液相色谱仪测氨基酸

（ 2 ）衍生物制备及其测定：将上述干燥制备的样 品加入 40 微升 pH=10.5 缓冲溶液，接着加入 100 微升丹磺酰氯工作试剂，紧密封住管口，充分 振摇 15 分钟，将样品管在 100℃ 水浴中加热 2 分 钟，取出冷却。吸取 1 毫升以 1 ： 1的比例相混合 的甲、乙两种流动相的混合溶液于样品管中， 充分振摇15秒，吸取10微升左右的此样品溶液注 入液相色谱柱内，记录色谱图。
醋酸； 磷酸； 氨基酸标准混合溶液：用0.01mol/L盐酸溶液制备成 每毫升含20 微克的各种氨基酸的标准混合溶液； 内标溶液：用0.01mol/L盐酸把正亮氨酸制备成每 毫升20微克的内标准溶液； 流动相溶液： 甲：每100毫升乙腈中含有0.1毫升醋酸和0.77毫升的磷 酸； 乙：称取8.1克醋酸钠，用水配制成1升后，加入0.1毫 升醋酸，然后用磷酸调节至pH=3。 所用制备溶液的去离子水均需重新过滤一次。
（二）试剂： 乙腈（重蒸馏）； 丙酮（重蒸馏）； 丹磺酰氯丙酮溶液：称取1.0克丹磺酰酮制备而 成。贮存于冰箱中，工作液当天配制； 缓冲溶液（pH=0.5）: 称取 8.4 克碳酸氢钠溶解于 1000毫升水中，用0.5mol/L氢氧化钠调节溶液pH值 为10.5，过滤后使用； 0.5mol/L氢氧化钠溶液； 0.01mol/L盐酸溶液及6mol/L盐酸溶液； 6mol/L氢氧化钡溶液；
2、校正因子fi的确定 用微量注射器吸取氨基酸标准混合溶液20微升于 小玻璃管中，加入10微升正亮氨酸作为内标溶 液，并在水浴中蒸发干燥，然后按样品处理中的 方法制备标准氨基酸的衍生物，再加入1毫升流动 相混合溶液，用微量注射器吸取5-10微升经衍生 化的氨基酸溶液进入色谱仪，记录色谱图，并确 定各氨基酸的出峰保留时间和峰面积，以及测量 内标物和各氨基酸的峰面积，并求出各氨基酸校 正因子fi。
高效液相色谱法测定氨基酸
一 实验目的
了解氨基酸的高效液相色谱分离分析方法； 学习高效液相色谱仪的使用方法。
二、方法原理 蛋白质样品经酸或碱水解后再行用丹磺酰氯进行衍生 化作用溶解于流动相溶液， 用具有C8反相柱荧光检 测器的反相液相色谱进行测定，能很好地测定出各种 氨基酸的含量。
三、仪器与试剂 （一）仪器： 高效液相色谱仪仪 。
四、分析步骤 1、样品处理与测定 （1）蛋白质的水解：称取1毫克的蛋白质样品或相 当于1毫克蛋白质的样品于玻璃管中，加入1毫升 6mol/L盐酸后用磨口封口或烧结封口，移入 110℃恒温箱中加热16小时，取出冷却。用微量注 射器取20微升水解样液于小玻璃管中，加入10微 升正亮氨酸作为内标溶液，并在水浴中蒸发干 燥。
五、结果处理
1. 2. fi=Ais标/Ai标 W氨基酸（%）=[（fi*Ai）/Ais]*[mis/m]*100
3.式中Ais标—氨基酸混合标准样品中内标物的峰面积； 4.Ai标—氨基酸混合标准样品中每种氨基酸i标准物的峰面 积； 5.fi—为某氨基酸i标样的峰面积相对于内标样品的峰面积 的校正因子； 6.Ais、Ai—分别为内标及氨基酸组分i的峰面积； 7.mis—进入色谱内样液中内标物重量（微克）； 8.m—进入色谱内样液中样品重量（微克）。