氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、实验原理
• 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与 茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化 合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比， 可通过测定570nm处的光密度，测定氨基 酸的含量
二、试剂与材料
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液Βιβλιοθήκη （本实验用赖氨酸）(已配)
（2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M
86ml 醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成。 用pH计较正（250ml/班）
（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和
15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解 （15ml/组）
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，
用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将 0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅
2、氨酸酸样品的测定：
• 取样品液1ml，加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮 显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min，自 来水冷却。放置5min后，加3ml60%乙醇稀释，摇 匀后测定OD570（生成的颜色在60min内稳定）
• 将样品测定的OD570与标准曲线对照，可确定样品 中氨基酸的含量
• 样品同时做三份取平均数
四、结果与计算
• 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
——X为查标准曲线所获得每ml含量g数
• 自配样品
——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得 每ml含量g数） ——250为稀释的倍数
• 五、讨论与分析 • 六、思考题
茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的
定性鉴定？
拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，
不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后
氨基酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：氨基酸(Amino acid ，AA)是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。
动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)(Amino Acid Assay kit)检测原理是在弱酸条件下，氨基酸与茚三酮共热情况下，能定量的产生蓝紫色的二酮茚胺(又称Ruhemans 紫)，其吸收峰在波长570nm 处，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与氨基酸浓度成正比。
该试剂盒主要用于检测血清、尿液、植物组织、食品、药品等中的总游离氨基酸含量。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，按植物组织：AA Lysis buffer=的比例加入AA Lysis buffer 匀浆或研磨，用去离子水稀释至，混匀，用滤纸过滤，滤液即为氨基酸粗提液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于氨基酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用AA Lysis buffer 进行适当匀浆，离心5min ，留取上清即为氨基酸粗提液，4℃保存备用，用于氨基酸的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高浓度的氨基酸，可以使用AA Lysis buffer 进行恰当的稀释。
2、 配制茚三酮工作液: 取适量的茚三酮显色液、AAAssaybuffer ，按茚三酮显色液：AAAssaybuffer=的比例混合，即为茚三酮工作液。
4℃避光密闭保存，2周有效。
3、 配制维生素C 工作液: 取出1支维生素C ，准确溶解于10ml 去离子水，混匀。
4℃预冷备用。
-20℃保存1周有效。
注意：该试剂盒提供的维生素C 及其配制的工作液为过编号 名称TC2153 100T Storage试剂(A): 氨基酸标准(50μg/ml) 1ml 4℃ 试剂(B): AALysisbuffer 250ml RT 试剂(C): 茚三酮显色液 120ml RT 避光 试剂(D):AAAssaybuffer 10.5ml RT 试剂(E): 维生素C 2支RT 使用说明书1份量。
茚三酮法测氨基酸
茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液（2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。
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试剂配制：讲义P32 （1）2%茚三酮溶液 （2）pH8.04的磷酸缓冲液 （3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮
氨酸标准溶液。
（2）标准曲线的绘制及样品测定
单位：mL
1 2 3 4 5 6 7、8、9
水 1.6 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 1.0 （3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮氨酸标准溶液。
实验七：茚三酮法测定氨基酸总量
1．实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨
基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热 时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在 一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可 用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂
氨基酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
氨基酸与加茚三水酮的至反1应0分m两L个刻步骤度： 线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以氨基酸含量
