰｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＦｏｏｄＡｎａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１２ꎬ５(１):６２－６８.[５]陈建秋ꎬ王玉红ꎬ李鹏ꎬ等.核壳液相色谱－蒸发光散射检测法直接检测２０种氨基酸[Ｊ].上海医药ꎬ２０１５ꎬ３６(１１):７５－７９.[６]陈丽梅ꎬ尚艳芬ꎬ赵孟彬ꎬ等.柱前衍生化－超高效液相色谱法快速测定酱油中的１８种氨基酸[Ｊ].色谱ꎬ２０１０ꎬ２８(１２):１１５４－１１５７.[７]万丹晶ꎬ陈妙芬ꎬ翟咏虹.用ＨＰＬＣ法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中１８种氨基酸[Ｊ].药学服务与研究ꎬ２００６ꎬ６(３):２１２－２１４.[８]楼永明ꎬ林敏ꎬ陈秀琳.ＨＰＬＣ测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)有关物质的初步研究[Ｊ].中国药品标准ꎬ２０１９ꎬ２０(１):３７－４１.[９]付宜和ꎬ杨国庆ꎬ龚道芬ꎬ等.２ꎬ４－二硝基氟苯柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液ＨＰＬＣ色谱条件的优化[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２００５ꎬ２５(７):７６２－７６４.[１０]李永贵ꎬ张锡霞ꎬ王晶ꎬ等.一次性使用无菌注射器中抗氧剂１０１０的迁移研究[Ｊ]生物医学工程研究ꎬ２０１６ꎬ３５(２):１３３－１３５.。
柱前衍生-高效液相色谱法测定新鲜烟叶中游离氨基酸
D0I：10.13822/ki.hxsj.2021007962化学试剂，2021,43(6),801〜805柱前衍生-高效液相色谱法测定新鲜烟叶中游离氨基酸许永「，黄丽佳一2，刘欣1,李晶「，宋春满"，杨光宇1,李雪梅1(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650106；2.昆明医科大学药学院，云南昆明650504)摘要:建立了柱前衍生-高效液相色谱检测新鲜烟叶中18种游离氨基酸的分析方法。
0.2g样品用5mL超纯水超声提取30min,过滤后取0.5mL滤液以异硫氰酸苯酯(PITC)衍生，以Waters SunFire C18色谱柱为分析柱，80%乙睛和0.1mol/L乙酸钠水溶液为流动相，梯度洗脱，在254nm处检测，外标法定量。
结果表明，18种氨基酸的线性范围为2~ 50wg/mL，定量限为0.03〜0.10mg/g,3个水平加标平均回收率在84.6%-105%之间，相对标准偏差为1.7%~5.5%-该方法简便快速，适用于新鲜烟叶中18种游离氨基酸的含量分析-关键词:柱前衍生;高效液相色谱;烟叶;游离氨基酸中图分类号：0652文献标识码：A文章编号：0258-3283(2021)06-0801-05Determination of Free Amino Acids in Fresh Tobacco Leaves by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization XU Yong1,HUANG Li-jia'，,LIU Xin,LI Jing',SONG Chun-man*1,YANG Guang-yu',LI Xue-mei (1.Technology Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Kunming650106,China；2.School of Pharmacy,Kunming Medical University,Kunming650504,China),Huaxue Shiji,2021,43(6),801〜805Abstract:A method was developed for the determination of18free amino acids in fresh tobacco leaves by pre-column derivatiza-tion-high performance liquid chromatography.0.2g Sample was extracted by ultrasonication with5mL ultrapure water for30min, filtrated and then0.5mL of the filtrate was derived with phenyl isothiocyanate(PITC)and analyzed on a Waters SunFire C18 column with80%acetonitrile and0.1moL/L aqueous sodium acetate solution as mobile phase.Derivatives were detected at the wavelength of254nm and quantified with external standard method.The results showed that the linear ranges of18free amino acids were2~50wg7mL,and the limits of quantitation were0.03〜0.10mg/g,and the average recoveries of18free amino acids were in the range of84.6%-105%with relative standard deviations of1.7%〜5.5%.The method is simple and suitable for the analysis of18free amino acids in fresh tobacco leaves.Key words:pre-column derivatization；high performance liquid chromatography；tobacco leaves；free amino acids氨基酸是烟草中一类重要化合物，在烟草生长、调制、醇化、加工直至成品卷烟抽吸过程中,氨基酸与烟草中的还原糖发生非酶棕化反应,生成多种香味前体物质,某些氨基酸如苯丙氨酸还可以自身分解成香味化合物,对形成芳香的烟草香气和吸味有重要贡献［1］-因此，分析烟草中氨基酸含量，对烟草品质评价及卷烟配方设计等均有重要意义-烟草氨基酸的分析方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有离子色谱-脉冲安培检测法［2,3］和液相色谱-串联质谱法［4-6］。
高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量
