氨基酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)
加入物(ml)
1
2
3
4
5
6ห้องสมุดไป่ตู้
脯氨酸标准(100μg/ml)
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
蒸馏水
0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04
脯氨酸含量(μg)
1
2
3
4
5
6
4、 PRO 加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注 意避免产生气泡。如果样品中的脯氨酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进 行测定，样品的检测最好能设置平行管。
积。 4、 所测样本的浓度过高，应用 PRO Lysis buffer 稀释样品后重新测定。
有效期：6 个月有效。
相关：
编号 DF0135 NR0001 PS0013 TO1013
名称 多聚甲醛溶液(4% PFA) DEPC 处理水(0.1%) RIPA 裂解液(强) 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)
加入物(ml)
空白管 标准管
蒸馏水
0.1
—
系列脯氨酸标准(1-6 号管)
—
0.1
脯氨酸提取液
—
—
PRO Assay buffer
1.5
1.5
茚三酮显色液
1.5
1.5
混匀，沸水浴，溶液呈红色。
测定管 — — 0.1 1.5 1.5
5、PRO 测定：迅速冷却加入 PRO 萃取液，振摇 30s，静置片刻，取上清液转移至新的离 心管或试管，离心，取上清液备用。以空白调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)检测标准 管 520nm 处吸光度；以 PRO 萃取液调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)检测测定管 520nm 处吸光度。
离子交换色谱 氨基酸分离 茚三酮试剂
离子交换色谱氨基酸分离茚三酮试剂离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化化学物质的技术。
它基于样品溶液中离子与色谱填料表面固定载体之间的相互作用，通过控制溶液的pH值和离子浓度来实现分离。
在离子交换色谱中，色谱填料通常为树脂，它拥有具有特定电荷性质的功能团。
氨基酸分离是离子交换色谱的一种应用，它可以用于研究氨基酸的组成、结构和浓度等信息。
氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，了解氨基酸的组成和序列对于研究蛋白质的功能和结构至关重要。
离子交换色谱可以实现氨基酸的高效分离和纯化，为后续的分析和研究提供可靠的数据基础。
离子交换色谱中，茚三酮试剂（Ninhydrin）是一种常用的检测剂，它可以与氨基酸反应产生紫色或蓝色产物。
当氨基酸通过离子交换色谱柱时，通过检测紫色或蓝色产物的形成，可以确定氨基酸的存在和相对浓度。
离子交换色谱的原理是基于离子间的相互排斥和相互吸附作用。
离子交换色谱柱中的色谱填料通常是由合成树脂制成的，其功能团带有正电荷或负电荷。
当样品溶液通过色谱柱时，样品中的离子与色谱填料的功能团之间会发生相互作用。
具有相同电荷的离子会被色谱填料固定，而具有相反电荷的离子会被排斥出来。
在氨基酸分离中，一般采用阴离子交换色谱柱。
阴离子交换树脂具有正电荷的功能团，可以吸附带负电荷的氨基酸。
而对于带正电荷的氨基酸，可以无需柱化，直接通过。
样品溶液中的氨基酸会根据其电荷、大小和极性的差异，在色谱柱中以不同的速度移动。
通过调节溶液的pH值和离子强度，可以改变氨基酸与色谱填料之间的相互作用，从而实现对氨基酸的分离。
茚三酮试剂在离子交换色谱中的应用主要是用于氨基酸的检测。
茚三酮试剂可以与游离的氨基酸反应生成紫色或蓝色产物，这是因为茚三酮试剂与氨基酸中的氨基反应形成酰胺键。
酰胺键是一种特殊的共价键，它具有很强的光吸收能力，因此形成的产物可以被光谱仪检测到。
茚三酮试剂在氨基酸分析中的应用可以通过色谱柱前和色谱柱后的检测方式来实现。
茚三酮法测氨基酸
茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液（2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。
氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）
氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
仪器药品721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥研钵容量瓶移液管烧杯试管架试管0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0（见附表2）80%乙醇10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液*：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml 经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。
将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。
然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。
标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。
上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。
乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。
过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。
KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。
配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。
茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。
5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。
氨基酸的测定实验报告
一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。
2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。
二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。
在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。
纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。
三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。
四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。
（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。
（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。
（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。
（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。
（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。
（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。
五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。
六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。
氨基酸总量的测定
氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。
与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。
羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。