为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
Hale Waihona Puke 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤： 实验材料、仪器与试剂
管，具塞刻度试管。 实验材料、仪器与试剂
仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在
试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。
（3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮氨酸标准溶液。 实验七：茚三酮法测定氨基酸总量 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量
茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量◎侯旭南杨妍林川犇刘徐青霞本文利用茚三酮反应产生特征颜色，改变溶液的吸光度，采用可见光分光光度法对药膳鸡汤及其冻干粉中的氨基酸含量进行分析，建立快速评价冻干药膳鸡汤的新方法。
测定结果表明，茚三酮法测定冻干粉中氨基酸含量具有良好的线性（R2=0.9996），准确性（回收率98.51%～101.61%）。
12种冻干药膳鸡汤中氨基酸含量介于540～2510μg/ml之间；冻干药膳鸡汤中氨基酸含量随其煎煮时长和食盐的增加而提高。
中医药膳学是在中医理论指导下研究食药两用食材的理论及应用的学科，是中医学的一个重要组成部分，是在长期实践中积累逐渐形成的经验学科。
由于食疗药膳的传统烹饪方式商品化程度过低，无法满足快节奏时代的需要，导致其在现代社会的推广受限。
随着真空冷冻干燥技术成本的降低，冻干药膳产品有望实现产业化。
药膳鸡汤作为受众人群最为广泛的食疗药膳，是以药食两用的中药与鸡肉及天然调料熬煮而成。
《内经》记载，药膳鸡汤有益气温中、填精补虚、健脾胃、益五脏、强筋壮骨的功效，适用于营养不良、畏寒肢冷、易疲劳、月经不调等症状。
鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，含有多种人体必须氨基酸。
以鸡肉为基础开发药膳鸡汤，并以现代冻干技术制备方便快捷的药膳鸡汤冻干粉可以实现营养、功能和便捷性的高度融合。
药膳冻干鸡汤的开发有利于药膳的推广和工业化生产，是药膳鸡汤未来研究和发展的趋势。
谷氨酸是酸性氨基酸，分子内含两个羧基增加了其在极性溶剂中的溶解能力，因此微溶于水。
谷氨酸几乎不溶于乙醚等非极性溶剂，也不溶于甲醇和乙醇。
谷氨酸作为食品行业常见的呈鲜物质之一，对鸡汤鲜味具有重要的贡献。
L-谷氨酸可作为药品参与大脑的蛋白质代谢，促进氧化，是人脑中重要的兴奋性神经递质。
本实验以谷氨酸为研究目标，利用谷氨酸与茚三酮反应生成特征颜色的原理，采用可见光分光光度法测定570nm 波长下溶液的吸光度，根据朗伯-比尔定律计算其中的游离氨基酸的含量。
游离氨基酸的测定实验报告
游离氨基酸的测定实验方案（茚三酮比色法）一、实验目的茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸含量，利用氨基酸含量这个参数，控制发酵过程。
二、实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。
因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。
三、实验材料发酵液样品；实验试剂：水合茚三酮；氨基酸标准液；0.1%抗坏血酸实验仪器：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；移液器；枪头；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计四、实验方法1.溶液配制（1）水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。
（2）氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。
（3）0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配。
2.标准曲线绘制取6支20ml 试管，按下表加剂：试剂管号12 3 4 5 6 亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 氨基氮量（ug/管 ）1.02.03.04.05.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min ，取出后立即用冷水摇动冷却，用60%乙醇定容至20 ml ，摇匀。
λ=570nm 处测定吸光度0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图：茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线-0.0500.050.10.150.2氨基氮（ug）吸光度A3.样品中游离氨基酸的测定取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml ，坏血酸0.1ml ，混匀，封口。
氨基酸的测定实验报告
一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。
2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。
二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。
在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。
纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。
三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。
四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。
（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。
（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。
（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。
（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。
（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。
（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。
五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。
六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。
氨基酸总量的测定
氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的组成和营养价值，为食品质量控制和营养评估提供依据。