河 北 医 科 大 学 学 报JO U RN A L OF HEBEI M ED ICA L U NI VER SI T YV o 1.17 No .3 1996高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量许彦芳 许新民 王永利药理教研室(050017) 摘 要 本文利用高效液相色谱(HP L C )柱前邻苯二甲酝酿(OP A )自动衍生、自动进样程序测定脑组织中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r -氨基丁酸含量。
该法的最低检出限为10nmol /ml ,5种氨基酸峰面积测定值的变异系数平均为2.0±1.3%,线性相关系数平均为0.97±0.03。
关键词 HPL C;氨基酸;OP A ;自动衍生;自动进样HPLC -PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OFAMINO ACIDS BY AUTOMATIC PRECOLUMN DERIVATIZATIONXu Yan fang Xu Xinmin Wang YongliDep artment of Ph armacologyABSTRACT Glutamate,asparate,glycine,taurine and GABA in brain w ere seperated and determined by HPLC system of the autom atic processes of precolum n o -phthaldialdehydeder iv atization and injection .Average co efficient o f variatio n for peak areas of 5amino acids w as 2.0±1.3%w ith the detectio n lim it o f 50ng.Av erag e line co orelatio n coefficient w as 0.97±0.03.KEY WORDS HPLC ;o -phthaldialdehyde ;amino acids ;automatic derivatizatio n ;au-tom atic injection 生物样品中的微量氨基酸测定在医学领域中占重要地位。
柱前衍生化高效液相色谱法测定百合中的氨基酸含量
Ａｂｓｒ ｅ： ＲＰＨＰ Ｃ ｔｏ ｏ ｈ ｅｅｍｉａｉｎｏ ｍｉｏａ ｉ ｎＬⅢｕ ｗａ ｓａ ｌ ｈ ｄ ＯＤＳ ｐ ｒｉ Ｃ１ ｏｕ （ ｔａ ｔ Ａ Ｌ ｍｅｈ ｄｆｒｔｅｄ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆａ ｎ ｃｄ ｉ ｍ ｓｅ ｔｂｉ ｅ Ａ ｓ ２ Ｈｙ ｅｓ１ ８ｃ ｌｍｎ４６ｍｍｘ ５ ２ ０ｍｍ．５ｐ ｗａ ｍ） ｓ
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２ ～ ６ ６ ｍｉ．ｆ ｍ ５％－ ０％ ： ６ ６ ３ ｎ ｆｏ ８ ３ ６ ２ ． ｎ ｆ ｏ ６ ８ ２ ～ ２ ｍｉ ． ｒ ｍ ０％～ ５％ Ｔ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔｌ ｉｄ ｆａ ｎ ｃ ｄ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｉ ｌ ｍ ｓ ｅ ｉｌ ｒ Ａｍｉ ｏ ９ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｋ ｎ ｓｏ ｍｉ ｏ ａ ｉ ｓ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉｅ ｎ Ｌｉｕ ｅ ｐ ｃａｌ Ｐ ｏ ｓ ３ ｉ ｙ ｎ
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AQC柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中游离氨基酸
AQC柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中游离氨基酸王亚超;曹玲;王玉【摘要】Purpose A pre-column derivatization method by HPLC was established for the determination of free amino acids in Weilening Tablets. Methods The sample was mixed with 2-amino butyric acid as the internal standard, then derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) and analyzed on a Kromasil C18 column(250 mm × 4.6 mm ,5 μm) ,with ammonium acetate solution( pH 5.10) and acetonitrile solution as mobile phase,using gradient elution with detection at 248 nm. Results The correlation coefficients between the ratios of peak area of amino acid to those of the internal standard and the amino acid concentrations were above 0.999. The average recoveries of amino acids added were 91.5％ -107.0％ and RSD was 0.63％ -3.79％. Conclusion The method could be used for determination of content of free amino acids in Weilening Tablets.%目的:建立柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中各种游离氨基酸的方法.方法:以α-氨基丁酸为内标,以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)为柱前衍生化试荆,采用Kromasil C(18)(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,醋酸铵缓冲液(pH5.10)和57%乙腈水溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为248nm,同时分离测定胃乐宁片中21种游离氨基酸.