茚三酮比色法测定游离氨基氮
茚三酮比色法测定游离氨基氮
茚三酮比色法测定游离氨基氮游离氨基酸的测定——茚三酮比色法标准曲线绘制1. 实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。
因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。
2. 仪器与用具100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×l；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计3. 试剂3.1.1 水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。
3.1.2 氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml （含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。
3.1.3 0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配4. 实验方法取6支20ml试管，按下表加剂：管号试剂1 2 3 4 5 6亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0抗坏血酸(ml) 0.10.10.10.10.10.1氨基氮量（ug/管）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min，取出后立即用冷水摇动冷却，用60%乙醇定容至20 ml，摇匀。
0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186λ=570nm处测定吸光度5. 标准曲线绘制以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图1。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
游离氨基酸总量的测定
植物体内游离氨基酸总量的测定方法一：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。
二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶25ml 或50ml 3 个；漏斗（直径6 厘米）3 个、滤纸适量；20ml刻度试管7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封试管口）；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅（含铁丝筐）。
三、试剂1.3% 茚三酮试剂称3g 茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml 容量瓶里，贮于棕色瓶中。
此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10 天。
2.氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：(1) NaCN±备液0.01mol/L (490mg/L)。
（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中，加66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。
取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。
3. 标准氨基酸精确称取在80°C下烘干的亮氨酸13.1mg （或a -丙氨酸8.9mg）溶于10%勺异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L 的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。
为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5卩mol，或氨基氮7卩g。
4. 95% 乙醇；异丙醇（分析纯）四、操作步骤1.标准曲线的制作取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。
加完试剂后混匀，在100C水浴中加热12min （加热时封口），取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。
于570nm 波长下测其光密度（以空白管为参比），以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。
茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进[发明专利]