在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。
Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。
该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、滤纸或纱布5、水浴锅6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TO111350TStorage试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。
茚三酮法测定氨基酸含量
四,结果与计算
氨基酸的含量( 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
X为查标准曲线所获得每ml含量g数 为查标准曲线所获得每ml含量g ml含量
自配样品
X*250/称取克数( 为查标准曲线所获得每ml含量g X*250/称取克数(X为查标准曲线所获得每ml含量g 称取克数 ml含量 数) 250为稀释的倍数 250为稀释的倍数
还原型茚三酮按下法制备:称取0.5g茚三酮, 还原型茚三酮按下法制备:称取0.5g茚三酮, 0.5 12.5ml沸蒸馏水溶解 得黄色溶液. 0.5g ml沸蒸馏水溶解, 用12.5ml沸蒸馏水溶解,得黄色溶液.将0.5g 维生素C用25ml温蒸馏水溶解,一边搅拌一边 维生素C 25ml温蒸馏水溶解, ml温蒸馏水溶解 将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中, 将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中,不断出 现沉淀滴定后继续搅拌15min,然后在冰箱内 现沉淀滴定后继续搅拌15min, 搅拌15min 冷却到4℃ 过滤,沉淀用冷水洗涤3 4℃, 冷却到4℃,过滤,沉淀用冷水洗涤3次,真空 干燥, 干燥, (4)60%乙醇(20 ml/组 ) 样品液: ml含0.5~50ug氨基酸(已配) ug氨基酸 (5)样品液:每ml含0.5~50ug氨基酸(已配) (6)分光光度计 (7)水浴锅
三,操作方法
标准曲线的制作: 1,标准曲线的制作:
分别取0 1.0ml0.3mM 分别取0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml0.3mM 溶液于试管中, 补足到1 的标准氨基酸溶液于试管中 用水补足到 ml. 的标准氨基酸溶液于试管中,用水补足到1ml.各加 ml2M醋酸缓冲液 再加入1 茚三酮显色液 醋酸缓冲液; 显色液, 入1ml2M醋酸缓冲液;再加入1ml 茚三酮显色液,充 分混合后盖住试管口,在100 ℃水浴中加热15min, 分混合后盖住试管口, ℃水浴中加热15min, 水浴中加热15min 用自来水冷却.放置5 加入3 60%乙醇稀释, 乙醇稀释 用自来水冷却.放置5min 后,加入3ml 60%乙醇稀释, 充分摇匀,用分光光度计测定OD 充分摇匀,用分光光度计测定OD570(脯氨酸和羟脯氨 酸与茚三酮反应呈黄色,应测定OD ).以 酸与茚三酮反应呈黄色,应测定OD440).以OD570为纵 坐标,氨基酸含量为横坐标, 坐标,氨基酸含量为横坐标,绘制标准曲线
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量一、实验原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
二、实验试剂（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤（1）标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A ；若生成的化合物呈黄色，则在350nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A 。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
氨基酸显色反应茚三酮反应.ppt
氨基酸显色反应---茚三酮反应
茚三酮ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ应
实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质 都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用 的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮 被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分 于和氨缩合生成有色物质。
实验器材及试剂
器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架 试剂： (1)蛋白质溶液：2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9) (2)0.5％甘氨酸溶液 (3)0.1％茚三酮水溶液 (4)0.1％茚三酮—乙醇溶液
实验步骤
(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚 三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 (2)在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％ 的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
氨基酸含量检测试剂盒说明书（货号：BC1575）
氨基酸（AA ）含量检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1575规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体110 mL×1瓶4℃保存试剂二液体12 mL×1瓶4℃保存试剂三液体15mL×1瓶4℃保存试剂四粉剂×2支4℃保存标准品粉剂×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂四：临用前取1支加1 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周；（1支粉剂溶解后可做100T ，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂）2、标准品：10 mg 半胱氨酸。
临用前加入4.13 mL 蒸馏水，得到20 μmol/mL 的半胱氨酸标准溶液备用，用不完的试剂可以4℃保存4周。
产品说明：动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化最能反应肝、肾的生理状态。
另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。
植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。
氨基酸的α-氨基可与水合茚三酮反应在570nm 有特征吸收峰；通过测定570nm 吸光度，来计算氨基酸含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）组织样本：称取约0.1g 组织，加试剂一1mL ，室温下充分研磨，转移到1.5mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取15min ；自来水冷却后，10000rpm ，4℃离心10min ，取上清液，待测。
氨基酸含量的测定茚三酮比色法
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
5. 说明及注意事项
（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可 达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在440nm处。
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL， 置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性 炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线， 摇匀备6 7
氨基酸标准溶液 /mL
0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
水/mL
1.6 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