结果:21种氨基酸在0.01-0.5 mmoL/L浓度范围内有良好的线性关系.r均不小于0.999,平均加样回收率为91.5%-107.O%,RSD为0.63%-3.79%.结论:建立的方法可用于检测胃乐宁片中游离氨基酸含量,测定的结果为胃乐宁片质量研究和评价提供了依据.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】4页(P300-303)【关键词】胃乐宁片;6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯;柱前衍生;氨基酸;含量测定【作者】王亚超;曹玲;王玉【作者单位】中国药科大学,江苏南京,210009;江苏省食品药品检验所,江苏南京,210008;中国药科大学,江苏南京,210009;江苏省食品药品检验所,江苏南京,210008【正文语种】中文【中图分类】R927.1猴头菌[Hericium erinaceus(Rull ex F.)Pers.]又名猴头菇、剌菌或猬菌，是最早加工成中成药的药用菌之一，因用子实体作原料成本较高，生产中多用固体培养的菌丝体代替子实体作原料。
柱前衍生化-超高效液相色谱法快速测定酱油中的18种氨基酸
柱前衍生化-超高效液相色谱法快速测定酱油中的18种氨基酸陈丽梅;尚艳芬;赵孟彬;刘虎威【摘要】建立了一种6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)柱前衍生,超高效液相色谱(UPLC)对酱油中18种氨基酸进行快速分离检测的方法.采用BEH C18色谱柱分离,在260 nm波长下检测,以乙酸铵-乙酸-乙腈-水和乙腈-乙酸为流动相,将流动相梯度和流速梯度相结合,在12 min内实现了18种氨基酸衍生物的分离.方法的线性回归系数(r2)均大于0.999,检出限为0.032～0.12 mg/L,日间相对标准偏差(RSD)为0.72% ～4.05% ,在酱油中18种氨基酸的加标回收率为90.2% ～103.7% .该方法前处理过程简单,分离时间短,是检测酱油中氨基酸的有效手段,可用于酱油的质量评定.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2010(028)012【总页数】4页(P1154-1157)【关键词】柱前衍生;超高效液相色谱;6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯;氨基酸;酱油【作者】陈丽梅;尚艳芬;赵孟彬;刘虎威【作者单位】北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京锦绣大地农业股份有限公司,北京,100049;北京锦绣大地农业股份有限公司,北京,100049;北京锦绣大地农业股份有限公司,北京,100049;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871【正文语种】中文【中图分类】O658酱油是烹饪和食品加工中的重要调味料,是以大豆、小麦为原料,经过天然晾晒或发酵制成。
在酱油酿造过程中,原料中的蛋白质经蛋白酶作用逐渐分解成氨基酸等人体需要的主要营养物质。
氨基酸含量是评价酱油品质的重要指标,同时氨基酸种类及含量也影响着酱油的风味[1]。
目前酱油品质的分级主要是根据其中氨基酸态氮的含量进行。
用于氨基酸检测的色谱方法主要有液相色谱法(LC)[2-4]、气相色谱法 (GC)、毛细管电泳法 (CE)、离子交换色谱法 (IEC)[5,6]及液相色谱-质谱 /质谱法 (LC-MS/MS)[7,8]。
柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸
第22卷第1期2003年1月 无锡轻工大学学报Journal of Wuxi U niversity of Light Industry Vol.22 No.1Jan. 2003 文章编号:1009-038X (2003)01-0074-03 收稿日期:2002-07-08; 修回日期:2002-09-05.作者简介:吴艳(1977-),女,山东烟台人,食品科学与工程硕士研究生.柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸吴艳1, 艾连中1, 丁先锋2, 彭奇均2, 汤坚1(1.江南大学食品学院,江苏无锡214036; 2.江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036)摘 要:采用柱前衍生反相高效液相色谱法(RP 2HPLC )测定碱性氨基酸含量,衍生化试剂为2,42二硝基氯苯(CDNB ),流动相为0.2mol/L 的醋酸2醋酸盐缓冲液(p H 5.20)和甲醇的混合溶液,其体积配比为75∶25,不需梯度洗脱;采用C 18柱,在波长360nm 条件下进行紫外检测,碱性氨基酸质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数均在0.98以上,分离效果较好.关键词:碱性氨基酸;2,42二硝基氯苯;柱前衍生化;反相高效液相色谱中图分类号:Q 517文献标识码:APrecolumn Derivation RP 2HPLC Method of B asic Amino AcidsWU Yan 1, A I Lian 2zhong 1, DIN G Xian 2feng 2, PEN G Qi 2jun 2, TAN G Jian 1(1.School of Food Science and Technology ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214036,China ;2.School of Chemical and Material Engineering ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214036,China )Abstract :A method for determination of basic amino acids by RP 2HPLC with 2,42dini 2trochlorobenzene precolumn derivation has been developed.Chromatographic conditions were as follows :mobile phase —0.2mol/L acetate buffer (p H 5.20)and methanol in a ratio of 75∶25;separation column C 18;detection wavelength 360nm.G ood linear relation between the concentration of basic amino acids and peak area was obtained ,and correlative coefficient was over 0.98.Basic amino acids were well separated by the method.K ey w ords :basic amino acids ;2,42dinitrochlorobenzene ;precolumn derivatization ;RP 2HPLC 氨基酸分析在食品、生化、医学乃至生命科学领域中有着广泛的应用.