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(10)申请公布号 CN 102928362 A (43)申请公布日 2013.02.13C N 102928362 A*CN102928362A*(21)申请号 201210399115.3(22)申请日 2012.10.19201210250876.2 2012.07.18 CNG01N 21/31(2006.01)G01N 21/78(2006.01)G01N 1/28(2006.01)(71)申请人新疆天康畜牧生物技术股份有限公司地址830032 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市头屯河工业园金屯路109号(72)发明人赵毅 郑先强 谢仁军 肖璐恒李延涛 黄炯 唐磊(74)专利代理机构乌鲁木齐新科联专利代理事务所(有限公司) 65107代理人欧咏(54)发明名称茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进(57)摘要本发明提供的茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，使用合成的Rink_Amide_MBHA 树脂作为标准样品，进行连续的重量递增称量，可以得到一组标准样品，经过茚三酮试剂反应，在OD570下读取吸光值，制得一条标准曲线，根据此标准曲线，可以对未知的肽树脂进行游离的氨基定量检测分析。
(66)本国优先权数据(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书6页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 2 页 说明书 6 页1.茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，其特征在于：用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，制作标准曲线，对未知的样品进行残余氨基定量检测，其步骤如下：其1样品处理：称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,计算树脂摩尔数A；用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔；将1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反应2小时，得到树脂肽；再经25%哌啶溶液26ml，处理30分钟，得到去除保护基后的树脂肽，备用；其中25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀得；其中树脂摩尔数的计算公式：式中：A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；m为Rink_Amide_MBHA树脂的克数；SD为Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；其2检测步骤：1）将取去除保护基后的树脂肽15mg，使用无水甲醇溶液20ml对其清洗3次，经真空干燥机处置，其温度45℃，真空度93.3～98.6KPa；干燥结束，称取1.0mg，1.5mg，2.0mg，2.5mg，3.0mg；分别加入300ul Buffer A：和75ul BufferB，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；取25ul的反应后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在OD570下进行吸光值读取，并制作标准曲线；2）称取待测样2.0-3.0mg，加入Buffer A：300ul；Buffer B：75ul，混匀，100℃水浴加热15min，并用冷水冷却，取25ul的反应后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在OD570下测定吸光值；其中Buffer A的配制：5ml吡啶+1.185g苯酚+5ml乙醇混匀；其中Buffer B的配制：500mg茚三酮+10ml乙醇；3）由于使用未合成的Rink Amide_MBHA树脂作为标准品，所以在计算时需要将由于缩合所增加的分子量减去，以保证计算结果的准确性；去除树脂肽增量的影响公式：式中X：去除增加的氨基酸分子量后的原始肽重量；W：树脂肽理论分子量；m：树脂肽实际称量重量；SD：Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；其中4mer树脂肽的理论分子量为：541.73；Rink_Amide_MBHA树脂取代量值为：0.38mmol/g。
游离a-氨基酸含量的测定
• 目的与要求
• 实验的重点和难点
• 仪器和试剂 • 基本操作 • 实验原理 • 实验内容 •数据记录和处理 • 思考题
•注意事项
实验目的与要求
1、了解分光光度法测定游离氨基酸的原理与方法； 2、掌握分光光度计的使用。
重点和难点