茚三酮/mL 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 0.4 0.4
茚三酮/mL
0.4 0.4 0.4 0.4
按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行 实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标 准曲线上查出氨基酸含量微克数。
4. 结果计算
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
实验一 氨基酸总量的测定(发园艺.设施等)
实验一植物组织中氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、目的意义和要求：二、原理：三、植物材料：1、发芽水稻种子：用水(对照)、50mmol/L NaCl和500mmol/L NaCl溶液分别浸种２天后，室温（28℃）下萌发２天。
2、每组用２种材料，即１种对照和１种NaCl处理。
四、试剂配制 :1.水合茚三酮试剂: 称取0.6克再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15毫升正丙醇，搅拌使其溶解。
再加入30毫升正丁醇及60毫升乙二醇，最后加入9毫升pH5.4的乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置冰箱中保存备用，10天之内有效。
2. 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH为5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4克，加100毫升无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。
冷却后加30毫升冰乙酸，用无氨蒸馏水稀释至100毫升。
3. 标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8毫克，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至100毫升。
取此液5毫升，用蒸馏水稀释至50毫升，即为每毫升含氮5微克的标准液。
4.0.1%抗坏血酸：称取50毫克抗坏血酸溶于50毫升无氨蒸馏水中，随用随配。
五、操作步骤：1、样品制备：称取水稻萌发种子1克于研钵中，加入2ml10%乙酸、石英砂，充分研成匀浆，再加入3ml10%乙酸，研磨均匀后用蒸馏水洗入100ml容量瓶并用蒸馏水定容至100ml。
混匀后用干燥滤纸过滤到三角瓶中备用。
2、标准曲线的绘制：取8支试管，按下表编号、加试剂。
2、样品测定：取3支20ml刻度试管，按下表编号、加试剂。
加完试剂后，混匀，盖上玻塞，置沸水浴中加热15分钟，然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，用60%的乙醇定容至20毫升，摇匀，用光径为1厘米的比色杯，在波长570nm下测定其消光值，制作标准曲线。
3、样品测定：取2支试管，分别加入2亳升过滤液，加入0.1%抗坏血酸0.1毫升，水合茚三酮3ml,混匀加盖，置沸水浴加热15min，取出后用冷水迅速冷却，用60%乙醇定容至20ml。
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氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)
简介：
氨基酸(Amino acid ，AA)是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。
动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)(Amino Acid Assay kit)检测原理是在弱酸条件下，氨基酸与茚三酮共热情况下，能定量的产生蓝紫色的二酮茚胺(又称Ruhemans 紫)，其吸收峰在波长570nm 处，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与氨基酸浓度成正比。
该试剂盒主要用于检测血清、尿液、植物组织、食品、药品等中的总游离氨基酸含量。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 准备样品：
①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，按植物组织：AA Lysis buffer=的比例加入AA Lysis buffer 匀浆或研磨，用去离子水稀释至，混匀，用滤纸过滤，滤液即为氨基酸粗提液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于氨基酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用AA Lysis buffer 进行适当匀浆，离心5min ，留取上清即为氨基酸粗提液，4℃保存备用，用于氨基酸的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高浓度的氨基酸，可以使用AA Lysis buffer 进行恰当的稀释。
2、 配制茚三酮工作液: 取适量的茚三酮显色液、AAAssaybuffer ，按茚三酮显色液：
AAAssaybuffer=的比例混合，即为茚三酮工作液。
4℃避光密闭保存，2周有效。
3、 配制维生素C 工作液: 取出1支维生素C ，准确溶解于10ml 去离子水，混匀。
4℃预
冷备用。
-20℃保存1周有效。
注意：该试剂盒提供的维生素C 及其配制的工作液为过
编号 名称
TC2153 100T Storage
试剂(A): 氨基酸标准(50μg/ml) 1ml 4℃ 试剂(B): AALysisbuffer 250ml RT 试剂(C): 茚三酮显色液 120ml RT 避光 试剂(D):AAAssaybuffer 10.5ml RT 试剂(E): 维生素C 2支
RT 使用说明书
1份
量。
4、配制系列氨基酸标准溶液：取出氨基酸标准(50μg/ml)恢复至室温后，以氨基酸标准(50
μg/ml)按下表继续稀释：
加入物(ml) 1 2 3 4 5
氨基酸标准(50μg/ml)0.008 0.016 0.024 0.032 0.04
去离子水或无氨蒸馏水0.992 0.984 0.976 0.968 0.960
含氮量(μg) 0.4 0.8 1.2 1.6 2
5、AA加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意
避免产生气泡。
如果样品中的氨基酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
加入物(ml) 空白管标准管测定管
去离子水或无氨蒸馏水0.8——
系列氨基酸标准(1-5号管) —0.8 —
待测样品——0.8
茚三酮工作液 1.2 1.2 1.2
维生素C工作液0.4 0.4 0.4
混匀，80℃中加热15min，迅速冷却。
6、AA测定：当呈现蓝紫色时，补加60%乙醇至，混匀。
立即以空白调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)测定570nm处吸光度。
计算：
以系列氨基酸标准(1-5号管)含氮量为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算其含氮量。
根据如下公式计算具体样品中氨基态氮的含量：
植物组织样品AA(μg/g)=C×V T/(W×V S)
式中：C=从标准曲线上查得的氨基态氮含量(μg)
V T=样品稀释总体积(ml)=80
W=样品鲜重(g)
V S=测定时加入样品体积(ml)=0.8
血清、尿液等样品AA(μg/ml)=C×N/V S
注意事项：
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于4℃。
2、氨基酸与茚三酮产生蓝紫色的二酮茚胺(又称Ruhemans紫)在1-1.5h内能保持稳定，
故稀释后应尽快检测。
3、AAAssaybuffer应密闭保存，防止挥发。
4、空气中的氧气有可能干扰显色步骤，但维生素C不易加多，否则导致吸光度人为偏大。
5、在80℃水浴中孵育加热，可使显色更为稳定。
6、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑酶标仪的最大检测体
积。
7、所测样本的浓度过高，应用AALysisbuffer稀释样品后重新测定。
有效期：6个月有效。
相关：
编号名称
DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)
NR0001 DEPC处理水(0.1%)
PS0013 RIPA裂解液(强)
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)。