传统的分析方法主要是采用氨基酸自动分析仪测定,但该仪器对氨基酸测定的专用性强,且仪器的价格昂贵,不能广泛应用于其它成分的分析.近20年来,随着键合反相色谱的应用及柱前衍生化技术的发展[1],氨基酸的分析多采用高效液相色谱法,它具有分辨率高、灵敏度高,操作简单且可一机多用的优点.常用的衍生化试剂[2]包括邻苯二甲醛(OPA )、丹酰氯(Dansy —Cl )、2,42二硝基氟苯(FDNB )、异硫氰酸苯酯(PITC )等.随着对氨基酸研究的不断深入,碱性氨基酸在医药、食品及饲料等领域的应用也日益普遍.赖氨酸是人体及动物自身不能合成的一种必需氨基酸,可用于治疗营养缺乏、发育不全及氮平衡失调症,同时还可用于食品及饲料强化剂;精氨酸与脱氧胆酸制成的复合制剂(明诺芬)是主治病毒性黄疸的有效药物;组氨酸可用于生产治疗心脏病、贫血、风湿性关节炎和消化道溃疡等的重要药物[3].目前,从提取胱氨酸母液或者猪血粉中制备碱性氨基酸都需要对其进行分析检测,作者采用2,42二硝基氯苯(CDNB )作为柱前衍生化试剂来分析碱性氨基酸,其柱前衍生和色谱分析条件与FDNB 法[4]类似,但与FDNB 法相比,具有衍生试剂价廉易得,理化性质稳定,制备试样方便简单,过量的CDNB 对测定结果无干扰等特点[5].CDNB 在碱性条件下能与氨基酸缩合,生成二硝基苯基氨基酸(DN P 2氨基酸)[6]及副产物DN P 2OH 等.该衍生物由于硝基苯环的引入有强的紫外吸收,并且有很好的稳定性.各种DN P 2碱性氨基酸由于R 基不同,在流动相洗脱过程中其保留时间有所不同,从而达到分离的目的.衍生化反应的方程式如下:1 材料与方法1.1 试剂组氨酸(His )、赖氨酸(Lys )、精氨酸(Arg )均为上海化学试剂公司产品;2,42二硝基氯苯(CDNB )、醋酸、醋酸钠、无水碳酸钠、甲醇、盐酸均为分析纯试剂.1.2 仪器高效液相色谱仪,配有二极管阵列检测器(DAD K 22700型),德国KNAU ER 公司产品;PHS 23型精密数显酸度计,上海天达仪器有限公司产品.1.3 实验方法1.3.1 碱性氨基酸的衍生化1从待测的碱性氨基酸溶液中各精密量取1mL 置10mL 的容量瓶中,加质量分数1%的Na 2CO 3溶液(p H =9)1mL ,再加质量分数1%的2,42二硝基氯苯(CDNB )的甲醇溶液1mL ,密封摇匀,置85℃恒温水浴中暗处反应1h ,取出冷却,分别加入稀盐酸0.5mL ,用水稀释至刻度,摇匀.在一定的色谱条件下(见表1)取20μL 进样测定.1.3.2 线性关系的测定1准确称取适量组氨酸、赖氨酸、精氨酸,配成质量浓度分别为0.005,0.01,0.05,0.10,0.16,0.20,0.25,0.30mg/mL 的溶液,按上述衍生化方法制得DN P 2氨基酸并测定其线性关系.表1 CDNB 衍生化氨基酸的分离条件T ab.1 Separation conditions of CDNB derivatization ofalkaline amino acids色谱条件参 数色谱柱Kromasil C 18,4.6mm ×250mm 流动相A :甲醇;B :0.2mol/L NaAc —HAc缓冲体系(p H 5.20);V (A )∶V (B )=25∶75,经0.45μm 滤膜过滤,超声波水浴脱气30min.柱温40℃检测波长360nm 流量1mL/min2 结果与讨论2.1 回归方程 以DN P 2氨基酸峰面积为纵坐标Y ,碱性氨基酸的质量浓度为横坐标X ,对测得的数据进行直线回归,结果见图1.回归方程、相关系数和线性范围见表2.结果表明,被测氨基酸在此质量浓度范围内,经衍生化后生成的DN P 2氨基酸峰面积与碱性氨基酸质量浓度呈线性关系.图1 碱性氨基酸的回归直线Fig.1 The regression line of b asic amino acids2.2 衍生化试剂CD NB 的加入质量根据上述反应方程式可知,1mol 碱性氨基酸与1mol CDNB 在碱性条件下可生成1mol DN P 2氨基酸,1mg 碱性氨基酸需要衍生剂的理论质量见表3,但为了保证衍生反应完全,衍生试剂应适当过量.多次试验的结果表明,当衍生剂的实际加入质量是理论加入质量的4～6倍时,衍生反应完全且对分离不产生干扰,故作者在实验过程中选用衍生剂的质量为理论质量的5倍.57第6期吴艳等:柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸表2 线性关系测定结果T ab.2 The linear regression equ ation and correlation coeff i2 cient of b asic amino acids碱性氨基酸回归方程相关系数质量浓度的线性范围/(mg/mL)His Y=3387.7X+55.2950.99330～0.21 Lys Y=777.17X+11.8080.98970～0.30 Arg Y=563.11X+39.5860.99120～0.25表3 每毫克碱性氨基酸衍生化所需CDNB理论加入质量T ab.3 The theoretical value of CDNB needed for per mgb asic amino acid碱性氨基酸CDNB理论加入质量/mgHis 1.31Lys 1.39Arg 1.162.3 衍生化反应的条件2.3.1 温度1氨基酸与CDNB分别在碱性条件下于50,60,80,90℃各反应1h,80℃和90℃反应条件下,DN P2氨基酸得率较高.为使衍生化反应完全,反应条件选定为85℃.虽然甲醇的沸点为65℃,在此反应条件下极易挥发,但是甲醇并不参加衍生化反应,而是将CDNB溶解为CDNB的甲醇溶液,当氨基酸与过量的CDNB接触,反应就开始发生,这样有利于反应的快速进行.2.3.2 缓冲体系的p H值 经过多次实验摸索,在缓冲液和甲醇的体积配比不变时,降低缓冲体系的p H值可以明显提高各组分间的分离度,但并不意味着p H值越低分离效果就越好.在p H值为5.30, 5.20,5.10 3个不同条件下对混样进行分析,因组氨酸和DN P2OH较难分离,故主要考察两者的分离度,结果发现在p H值为5.20时分离效果最好(见表4).表4 缓冲液pH值与分离度的关系T ab.4 The relationship betw een pH of buffer solution and resolutionp H值R5.30 1.435.20 1.925.10 1.542.4 衍生化产物本方法于30min内可较好地分离碱性氨基酸,结果见图2. 