分光光度计的使用与标准曲线的制作
仪器和试剂
抗坏血酸（滴）
氨基氮ug/管 吸光度
4
0
4
12.5
4
25.0
4
37.5
4Байду номын сангаас
50.0
4
62.5
摇匀后，将上述6支比色管置于80℃水浴槽加热
15分钟后用冷水冷却，再用缓冲液定容至25mL，摇匀。
3、样品含量的测定
从8号比色管移取1.00mL溶液于9号25mL比色
管，在分别加入3.00mL缓冲溶液、2.00mL茚三酮 溶液和4滴抗坏血酸，摇匀后置于80℃水浴槽加热 15分钟后用冷水冷却，再用缓冲液定容至25mL， 摇匀。以1号比色管溶液为参比液测出样品的吸光
实验内容
1、样品中游离a－氨基酸的提取： 称1.0g剪碎的新鲜蘑菇放入研钵中，加入2mL
蒸馏水，研磨成匀浆，再转入7号25mL比色管，然
后用6mL蒸馏水分三次洗涤研钵，分别转入7号比色 管，再置于80℃水浴槽加热10分钟后用冷水冷却，
再用蒸馏定容至25mL。摇匀后，过滤，将滤液置于
8号比色管以备用。
2、标准曲线制作： 在6支比色管中，按下表顺序与用量加入试剂：
比色管号 V标/mL V缓/mL V茚/mL 1 0 3.00 2.00 2 0.50 2.50 2.00 3 0.10 2.00 2.00 4 1.50 2.00 2.00 5 2.00 2.00 2.00 6 2.50 2.00 2.00
植物生理生化实验
实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法P199原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。
其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。
①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。
②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。
材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。
实验步骤：分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm 波长下测定吸光度。
样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CV T/V S W *100 ；C=A/k (k=0.103) ；V T=100/2 ；V S=1 ；W=1注意事项：1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2.样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3.抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4.水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇；5.稀释后要迅速比色；6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。
最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。
思考题：1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。
2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。
麦汁和啤酒的a-氨基氮检测方法
编写：李贞编号：Q/SBJ4（品）-2.04.2010版本：第1页共3页名称麦汁和啤酒的α-氨基氮检测方法保密日期：2010年7月12日麦汁和啤酒的α-氨基氮检测方法1.目的1.1 用分光光度法比色测定麦汁和啤酒的α-氨基氮。
2.范围2.1 本方法适用于所有种类的麦汁和啤酒。
3. 原理3.1 茚三酮氧化剂与氨基酸反应被还原成水合茚三酮，氨基酸被氧化脱羧，产生醛、二氧化碳和氨，然后氨水合茚三酮和还原型水合茚三酮反应，生成兰紫色络合物，产生的颜色深浅与游离α-氨基氮含量成正比，在波长570nm下有最大吸收值，可用来比色测定。
4. 安全及预防4.1 穿戴PPE，如隔热手套；身体勿靠近沸水，以免溅出；具塞试管的玻璃塞应盖紧，以免飞溅。
4.2操作必须严防任何外界痕迹量的氨基酸引入，因此有关玻璃仪器都必须仔细洗涤，洗涤后只能接触其外部表面，移液管必须用吸球吸。
4.3 测定中加入果糖等作为还原性发色剂，碘酸钾在稀释液中使茚三酮保持氧化态，以阻止进一步发生不希望的生色反应。
5. 试剂5.1 显色剂：10g Na2HPO4·12H2O(磷酸氢二钠)6g KH2PO4（磷酸二氢钾）0.50g 水合茚三酮0.30g 果糖编写：李贞编号：Q/SBJ4（品）-2.04.2010版本：第2页共3页名称麦汁和啤酒的α-氨基氮检测方法保密日期：2010年7月12日将以上试剂用水溶解后稀释至100mL（此溶液在低温棕色瓶子可保存2周，PH应为6.6～6.8）。