其中赖氨酸为二氨基氨基酸,可与CDNB衍生反应生成3种物质,色谱图中标有两种赖氨酸衍生物.在样品测定时,可任选一种衍生物峰定量.另外,衍生化产物DN P2氨基酸的最佳p H值为9,为避免因进样量大对色谱柱填料及组分的分离产生影响,应加适量稀盐酸将试液调至p H值为8左右,稀盐酸用量不可太大,否则当p H值小于6时, DN P2氨基酸会产生沉淀.1.DNP2OH;2.DNP2His;3.DNP2Lys第一个峰;4.DNP2Arg;5.DNP2Lys第二个峰图2 碱性氨基酸的标准色谱图Fig.2 The stand ard chromatogram of b asic amino acids 3 结 论采用柱前衍生反相高效液相色谱法分析碱性氨基酸是一种灵敏、快速的方法.该法具有衍生反应完全、分离测定无干扰、结果准确可靠等特点.所采用的衍生化试剂为2,42二硝基氯苯(CDNB),流动相为醋酸2醋酸盐缓冲液(p H5.20)和甲醇的混合溶液,其体积配比75∶25,不需梯度洗脱,在85℃衍生化反应1h,碱性氨基酸能得到很好的分离.参考文献:[1]GIDDIN GS J G.Advances in Chromatography[M].New Y ork:Marcel Dekker Inc,1983.[2]常碧影,梁冬生,阎惠文,等.氨基酸分析技术研究进展[J].分析化学,1993,21(10):1220-1227.(下转第81页)67 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第21卷 由图8可以看出,原淀粉与丙烯酰胺接枝聚合后,其团粒结构仍然存在,丙烯酰胺只是覆盖在淀粉团粒的表面,淀粉团粒内部还没有进行反应.3 结 论1)引发剂用量、单体用量、反应温度和反应时间对玉米淀粉与丙烯酰胺合成产物的接枝率和单体聚合率有很大影响.当淀粉用量为5.0g ,丙烯酰胺为8.0g ,Ce 4+用量为1.0mL ,温度为60℃,反应2h 时,其接枝率达83.40%,单体聚合率为98.13%.2)淀粉是一种弱还原剂,除了作为接枝共聚反应的骨架材料以外,它对单体的聚合本身有一定的促进作用.3)Ce 4+—S 2O 2-8复合体系可以提高单体的聚合率,其原因是实现了Ce 4+—Ce 3+—Ce 4+的多次循环,既保证了Ce 4+引发的高接枝率和高聚合速率,又可减少Ce 4+的用量.4)从扫描电镜观察可以看出,原淀粉与丙烯酰胺的接枝聚合只发生在淀粉颗粒表面,内部没有发生反应,且有氮时的接枝率和单体聚合率都比较大.参考文献:[1]曾宪家.接枝淀粉的应用[J ].广西化工,1991,(1):12-19.[2]谢铁凌,邱学青,杨卓如.淀粉化工的研究现状及进展[J ].广东化工,1997,(2):6-8.[3]鲁德忠,巫拱生,胡应模,等.丙烯酰胺与玉米淀粉接枝共聚的合成及其对含石油废水的处理[J ].吉林大学自然科学学报,1989,(1):81-85.[4]潘松汉,黎国康,王真智,等.淀粉与丙烯酰胺接枝共聚反应动力学的研究[J ].石油化工,1993,(3):177-181.[5]张友松.变性淀粉生产与应用手册[M ].北京:中国轻工业出版社,1999.[6]潘松汉,王贞,黎国康,等.淀粉糊化对淀粉-丙烯酰胺接枝聚合的影响[J ].精细化工,1993,(10):56-59.[7]巫拱生,阎少羽,鲁德忠,等.Ce 4+引发丙烯酸丁酯与玉米淀粉接枝共聚反应规律的研究[J ].吉林大学自然科学学报,1989,(3):97-98.[8]王玉芹,杨巍,崔丹.铈盐-过硫酸盐复合引发淀粉与丙烯酰胺接枝共聚合产物的研究[J ].高分子学报,1996,(1):111-114.[9]张连生,王玉芹,杨巍.Ce 4+—Ce 3+循环体系引发淀粉与丙烯酰胺接枝共聚合反应动力学的研究[J ].高分子学报,1994,(3):354-357.(责任编辑:李春丽,杨萌)(上接第76页)[3]张伟国,钱和.氨基础生产技术及其应用[M ].北京:中国轻工业出版社,1997.[4]陈娅兰,付宜和,王国林,等.十八种氨基酸注射液的HPLC 2,42二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定[J ].药物分析杂志,1990,10(3):149-151.[5]蒋新宇,周春山.氨基酸的柱前衍生高效液相色谱分析述评[J ].湖南化工,1999,29(2):9-11.[6]杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术[M ].北京:北京农业大学出版社,1993.(责任编辑:朱明)18第1期胡青平等:玉米淀粉接枝丙烯酰胺合成。
Fmoc柱前衍生法用于高效反相色谱测定氨基酸
Ｆ ｏ－ｍｎ ａ ｄ ｏ ｒ ｅｅ－ｈｓ Ｈ Ｌ ａｄ ｍ ｃａｉ ｃ ｓ ｅ ｒｄｐａ ＰＣ ｏ ｎ ｓ ｉ ｖ ｅ ｎ
ｔ ｏｔ ａ ｄｒ ａ ｚ ｇ ｏ ｄｒ ｈ ｒ ｕ ｓ ｈ ｐｉ ｌ ｉ ｔｉ ｐ ｃ ｕ ．Ｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｍ ｅ ｖ ｉ ｎ ｒ ｅ ｅ ｅｌ ｈｖ ｐｏｅ ｔ ｔ Ｆ ｏ ｐｏ ｃ ｉ ａ ｇ ａｅ ｖｄ ｔ ｍ ｃ ｔ ｏ ｓ ｈ ｈ ｒ ｈ ｈ ａ ｅ ｒ ｏ ｌ ｉ ｓ ｓ ｉ ， ｓ ｂ ａｄ ａｔａ ｖ ｍ ｔ ｄ ｒ ｅ ｉ ｖ ｔ ｌ ｎ ｑ ｎ ｔｉ ｎ ｔ ｅ ａ ｅ ｕ ｉ ｔｅ ｈ ｆ ｅｏ ｏ ａａ ｓ ｏ ａ ｉ ａ ｄ ｉ ｐｐ ｄ ｈｄｏ ｓ ｅ ｎｌ ｉ ｆ ｎ ｃ ｓ ｅｔｅ ｒｌ ａ ｓ ｙ ｓ ｍ ｏ ｉ ｎ ｉ ｙ ｙ ｔ ． Ｉｉ ｓ ｔ ｌ ｆ ｔ ａａ ｓ ｏ ａ ｉ ａ ｄ， ｔ ｕ ａ ｅ ｈ ｎｌ ｉ ｆ ｎ ｃ ｓ ｓ ｂ ｏ ｅ ｙ ｓ ｍ ｏ ｉ ｉ ｒ ｉ ｌ ｉ ｓ ｅ ｐｒ ｎ ｏｅ ｗ ｉ ｃ ｎｔ ｎ ｕ ｎ ｏ ｉ ｏｔ ｔ ｓ ｃ ａ ｏ ｂ ｃ ｄ ｇ ｍ ａ ｎ ｈ ｈ ｍ ｎ ｅ ｄｔ ｔ ｉ Ｏ Ａ ｏｅｕ ． ｅ ｃ ｄ Ｐ ｐ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｒ ｄｅ
Ａ ａ ｓ ｏ Ｔ ｔｌ ｎ Ａｉｓ Ｐｅｃｌ ｎ ｒａ ｎｌ ｉ ｆ ａ Ａ ｉ ｃ ｂ ｒ ｏ ｍ Ｄ ｉ － ｙ ｓ ｏ ｍ ｏ ｄ ｙ － ｕ ｅｖ
讨
论
在ｐ ７ 的条件下Ｆ ｏ－ １ Ｈ． ７ ｍ ｃＣ 可与氨基酸 迅速反应生成有荧光的Ｆ ｏ－ ｍ ｃ氨基酸，反应
式如下：
ｔａｏ ｗ ｈ ｏ Ｇ ｏ ｎｉ Ｈｕｎ Ｙ ｌｎ ｉ ｔｎ Ｆ ｃ Ｙ ， ｚｉ ｉ ｍ ｔ ｕ ａ ａｇ ｉｉ ｇ ａ ｄ ｏ ｉｎ ｓ ｔｔ ｏ Ｂ ｓ Ｍｅｉ ｌ ｎ Ｙ Ｚ ｉ ａ Ｉ ｔ ｕｅ ａｉ ａ ｈ ｎｉ ｃ ｄｃ ． ａ Ｓｉ ｃ ，ｃ ｄｍ ｏ Ｍｉｉ ｒ Ｍｅｉ ｌ ｉ ｃ ｎｅ Ａａ ｅｙ ｅ ｓ ｌｔ ｙ ｄｃ Ｓ － ａ ａ ｃ ｅｃ ， ｅ ｉｇ ｎｅ Ｂ ｉ ｎ ｓ ｊ Ｆ ｏ （ｕｒ ｙ ｅ ｙ ｘ ｃ ｂｎｌ ｌ ｉ ） ｍ ｃ ｆ ｏ ｎｌ ｔ ｌ ｙａ ｏｙ ｈ ｒ ｅ ｌ ｅ ｍ ｈｏ ｒ ｃｏ ｄ ｉ ａ ａ ｉ ｐｏ ｃｎ ｇ ｕ， ｈｃ ｈｓ ｎ ｓ ｅ ｍｎ ｒｔ ｔ ｇ ｐ ｗ ｉ ａ ｂ ｎｗ ｏ ｅ ｉ ｒ ｏ ｈ ｅ ｅ ａｐ ｅ ｉ ｐｐ ｄ ｓ ｔ ｓ． ｓ ｏ ｒ ｃ ｗｔ ｐｌｄ ｅｔｅ ｈ ｉ Ａ Ｆ ｃ ｔ ｉ ｉ ｎ ｉ ｙ ｅ ｓ ｎ ｍ ｅ ｓ ｈ ａ ｐｉ ａｙ ｉ ， ｓ ｌａ ｓ ｏａｙ ｉ ｉｃｎ ｒ ｒ ａ ｎ ａ ｗ ｌ ｅ ｎｒ ａ ｎ ｔ ｍ ｍ ｅ ｅ ｓ ｃ ｍ ｅ ａ ｂ ｕｅ ａ ａ －ｏ ｍ ｄｒ ａ ｚ ｇ ｇ ｔ ｅ ｄ ｐｅ ｌ ｎ ｉ ｔ ｉ ｒ ｅ ｆｒ ｓ ｓ ｒ ｃ ｕ ｅ ｖ ｉ ｎ ｅ ｎ ｏ ａ ａａ ｓ ｏ ｔｔ ａ ｉ ａ ｄ ｂ Ｈ Ｌ ． ｈｖ ｎｌ ｉ ｆ ａ ｍｎ ｃ ｓ Ｐ Ｃ Ｗｅ ｅ ｙ ｓ ｏ ｌ ｏ ｉ ｙ ａ ｉ ｅ ｉ ｔ ｔ ｃ ｏ ａ ｇ ｒｈ ｃｎｉｏｓ ｎ ｓｇ ｅ ｈ ｈ ｍ ｔ ｒ ｐ ｃ ｄ ｉ ｏ ｖ ｔ ａ ｄ ｅ ｒ ｏａ ｏ ｔｎ ｆ
AQC柱前衍生化高效液相色谱法测定宝乐果中的游离氨基酸
间 ；宝乐 果中测得 １ ４种游离氨基酸 ，其含 ０ ｍ ｇ ／ ｇ ，平均加样 回收率为 ９ ６ ． ９％ 一１ ０ ６ ． ９％ ， Ｒ Ｓ Ｄ为 ０ ． ６ ７％ ～ ３ ． ０ ７％ 。该方法可用于检测宝乐 果中游离 氨基 酸含量 ，测定 的结果 为宝乐果质量研 究和评价提 供 了依据 。
ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ（ ＨＰ Ｌ Ｃ） ．Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ ｗ ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍ ｅ ｄ ｏ ｎ ａ Ｐ ｈ ｅ ｎ ｏ ｍ ｅ ｎ ｅ ｘ Ｃ １ ８（ ２ ５ ０ ｍ ｍ ×４ ． ６ ｍ ｍ， ５ Ｉ ｘ ｍ）ｃ ｏ ｌ —
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｆ ｒ ｅ ｅ ａ ｍｉ ｎ ｏ ａ ｃ ｉ ｄ ｓ ｉ ｎ Ｂ ｏ ｒ ｏ ｊ ｏ ．Ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｗ ａ ｓ ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｚ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ６ 一 ａ ｍｉ —
ｕ ｍｎ ｗ ｉ ｔ ｈ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｅ ｎ ｔ ｅ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｉ ｏ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｗ ａ ｔ ｅ ｒ（ Ａ） ，ａ ｃ ｅ ｔ ｏ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｌ ｅ（ Ｂ）ａ ｎ ｄ １ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ ａ ｍｍｏ ｎ ｉ ｕ ｍ ａ ｃ ｅ ｔ ａ ｔ ｅ
关键 词 ：宝乐果；Ａ Ｑ Ｃ ；游离氨基酸；柱前衍生法
中图分类 号 ：０ ６ ５ ７ ． ７
柱前衍生—高效液相色谱法测定酱油中游离氨基酸
：
Ｓｃｉ ｃｅ ｅｎ ａｎｄ Ｔ ｅｃｈ ｎｏｌ ｏｇｙ ｎ Ｉ ｎｏｖ ｉ Ｈｅｒ ｄ ａｔ ｏｎ ａｌ
学 术 论 坛
柱前衍生 一高效液 相色谱 法测定酱油 中游 离氨 基酸
罗 继 平
（ 阳市产商 品质量监 督检验所 湖 南衡 阳 衡
４ １０ ） ２ ００
摘 要 ： 立 一 种 潮 定 警 油 Ｉ 种 游 离氨 基 酸 的方 法 。 油 经 离线 衍 生 后 ， 用 常 用ｃ１ 建 ７ 警 采 谱 拄 ， 行 反 相 高 效液 相 色 谱 分析 。 法 捡 出限 ８色 进 方 为０． ｍｏ ／Ｌ， 品加 标 回 收 串 为 ９２ ～１０ ５ Ｉ 样 ％ ２％。 方 法不 需 专 用 氨 基 酸 分 析 色谱 柱 ， 敏 度 高 ， 现 性 好 ． 出限 低 、 收 率 高 谊 灵 重 检 回 关奠词 ： 氨基 酸 柱前衍 生 高效 液相色谱 法 酱油
Ｙ＝ ４．８ ８ ２ ９ ３Ｘ＋Ｏ ０ ９ ．９ ５
０ ９ ９ ．９ ５
０９９ ．９ ０ ０９９ ．９ ８ ０ ９ ９ ．９ ９
０ ９ ９ ．９ ４
１ ２ 准溶液衍生 ．标 衍生试剂 准备 ： ｔｒ ｃ ｇ Ｆｌｏ ＷａｅｓＡｃ Ｑ Ｔａ ｕ ｒ Ｒ ａ ｅ ｔ Ｋｉ 试 剂盒） ｅ ｇ ｎ ｔ （ 包括 ３ 个试剂瓶 ， 分别为 硼酸 盐缓冲溶 液 ， 衍生 试￣ （ ＱＣ 粉末和 无水 Ｊ Ａ ） 乙腈 。 临用前 ， ． ｍＬ无水乙 腈 于衍生试 吸１ ０ 剂瓶 中（ 事前将瓶 振荡 ， 使粉 末完全置于瓶底 ） ， 拧 紧瓶盖 ， １ 秒 ， 入５ ℃烘箱 加热 至粉 末 摇 ０ 放 ５ 完全 溶 解 （ 得 超过 １ ｍｉ ） 不 ｎ。 ０ 衍生 ： ５ Ｌ 将２ ０ 内衬玻璃管 放入２ 液相 ｍＬ 样品瓶 中 。 移液 枪吸取 １ Ｌ 用 ０ 氨基酸标 样工 ｕ 作液 放入 内衬管 底部 ， 加 入７ Ｌ 再 ０ 硼酸 缓冲 盐， 放在 涡旋振 荡器上 涡旋 １ ｎ 再精 确加入 ｍｉ ， ２ Ｌ Ｏ“ 衍生 试 剂 ， 速盖 紧瓶盖 涡旋 ｌ ｎ 迅 ｍｉ ～ ２ ｎ ， ５ ｍｉ 后 于５ ℃烘箱 放置５ ｉ 后 ， 出冷 至室 ｍｎ 取 温 ， 样测定 。 进 １ ３ 品前处理 ．样 根据 酱油 中 氨基酸 态氮 含量 不 同吸取 一 定量酱 油置于５ ｍＬ ０ 容量瓶 中（ 其中氮含量 保证 为０．１ ０ ６“ｇ～０ ８ ｇ ， ５ ． ）用 ％三氯乙酸定容 ， 摇 表１ 梯度 洗脱程 序
柱前衍生高效液相色谱法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量