5.2 稀释溶液：称2g碘酸钾（KIO3）溶于600mL水中，再加96%乙醇400mL，贮存于冰箱。
5.3 标准溶液：溶0.1072g甘氨酸于100mL水中，在冰箱贮藏。
6. 仪器设备6.1 紫外可见分光光度计UV-2450；6.2 25mL具塞试管；6.3 移液枪：6.4 电炉（1000W-2000W）；6.5 200mL容量瓶；6.6 恒温水浴锅（精度0.5℃）；7. 步骤7.1 取过滤后的麦芽汁2.00mL，置于200mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。
茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量
茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华【摘要】目的:建立乙肝宁复方水提物中总游离氨基酸含量测定的方法.方法:以乙肝宁复方水提物中总游离氨基酸含量和蛋白质含量为指标,对总游离氨基酸含量测定最佳除蛋白的乙醇浓度和药液比进行筛选；采用茚三酮比色分光光度法,于568 nm,测定乙肝宁复方中总游离氨基酸的含量.结果:醇浓度为70％,生药浓度为1g/mL(生药比1∶6)可较好除去蛋白质等大分子物质,减少测定干扰；采用茚三酮比色法,标准曲线方程为:A=0.055 9C-0.225 3(r=0.9991),平均回收率为98.8％,RSD为2.07％(n=9),线性关系良好.该法测得乙肝宁复方药材中总游离氨基酸的含量为1.47％,乙肝宁浸膏中含量为5.65％.结论:该方法简便、快速准确,可用于测定乙肝宁复方中游离氨基酸的含量测定.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】4页(P161-164)【关键词】乙肝宁;总游离氨基酸;含量测定;茚三酮比色法【作者】邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华【作者单位】湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208【正文语种】中文【中图分类】Q503乙肝宁复方为治疗病毒性乙型肝炎的一临床有效验方［1］，该复方由黄芪、白花蛇舌草、绵茵陈、金钱草、党参、蒲公英、制何首乌、牡丹皮、丹参、茯苓、白芍、白术、川楝子十三味药组成［2］，具有补气扶正、健脾化湿、滋肾养肝、利胆清热、活血化瘀等作用［3］。
在本实验早期对乙肝宁复方工艺制备方法优化研究中，发现乙肝宁水提液经絮凝澄清纯化处理后在吸湿性方面较传统醇沉纯化方法处理后有较大改善［4］。
故本课题旨在考察壳聚糖絮凝澄清法对乙肝宁中无效成分游离氨基酸、鞣质、蛋白质等的作用，以探讨其较低吸湿性的原理，说明引起中药制剂吸湿性强的原因。
茚三酮比色法测定牛肉中游离氨基酸的试验研究
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Байду номын сангаас
加 工 工 艺
标准贮备液制备： 准确称取 "%& ’ 甘氨酸， 用蒸馏水溶解并定 容至 & """ ()， 于 " *条件下保存备用； 甘氨酸标准使用液 制备： 分别吸取上述溶液 "%"、 !%"、 $%"、 +%"、 ,%"、 #%" () 于 &"" () 容量瓶中， !、 $、 +、 ,、 # 并用蒸馏水定容至刻度（ 相当于 "、 ； 碘酸钾 ./0$ 稀释液制备： 称取 &%" ’ 碘酸钾溶于蒸 ’ - ()） 馏水中并稀释至 $"" ()，再加入 !"" () 1,2 乙醇溶液， 混 匀备用； 茚三酮显色剂制备： 称取 "%, ’ 茚三酮， 用 1,3 乙醇 溶解并定容至 &"" () （ 此溶液在低温条件下用棕色试剂瓶 可保存两周） 。 45 缓冲溶液： 45+%"、 ,%"、 #%"、 #%6、 6%"、 1%! 。 !% ! 样品来源 牛肉样品均来源于内蒙古科尔沁牛业有限公司。 !% $ 方 法 !%$%& 样品处理 取 &%, ’ 绞碎的牛肉，加入 $" () 蒸馏水， 冷却过滤， 收集滤液备用。 于沸水中煮 &" (78， !%$%! 标准曲线绘制 取 !, () 磨口具塞比色管 # 支，并依 次编号， 分别加入甘氨酸标准溶液 &%" ()， 再向各管分别加 入 45 #%6 缓冲溶液， 茚三酮显色剂各 &%" ()， 再向各管中加 入蒸馏水， 使各管的总体积为 ,%" ()， 摇匀、 盖塞、 在沸水浴 中加热 &, (78 后， 取出， 用冷水冷却 &, (78， 再向各管中加 入 ,%" () ./0$ 稀释液并摇匀，在 $" (78 内于 ,#6 8( 波长 处 测 其 吸 光 度 分 别 为 "%"""， "%!9,， "%+""， "%,+9， "%#9,， "%6"&，同相应浓度做回归，得回归方程为 ! :"%&$! ," ; "%&+&1， # : "%111 ,。样品测定时吸取 &%" () 滤液， 参照标准 系列进行。 !%$%$ 结果计算 根据回归方程，即可计算出被测样品中氨 基酸含量。计算公式为： " 氨基酸（ <&"" (’ - &"" ’） : $<& """ 式中： " 为标准曲线上查得氨基酸微克数； $ 为测定样品的质量（ ’） 。
茶叶中氨基酸总量的快速测定
主要仪器
分光光度计/吸滤装置/水浴锅
测定方法（I）─标准曲线制作
准确称取茶氨酸（或谷氨酸）100毫克溶于100毫 升水中，然后用水稀释成如下浓度：40微克/毫升、 80微克/毫升、160微克/毫升、240微克/毫升、320 微克/毫升。分别移取以上各浓度溶液1.0毫升置于 25毫升容量瓶中，加0.5毫升缓冲液，再加茚三酮 显色剂0.5毫升，在沸水浴中加热15分钟，待冷却 后加水定容至25毫升。放置10～15分钟，于波长 570nm处，用1.0厘米比色杯，测定其吸光度A。以 A值为纵坐标，氨基酸浓度（微克/毫升）为横坐 标作图，得标准曲线并可求得线性回归方程。
测定方法（II）─茶叶中含量的测定
称取3.0000克左右磨碎茶样，加沸水450毫升在 沸水浴中浸提45分钟，每隔10分钟摇瓶一次， 趁热过滤，冷却后定容至500毫升得供试液。 取试液1.0毫升置于25毫升容量瓶中，加0.5毫 升缓冲液，再加茚三酮显色剂0.5毫升，在沸水 浴中加热15分钟，待冷却后加水定容至25毫升。 放置10～15分钟，于波长570nm处，用1.0厘米 比色杯，测定其吸光度。
实验原理
茶叶中氨基酸在缓冲溶液中与茚三酮同时加热， α-氨基氮与茚三酮形成紫色的络合物，紫色的深 浅与氨基酸含量呈正相关。其反应机理如下：
茚三酮鉴定氨基酸概述
茚三酮鉴定氨基酸概述1.茚三酮简介茚三酮(Ninhydrine),又称水合茚三酮,水合茚满三酮,为白色或浅黄色结晶性粉末。
茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。
当与这些游离胺反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。
茚三酮常用来检测指纹，这是由于指纹表面所蜕落的蛋白质和肽中含有的赖氨酸残基，其上的一级胺被茚三酮检测。
在室温条件下，它是一种白色的固体物质，溶于乙醇和丙酮。
茚三酮可以看作是是二氢茚-1，2，3-三酮的水合物。
1901 年,茚三酮被成功研制出来以后主要用于生物医学领域,1954年,瑞典科学家Oden 和Hofsten 将其应用于潜在汗液手印的显现。
茚三酮与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质等发生反应, 生成蓝紫色的手印纹线。
茚三酮也可以用于蛋白质的氨基酸分析。
除去脯氨酸之外的大多数氨基酸，水解之后可与茚三酮反应。
水解中某些氨基酸的侧链也会被降解。
因此对于那些与茚三酮不反应或者发生其他反应的氨基酸需要另作分析。
其余的氨基酸经过色谱分离后可以比色定量。
在分析化学反应的薄层色谱（TLC）中，它可以用于检测所有的胺类，氨基甲酸酯类，在经过充分热处理后可以检测酰胺类物质。
2.实际运用2.1指纹鉴别汗液手印中的汗液成分绝大多数是水(约99%以上),其余是少量的无机物和有机物,有机物中包括了人体所含有的各种氨基酸。
茚三酮与手印汗液中的氨基酸发生显色反应而现出手印。
二氧化碳中的碳原子来源于氨基酸当茚三酮与氨基酸反应时可以释放CO2的羧基碳。
在考古研究中，这个反应用于释放古老骨骼中羧基碳用于稳定同位素分析，以帮助重现古代生物的食物结构。
用一种标记底物处理的土壤，随后利用茚三酮与氨基酸的反应释放羧基胺，可以证明这种底物是否被吸收进微生物蛋白质。
这种方法成功的发现了一些氨氧化细菌（也叫做硝化细菌）利用土壤中的尿素作为碳源。
法医常用茚三酮溶液分析诸如纸张等多孔表面上的潜指纹。
手指所分泌的细微汗液聚集于独特的手指纹路表面，也即含有氨基酸的指纹，经过茚三酮处理可以将氨基酸指尖纹路变为可见的紫色。
茚三酮鉴定氨基酸概述
茚三酮鉴定氨基酸概述1.茚三酮简介茚三酮(Ninhydrine),又称水合茚三酮,水合茚满三酮,为白色或浅黄色结晶性粉末。
茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。
当与这些游离胺反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。
茚三酮常用来检测指纹，这是由于指纹表面所蜕落的蛋白质和肽中含有的赖氨酸残基，其上的一级胺被茚三酮检测。
在室温条件下，它是一种白色的固体物质，溶于乙醇和丙酮。
茚三酮可以看作是是二氢茚-1，2，3-三酮的水合物。
1901 年,茚三酮被成功研制出来以后主要用于生物医学领域,1954年,瑞典科学家Oden 和Hofsten 将其应用于潜在汗液手印的显现。
茚三酮与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质等发生反应, 生成蓝紫色的手印纹线。
茚三酮也可以用于蛋白质的氨基酸分析。
除去脯氨酸之外的大多数氨基酸，水解之后可与茚三酮反应。
水解中某些氨基酸的侧链也会被降解。
因此对于那些与茚三酮不反应或者发生其他反应的氨基酸需要另作分析。
其余的氨基酸经过色谱分离后可以比色定量。
在分析化学反应的薄层色谱（TLC）中，它可以用于检测所有的胺类，氨基甲酸酯类，在经过充分热处理后可以检测酰胺类物质。