柱前衍生高效液相色谱法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量梁卫青，魏克民，浦锦宝，祝永强，郑军献，胡轶娟（浙江省中医药研究院，杭州310007）摘要：目的用柱前衍生法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量，方法以磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-CL）作衍生剂，采用柱前衍生高效液相色谱法（RP-HPLC），YMC-Pack ODS-A柱(250×4.6mm，5µm)，流动相A为25mol/L KH2PO4，流动相B为乙腈：甲醇=70：30；流速1.5 ml/min梯度洗脱，检测波长436nm，柱温35℃，结果：各种氨基酸均具有良好的线性关系（相关系数r=0.9989～0.9999）、精密度（RSD＜1.50%）、稳定性（RSD＜3.50%）、平均回收率（98.83%～107.83%），测定蚕蛹提取物中氨基酸含量，其含有人体必需氨基酸占总氨基酸含量的40%以上，结论：该方法简便实用，分析结果准确可靠，适用于动植物中富有氨基酸含量的测定。
关键词：柱前衍生；蚕蛹提取物；氨基酸；高效液相色谱Determination of Amino Acids in silkworm extract by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization. Liang Weiqing, Wei Kemin, Pu Jinbao, Zhu Yongqiang, Zheng Junxian, Hu Yijuan, Zhejiang Academy Of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou, 310007, ChinaAbstract: Objective Determination of Amino Acids in silkworm extract by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization. Methods The technology of precolumn derivatization, along with high performance liquid DABS-CL, A high-efficiency YMC-Pack ODS-A column(250×4.6mm, 5 μm), The mobile phase was A: 25mol/L KH2PO4 and B: acetonitrile : methyl alcohol =70:30, at flow rate of 1.5 ml/min, peaks were detected at 436 nm, column temperature 35℃. Results All kinds of amino acids have a nice linear relations (r=0.9989~0.9999), precision (RSD<1.50%), stability (RSD<3.50%), the average recovery rate of amino acids (98.83%~107.83%), it contains more than 40% essential amino acid. Conclusio n The method is simple, precise and reliable. It can be used to determine Amino Acids in animal and plant.Key words: precolumn derivatization; silkworm extract; amino acid; RP-HPLC蚕蛹蛋白系全价蛋白，是理想的天然优质氮源，蚕蛹水解提取物中含有人体生长发育，新陈代谢所需要的十八种氨基酸，包括不能在体内合成的8种必需氨基酸，蚕蛹提取物的应用十分广泛，为能更好控制蚕蛹提取物中复合氨基酸[1-2]的质量，以确保作为高附加值药品、保健食品、化妆品的原料资源，需对其中各个氨基酸的含量作出准确可靠的分析。
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［］ ．ｅ ｇＧ Ｊ ｕｈ ，． ａ Ｗｉｉ ｅ，．． ｉ ２ Ｃ Ｄ Ｊ ，． Ｈ ｇｅ ＥＶｎ ｒｇ Ｋ ＪＷｌ ｏ ｎ ． ｓ ｅｎ ｎ －
ｓｎＪＣ ｒｍ ｔｇ．２１３５１８） ｏ ， ｈｏ ａ ｒ，４ ，４（９２． ． ｏ ［］ ． ． ｉ ｉ ｓ ａ ，Ａ ｖｎｅ ｉ Ｃ ｒｍ ｔ ｒｐｙ ， ３ ＪＣ Ｇｄ ｎ ｅ ｌ ｄ ｇ ｔ ． ｄａｃ ｎ ｏ ａｏ ａｈ ｓ ｈ ｇ
氨基酸不稳定， 特别是甘 氨酸、 赖氨酸衍生物的信号 衰减很快， 此法多用于全自动的在线衍生（ｎｌｅ。 ｏ－ｎ） ｉ ４Ｏ Ａ法分析配合饲料氨基酸回收率较低， ．Ｐ 这可能 是配合饲料中的盐分影响了衍生（） ０ ｌ。
一、 邻苯二甲醛 Ｏ Ａ） Ｐ 法
邻苯二甲醛（Ｐ 衍生法， Ｏ Ａ） 早在１７年就由 ９１ Ｒ ｔ 提出， ｏｈ 由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍， 故
Ａ － Ｈ ＋Ｄ ｎｙ Ｃ Ａ Ｎ － ａｓ －ｌ Ｃ Ａ Ｎ ２ ａｓｌ ｌ Ａ Ｈ Ｄ ｎｙ Ｃ＋Ｈ ｌ ｌ
从仪器设备上讲， 均采用两元梯度淋洗， 需要两 台高压液相色谱泵， 紫外或荧光检测器等。 分析柱多 采用反相Ｃ８ Ｆ Ｃ法以反相Ｃ柱居多。 １ ＭＯ 柱， ８ 从仪器 生产厂家看， 惠普公司和吉尔森公司采用 Ｏ Ａ与 Ｐ Ｆ Ｃ结合法（ ， ｔｓ ＭＯ ２ Ｗａ ｒ公司则建议采用 ＰＴ ５ ） ｅ ＩＣ 法， 并推出了专用的氨基酸分析柱Ｐｃ－ａ 及衍生 ｉ Ｔｇ ｏ 工作站，Ｋ Ｌ Ｂ公司则认为 Ｏ Ａ Ｆ Ｃ和 ＰＴ Ｐ ＭＯ ＩＣ三 法均可使用。 在实际应用中，Ｐ Ｏ Ａ和Ｆ Ｃ在生理 ＭＯ 体液中应用较多， 而在食品和饲料工业中ＰＴ ＩＣ法 占主导地位。 据Ｆｒ 统计结果表明， ｓ ｔ 每年采用Ｏ Ａ Ｐ 法大约分析８０个生理体液样品，ＭＯ ＩＣ和 ００ Ｆ ＣＰＴ
最初作 为 一种柱后 衍 生剂 ， 来才作 为柱 前衍 生剂 后
二、 氯甲酸药甲醋（ 药基 ９ － 甲氧基狱酞氯，ＭＯ ） Ｆ Ｃ
氯 甲酸药 甲 酯 ナ 是多 肽合成 的氨基保 护剂 。 它能
使用 Ｊｎｓ ７ ｏｅ等（提出的衍生方法如 下 ） ：
Ｏ Ａ在２巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅 Ｐ － 速反应生成１硫代－ 烷基异叫哚（， － ２ － ８ 加成物可产生 ）
化和样品制备条件下， 最多只能分析１０ ＩＣ样 ５个Ｐ Ｔ
品， 可能是 由于存在痕量的 ＰＴ 这 ＩＣ衍 生剂造成 的。
四、 丹酰氯（ 二甲氨基萘磺酰氯 Ｄ ｎｙ－ｌ ａｓｌ ） Ｃ
ＤｎｙＣ 原是检测一、 ａｓｌ ｌ － 二级氨基酸的著名荧光 剂， 生成氨基酸衍生物可用反相液相色谱分离（， ２２ ２３ ） 衍生是按照Ｔｐｈ（） ａｕｉ４ ２提出的方法进行的：