2.实际运用2.1指纹鉴别汗液手印中的汗液成分绝大多数是水(约99%以上),其余是少量的无机物和有机物,有机物中包括了人体所含有的各种氨基酸。
茚三酮与手印汗液中的氨基酸发生显色反应而现出手印。
二氧化碳中的碳原子来源于氨基酸当茚三酮与氨基酸反应时可以释放CO2的羧基碳。
在考古研究中，这个反应用于释放古老骨骼中羧基碳用于稳定同位素分析，以帮助重现古代生物的食物结构。
用一种标记底物处理的土壤，随后利用茚三酮与氨基酸的反应释放羧基胺，可以证明这种底物是否被吸收进微生物蛋白质。
这种方法成功的发现了一些氨氧化细菌（也叫做硝化细菌）利用土壤中的尿素作为碳源。
法医常用茚三酮溶液分析诸如纸张等多孔表面上的潜指纹。
手指所分泌的细微汗液聚集于独特的手指纹路表面，也即含有氨基酸的指纹，经过茚三酮处理可以将氨基酸指尖纹路变为可见的紫色。
植物组织中游离氨基酸总量的测定
【试剂】1、 3%茚三酮试剂称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里,贮于棕色瓶中.此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约10天.2、氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：（1）NaCN贮备液0.01mol/L（490mg/L）.（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中,加66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L.取溶液（1）20ml,用溶液（2）定容到1L.3、标准氨基酸精确称取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或α-丙氨酸8.9mg）溶于10%的异丙醇中,并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度,混匀, 即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液,置冰箱中保存.为了制备工作液,可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合,此液浓度为0.5mmol/L,即1ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg.4、 95%乙醇；5、异丙醇（分析纯）.【操作步骤】1. 标准曲线的制作取20ml刻度试管18支,按下表15-1加入各试剂.加完试剂后混匀,在100℃水浴中加热12min（加热时封口）,取出在冷水中迅速冷却,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色.于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比）,以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程.表15-1 各试管加入试剂量2. 样品提取选取有代表性的植物叶片（或其它组织）,洗净擦干,剪碎混匀,迅速称取0.10~0.20g（视氨基酸含量多少而定）,共称3份,分别加入20ml刻度试管中,再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜）,置沸水浴中20min以提取游离氨基酸,到时取出在自来水中冷却,把上清液滤入25ml容量瓶中,之后再往试管中加5ml蒸馏水,置沸水浴上再加热10min,过滤并反复冲洗残渣,最后定容至刻度,摇匀.3. 样品测定另取4支洁净干燥的试管,其中3支分别加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸馏水,然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热12min,冷却后,再分别加5ml 95%乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570nm下测其光密度.根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度.4. 计算游离氨基酸含量式中 C-由直线方程计算的值,即0.5ml试样中氨基酸的微摩尔数（μmol）；V-样品提取液经稀释后的总体积（ml）；W-样品重（g）.测定结果按表15-2记录.表15-2 游离氨基酸总量测定记载表测定日期：。
实验 啤酒中α-氨基酸的测定
实验啤酒中α-氨基酸的测定一、实验目的学习α–氨基氮含量的测定方法，控制麦汁或啤酒质量。
二、实验原理α–氨基氮为α–氨基酸分子上的氨基氮。
水合茚三酮是一种氧化剂，可使氨基酸脱羧氧化，而本身被还原成还原型水合茚三酮。
还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应，生成蓝紫色缩合物，颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比，可在570nm下比色测定。
三、实验器材与试剂分光光度计，电炉等。
(1)显色剂：称取10g Na2HPO4·12H2O ，6g KH2PO4 ，0.5g水合茚三酮，0.3g果糖，用水溶解并定容至100mL（pH 6.6~6.8），棕色瓶低温保存，可用两周。
(2)碘酸钾稀释液：溶0.2g碘酸钾于60mL水中，加40mL 95％乙醇。
(3)标准甘氨酸贮备溶液：准确称取0.1072g甘氨酸，用水溶解并定容至100 mL，0℃保存。
用时100倍稀释。
四、实验步骤(1)样品稀释：适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL（麦汁一般稀释100倍，啤酒50倍，啤酒应先除气）。
(2)测定：取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液，另3支各吸入2mL试样稀释液，剩下3支吸入2mL蒸馏水。
然后各加显色剂1 mL，盖玻塞，摇匀，在沸水浴中加热l 6分钟。
取出，在20℃冷水中冷却20分钟，分别加5mL碘酸钾稀释液，摇匀。
在30分钟内，以水样管为空白，在570nm波长下测各管的光密度。
计算：α–氨基氮含量（μg/mL）=（样品管平均O.D./标准管平均O.D.）×2×稀释倍数说明：式中：(样品管平均O.D./标准管平均O.D.）：表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比；2：标准管的α–氨基氮浓度（μg/mL），即（0.1072×14/75）×100；五、注意事项(1) 必须严防任何外界痕量氨基酸的引入，所用比色管必须仔细洗涤，洗净后的手只能接触管壁外部，移液管不可用嘴吸。
茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量方法存在问题的探讨
茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量方法存在问题的探讨周国兰 何 萍 郑文莉(贵州省茶叶研究所,湄潭 564100) 氨基酸是茶叶中的主要成分,茶叶中氨基酸与茶叶嫩度有密切关系,它对茶汤的滋味、色泽也有较明显的影响,是形成茶叶香气和鲜爽度的重要成分。
茶叶中有20多种游离氨基酸,其中茶氨酸占氨基酸总量的50%以上。
目前,国家标准规定测定茶游离氨基酸总量采用G B/T8314《茶 游离氨酸总量测定》,即茚三酮比色法。
由于该标准存在较多问题,导致各分析室对同一样品的测定结果有很大差异,为此笔者查找相关文献资料,咨询同行专家,对该标准中的疑点进行了反复的试验研究,并对疑点进行了修正,旨在使各分析室测定数据可比性强,达到方法统一、数据一致的目的。
1 G B/T8314标准的引用1.1 游离氨基酸定义 游离氨基酸:茶叶水浸出物中呈游离状态存在的α-氨基的有机酸。
1.2 测定原理 α2氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮共热,形成紫色络合物,用分光光度计在特定的波长下测定其含量。
1.3 仪器和用具 实验室常规仪器及TG-328A分析天平(感量0.0001g)、TU1901紫外分光光度计、PHS-2C型精密酸度计1.4 试剂和溶液 (1)磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)的配制 1/15mol/L磷酸氢二钠溶液:称取23.877g磷酸氢二钠,加水溶解后定容至1L,得a溶液。
1/15mol/L磷酸二氢钾:称取9.073g磷酸二氢钾,加水溶解后定容至1L,得b溶液。
取a溶液95mL和b溶液5mL,混合均匀。
(2)茚三酮溶液:2%,称取茚三酮(纯度不低于99%)2g,加50mL水和80m g氯化亚锡搅拌均匀。
分次加少量水溶解,放在暗处,静置,过滤后加水定容至L。
2 使用国家标准方法时存在的问题2.1 不同实验室采用同一方法测定结果存在很大差异 表1为不同实验室采用G B/T8314方法测定的结果。
表1 不同实验室采用标准方法对茶样的分析结果样品编号游离氨基酸总量测定结果/%实验室1实验室2相对误差3/% 113.87.88029.5 4.810039.0 5.09048.4 4.59059.2 5.370 3注:相对误差以实验室2的测定结果为参比。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
茚三酮比色法测定青天葵中总游离氨基酸的含量
茚三酮比色法测定青天葵中总游离氨基酸的含量
黄松;吴月娜;刘梅;赖小平
【期刊名称】《中国中医药信息杂志》
【年(卷),期】2010(017)012
【摘要】目的利用α-氨基酸与茚三酮反应产生颜色,产生的颜色可以使溶液的吸光度变化的原理,采用可见光分光光度法测定青天葵中总游离氨基酸的含量.方法以亮氨酸为标准品溶液,在568 nm波长下测定供试品溶液的吸光度,根据朗伯-比尔定律计算供试品中总游离氨基酸的含量.结果茚三酮比色法显色反应的最佳反应条件为加入缓冲液的pH值为5.0,用量为1.0 mL;显色剂用量为2.0 mL;反应温度和时间分别为100℃水浴加热19 min,冷却10 min.结论本方法准确、灵敏、重复性好,具有简便实用的特点.