Ｖｏ． ２ Ｍａｃｌ ｋ ｅ Ｉｃ ， ｗ ｒ ， ． ７ １ ８． ｌ２ ， ｒｅ Ｄｅｋ ｒ ．Ｎｅ Ｙｏｋ Ｐ ３ ， ９３ ｎ
［ Ｇ Ｍ Ｃｕ ， Ｔ Ｆａ ｅ ｅ ｅ，．Ｊ ｉＣ ｒ ４ ． ｃｌ ｇＷ．．ｒ ｋｎ ｒ ｒ ｒ， Ｌ ．ｈｏ ］ ｎ ｎ ｂｇ Ｊ ． ｑ
ｍ ｔ ｒ，１３ ，１ （９８． ａ ｇ．１ （）６３１８） ｏ ［］ ． ｒ ，．ｏａｋ ａ ，． ｈｏ ａｏｒ，９ ，５ ５ Ｐ Ｆ ｓ Ｌ Ｐｌｃ ｅ ｌ ＪＣ ｒｍ ｔ ．４９５７ ｔ ｌ ｔ ． ｇ
邻 苯二甲醛 （ Ｐ ） 、 甲酸 药甲酯 （ 叫９芴基 甲 Ｏ Ａ法 氯 或 － 氧 基羰酰 氯 Ｆ Ｃ 法 、 ＭＯ 异硫氰酸 苯酯 （Ｉ Ｃ 法和 ＰＴ ）
Ｏ Ａ法最大缺点是：． Ｐ １不能与带有仲氨基团的 脯氨酸或羟脯氨酸反应， 歉 因此做全谱分析时需配以 其它技术（ 如与Ｆ Ｃ衍生剂一起使用） ． ＭＯ 赖氨酸
（９ ０ ． １９ ）
［］ Ｒ ｔ ，ｎｌ ｈｍ．４ ，８（９１． ６ Ｍ． ｏ Ａ ａ Ｃ ｅ ，３８０１７） ｈ ．
ＰＴ ＩＣ作为柱前衍生试剂， 它可以和一、 二级氨
基酸反应 ， 在室温下仅十分钟即可完成 ， 反应产物在
基 酸结构 稳定 ， 在室温 下放置数 小时、 冰箱 中放 置数
周后分析， 都可得到良好的结果。 是采用ＰＴ 图４ ＩＣ
衍 生法 分析蛋 白水解液色谱 图。
原来氨基酸结构上引入苯环产生紫外吸收， 使得能 够用紫外检测器（５ｎ 检测一 般说来，ＩＣ氨 ２４ｍ） ＰＴ －
三、 异硫氢酸苯酯（ＩＣ ＰＴ ）
作为Ｅ ｍ ｎ 试剂 ＰＴ ｄ ａ（ ） ＩＣ最初广泛用于多肽及 蛋白质序列分析，９２ ｏｐ１提出用ＰＴ （ｄ １８年Ｋ ｏ［］ ６ ＩＣＥ － ｍ ｎ试剂） ａ 分析氨基酸，ｅ ｒｏ［ 和Ｂｄｎｍｙ Ｈ ｉｉ ｎ ］ ｉｉ ｅ－ ｎｋ ｌｇ ｅ［］ ｒ８ １完善了方法的衍生步骤， 反应如下：
Ｃ Ｏ Ａ。 ｌ Ｐ
不能给出高的灵敏度， 检测极限为５ｐ ｏ， ０ｍ ｌ仅为 Ｏ Ａ法和 Ｆ Ｃ法的１５ ． Ｐ ＭＯ ／０３值得注意的是使用 ＰＴ ＩＣ易于降低柱寿命， ｓ等人提出在有保护柱 Ｆｒ ｔ
情况下， 根色谱柱可令人满意地分析８０ ＭＯ 、 一 ０Ｆ Ｃ
７０ Ａ和５０ ｓｌ ｌ而尽管在严格的真空净 ０Ｏ Ｐ ０ ＤｎｙＣ， ａ －
ＰＴ ＩＣ柱前衍生反相Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ法有很好的分辨率 和较短的分析时间， 但最初的一些报道指出ＰＴ ＩＣ 方法的再现性低于茚三酮法， 如果样品存在非挥发 性盐类和洗涤剂， 都会使结果受到影响（ ， ９尤其对 天门冬氨酸、 谷氨酸、 组氨酸和赖氨酸影响最大。 但
最 近 几年 研 究 已经 证 明 ＰＴ ＩＣ方 法准 确 性 可 以和
技 术的发展， 为氨基酸分析提供了广阔的前景 。 目
前不少方法已趋于成熟， 并且逐步被临床化学、 蛋白 质化学、 生理研究以及食品、 饲料营养分析者所认可 与 采用。 这些方法大多具有衍生操作简洁， 哂 徊产生或 易于排除干扰物、 色谱分离分辨率高， 灵敏度高， 分
析时间短 以及仪器 简单 、 一机 多用等优点 。 也可 但也
变异系数一般为２ ．％ （Ｖ ， －３４ Ｃ ） 生理体液为４ ７ 手动衍生ｏ－ｎ）酪氨酸和组氨酸的大些， ％（ ｆｌｅ ｆｉ 为 ８ ０ 表１ －１％ 给出了Ｏ Ａ等方法测定结果与理论值 Ｐ
的 比较 。
有各自的欠缺与不足。 本文就是根据我们的经验及 有关的文献［ ］对 前应用最广、 ４， ５ 影响最大的几种 柱前衍生反相高效液相色谱测定氨基酸的方法— —
的荧光， 一般需在上机前萃取净化。 最近Ｂｔ ｒ４ ｅ ｅ１ ｎ（ ）
提出采用１ － 氨基金刚烷（Ｄ Ｍ） Ａ Ａ 与过量Ｆ Ｃ试 ＭＯ
剂反应 ， 生成衍 生物 可在全部 氨基 酸衍生物 之后 出 峰 ， 就排除 了试剂 峰的 干扰 。 技术 的应用 ， 这 该 无疑 使该法衍生步骤 简化 ， 且易于实现在线 自 动化 。
ＩＥ法相媲美。 Ｃ 现今ＰＴ ＩＣ衍生法已广泛应用于生
物 、 及 分析 （１ 材料 饲料 食品 中０） ２。 ， ２
ＰＴ ＩＣ法分析蛋白水解液中氨基酸的变异系数 一般为２ －４ ， 生理体液为３ ％ －５ 但组氨酸和胱氨
酸稍大， 分别为６ ％和１％。 给出ＰＴ ０ 表１ ＩＣ法与 值及ＩＥ方法的结果比较。 Ｃ 但是该方法也具有三个劣势：． １氨基酸衍生时 需要真空干燥以除去过量试剂， 使得ＰＴ ＩＣ法很难
Ｄ ｎｙ Ｃ 法 则为５０－６０个 。 ａｓｌ ｌ － ００ ００ 参考文 献 ［］ ． ｏ ，． ．ｐ ｋ ａ， Ｈ Ｓ ｉ Ａ ａＣｅ ． １ ＳＭｏ ｅＤＨ Ｓａ ｍ ｎＷ． ．ｔｎ ｎｌ ｈｍ ， ｒ ｃ ｅ， ．
３ ， １５ ９ ８ ． ０ １８ ５）
ＤｎｙＣ 衍生方法比较简单， ａｓｌ ｌ － 尽管一些报道说 衍生物产率决定于 ＤｎｙＣ 与氨基酸比例， ａｓｌ ｌ － 但经 Ｔｐｈ等改变一些条件后， ａｕｉ 解决了这一问题， 最适 合的比例一般为５１ ０１ ：－１：。 ＤｎｙＣ 与氨基酸反应时间比较重要， ａｓｌ ｌ － 在室温 及避光条件下需３分钟左右。 ５ 反应产物转化率与反 应时间关系很大， 而且温度升高可以加速产物转化， 但最高不可超过６ ， ０ 否则Ｄ ｎｙＣ 会发生水解， ａｓｌ ｌ － 反而使产物转化率降低。 为ＤｎｙＣ 法测定氨 图５ ａｓｌ ｌ － 基酸的标准色谱图。 给出了ＤｎｙＣ 法测定结 表１ ａｓｌ ｌ － 果与离子色谱法比较。
干扰分离与检测， 不必除去过量试剂， 色谱图基线也 比较平稳。 为Ｏ Ａ衍生法测定蛋白水解液的色 图１ Ｐ
谱图。
Ｏ Ａ柱前衍生反相ＨＰＣ法比传统柱后衍生 Ｐ Ｌ 有更高的分辨率和灵敏度（ ９ ）多数氨基酸检测极限 为０５ｍ ｌ以信噪比２５１ ， ．ｐ ｏ（ ．：计）只有组氨酸和赖氨
酸较 高， 别 为２５ ３５ｍ ｌ Ｐ 法蛋 白水 解液 分 ． 和 ．ｐ ｏ Ｏ Ａ
与带有伯、 仲氨基团的氨基酸反应， 生成衍生物可被 反相高压液相色谱分离。 衍生物又具有荧光（ 也有紫 外吸收）使Ｆ Ｃ逐步成为 一 ， ＭＯ 个氨基酸分析中新 型柱前衍生剂。 该方法是Ｊｓｆｓ （） ｏｅｓ ｎ１提出的， ｅｏ １ 反应 式如图３ 所示。 Ｆ Ｃ与氨基酸反应迅速， ＭＯ 室温下约３ｓ ０即可 完成。 反应产物稳定， 在４ 避光条件下可储存１天 ３
（ 国家饲科 质量监督检验测 试中心 ， 北京 １０８ ） ００１
Hale Waihona Puke 测， 又可做一般的紫外吸收检测。 紫外检测线性范围
为 １－ ２０ｍ ｌ荧 光 为 ０８ １ｐ ｏ。 Ｐ 本身 不 ０ ０ｐ ｏ ．－ ５ｍ １ Ａ Ｏ
度以及 自动化程度有了很大的进步 ， 白 而且以此为 基础， 建立了食品、 饲料等有关 基酸分析的一系列 国际和国家标准。 然而， 随着氨基酸分析应用领域的 扩展， 氨基酸测定仪用途单 一结构复杂、 、 价格 贵 等缺点日显突出。 七十年代以来， 自 随着高效液相色 谱的发展， 特别是键合反相色谱的应用及柱前衍生