【总页数】3页(P50-52)
【作者】黄松;吴月娜;刘梅;赖小平
【作者单位】广州中医药大学,广东,广州,510006;广州中医药大学,广东,广
州,510006;广州中医药大学,广东,广州,510006;广州中医药大学,广东,广州,510006【正文语种】中文
【中图分类】R284.1
【相关文献】
1.茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量 [J], 邵金良;黎其万;董宝生;刘宏程;束继红
2.青天葵中总游离氨基酸的提取工艺研究 [J], 吴月娜;黄松;刘梅;赖小平
3.茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量方法存在问题的探讨 [J], 周国兰;何萍;郑文莉
4.茚三酮比色法测定蒜氨酸原料药中总氨基酸的含量 [J], 朱瑾;李新霞;陈坚
5.茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量 [J], 邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华
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茚三酮鉴定氨基酸概述
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茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。
当与这些游离胺反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。
茚三酮常用来检测指纹，这是由于指纹表面所蜕落的蛋白质和肽中含有的赖氨酸残基，其上的一级胺被茚三酮检测。
在室温条件下，它是一种白色的固体物质，溶于乙醇和丙酮。
茚三酮可以看作是是二氢茚-1，2，3-三酮的水合物。
1901 年,茚三酮被成功研制出来以后主要用于生物医学领域,1954年,瑞典科学家Oden 和Hofsten 将其应用于潜在汗液手印的显现。
茚三酮与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质等发生反应, 生成蓝紫色的手印纹线。
茚三酮也可以用于蛋白质的氨基酸分析。
除去脯氨酸之外的大多数氨基酸，水解之后可与茚三酮反应。
水解中某些氨基酸的侧链也会被降解。
因此对于那些与茚三酮不反应或者发生其他反应的氨基酸需要另作分析。
其余的氨基酸经过色谱分离后可以比色定量。
在分析化学反应的薄层色谱（TLC）中，它可以用于检测所有的胺类，氨基甲酸酯类，在经过充分热处理后可以检测酰胺类物质。
2.实际运用2.1指纹鉴别汗液手印中的汗液成分绝大多数是水(约99%以上),其余是少量的无机物和有机物,有机物中包括了人体所含有的各种氨基酸。
茚三酮与手印汗液中的氨基酸发生显色反应而现出手印。
二氧化碳中的碳原子来源于氨基酸当茚三酮与氨基酸反应时可以释放CO2的羧基碳。
在考古研究中，这个反应用于释放古老骨骼中羧基碳用于稳定同位素分析，以帮助重现古代生物的食物结构。
用一种标记底物处理的土壤，随后利用茚三酮与氨基酸的反应释放羧基胺，可以证明这种底物是否被吸收进微生物蛋白质。
这种方法成功的发现了一些氨氧化细菌（也叫做硝化细菌）利用土壤中的尿素作为碳源。
法医常用茚三酮溶液分析诸如纸张等多孔表面上的潜指纹。
手指所分泌的细微汗液聚集于独特的手指纹路表面，也即含有氨基酸的指纹，经过茚三酮处理可以将氨基酸指尖纹路变为可见的紫色。
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游离氨基酸的测定——茚三酮比色法标准曲线绘制
1. 实验原理
游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。
因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。
2. 仪器与用具
100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×l；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计
3. 试剂
3.1.1 水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH
4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。
3.1.2 氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml （含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。
3.1.3 0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配
4. 实验方法
取6支20ml试管，按下表加剂：
管号
试剂
1 2 3 4 5 6
亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
抗坏血酸(ml) 0.10.10.10.10.10.1氨基氮量（ug/管）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min，取出后立即用冷水摇
动冷却，用60%乙醇定容至20 ml，摇匀。
0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186
λ=570nm处测定吸
光度
5. 标准曲线绘制
以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图1。
图
1
茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线
-0.05
00.05
0.10.15
0.2氨基氮（ug）
吸光度A
6. 待测样测定
取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml ，坏血酸0.1ml ，混匀，封口。
沸水浴加热1 5分钟，冷水中摇动冷却，用 60%乙醇定溶至20ml ，摇匀，于570mn 测定吸光度A 。
7.计算结果：
测得吸光度，由标准曲线得知样液的氨基氮ug/ ml m ，代入公式十算：
A=0.0382m-0.0103
A 为吸光度，代入公式算得m （ug/ ml ）。