二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的有机化合物，它们在一定条件下与某些试剂反应可以产生特定的颜色或荧光，通过比色或荧光检测可以定量测定氨基酸的含量。
本实验采用茚三酮显色法测定食品中氨基酸的总量。
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。
在一定波长下测定溶液的吸光度，通过与标准曲线对比，可以计算出样品中氨基酸的总量。
三、实验材料与设备1、实验材料标准氨基酸溶液（已知浓度）待测食品样品（如肉类、豆类、谷物等）茚三酮试剂缓冲溶液（pH 值 50）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计分析天平容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）水浴锅离心机四、实验步骤1、标准曲线的绘制分别吸取 000 mL、020 mL、040 mL、060 mL、080 mL、100 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补足至 100 mL。
向各试管中加入 100 mL 缓冲溶液（pH 值 50）和 100 mL 茚三酮试剂，摇匀。
将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后立即用冷水冷却至室温。
向各试管中加入 500 mL 60%乙醇，摇匀。
使用分光光度计，在 570 nm 波长下，以蒸馏水为空白，测定各溶液的吸光度。
以氨基酸的含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品处理称取适量待测食品样品，精确至 0001 g，放入研钵中研碎。
将研碎的样品转移至离心管中，加入适量蒸馏水，在沸水浴中加热30 min，以提取氨基酸。
冷却后，离心（3000 rpm，10 min），取上清液备用。
3、样品测定吸取 100 mL 样品上清液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照标准曲线绘制的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。
茚三酮法测定氨基酸含量
四,结果与计算
氨基酸的含量( 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
X为查标准曲线所获得每ml含量g数 为查标准曲线所获得每ml含量g ml含量
自配样品
X*250/称取克数( 为查标准曲线所获得每ml含量g X*250/称取克数(X为查标准曲线所获得每ml含量g 称取克数 ml含量 数) 250为稀释的倍数 250为稀释的倍数
还原型茚三酮按下法制备:称取0.5g茚三酮, 还原型茚三酮按下法制备:称取0.5g茚三酮, 0.5 12.5ml沸蒸馏水溶解 得黄色溶液. 0.5g ml沸蒸馏水溶解, 用12.5ml沸蒸馏水溶解,得黄色溶液.将0.5g 维生素C用25ml温蒸馏水溶解,一边搅拌一边 维生素C 25ml温蒸馏水溶解, ml温蒸馏水溶解 将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中, 将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中,不断出 现沉淀滴定后继续搅拌15min,然后在冰箱内 现沉淀滴定后继续搅拌15min, 搅拌15min 冷却到4℃ 过滤,沉淀用冷水洗涤3 4℃, 冷却到4℃,过滤,沉淀用冷水洗涤3次,真空 干燥, 干燥, (4)60%乙醇(20 ml/组 ) 样品液: ml含0.5~50ug氨基酸(已配) ug氨基酸 (5)样品液:每ml含0.5~50ug氨基酸(已配) (6)分光光度计 (7)水浴锅
三,操作方法
标准曲线的制作: 1,标准曲线的制作:
分别取0 1.0ml0.3mM 分别取0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml0.3mM 溶液于试管中, 补足到1 的标准氨基酸溶液于试管中 用水补足到 ml. 的标准氨基酸溶液于试管中,用水补足到1ml.各加 ml2M醋酸缓冲液 再加入1 茚三酮显色液 醋酸缓冲液; 显色液, 入1ml2M醋酸缓冲液;再加入1ml 茚三酮显色液,充 分混合后盖住试管口,在100 ℃水浴中加热15min, 分混合后盖住试管口, ℃水浴中加热15min, 水浴中加热15min 用自来水冷却.放置5 加入3 60%乙醇稀释, 乙醇稀释 用自来水冷却.放置5min 后,加入3ml 60%乙醇稀释, 充分摇匀,用分光光度计测定OD 充分摇匀,用分光光度计测定OD570(脯氨酸和羟脯氨 酸与茚三酮反应呈黄色,应测定OD ).以 酸与茚三酮反应呈黄色,应测定OD440).以OD570为纵 坐标,氨基酸含量为横坐标, 坐标,氨基酸含量为横坐标,绘制标准曲线
氨基测定的实验报告
一、实验目的1. 掌握食品中氨基酸含量的测定方法。
2. 学习氨基酸提取、分离和检测的基本原理及操作技能。
3. 了解氨基酸在食品中的营养价值及对人体健康的重要性。
二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单元，对人体具有重要作用。
食品中氨基酸含量的测定方法有多种，本实验采用茚三酮比色法进行测定。
茚三酮比色法原理：氨基酸与茚三酮在碱性条件下发生反应，生成紫色复合物。
该复合物在特定波长下有最大吸收峰，其吸光度与氨基酸含量成正比。
通过测定吸光度，可以计算出食品中氨基酸的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：食品样品（如鸡蛋、牛奶、豆腐等）、茚三酮试剂、NaOH溶液、标准氨基酸溶液等。
2. 仪器：紫外-可见分光光度计、电子天平、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 样品处理（1）称取适量食品样品，用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的溶液。
（2）将溶液离心，取上清液备用。
2. 标准曲线绘制（1）取6个试管，分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的氨基酸标准溶液，加入1.0mL的NaOH溶液，混匀。
（2）向各试管中加入2.0mL的茚三酮试剂，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
（3）取出试管，冷却至室温，用蒸馏水定容至10.0mL。
（4）以蒸馏水为空白，在570nm波长下测定各试管吸光度。
（5）以氨基酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定（1）取6个试管，分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的样品溶液，加入1.0mL的NaOH溶液，混匀。
（2）按照步骤2的操作，测定各试管吸光度。
（3）根据标准曲线，计算样品中氨基酸含量。
五、结果与分析1. 标准曲线绘制：以氨基酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性范围为0.0～1.0mg/mL。
2. 样品测定：根据标准曲线，计算样品中氨基酸含量，结果如下：（1）鸡蛋：氨基酸含量为2.5mg/g（2）牛奶：氨基酸含量为1.8mg/g（3）豆腐：氨基酸含量为3.0mg/g六、讨论与结论1. 实验结果表明，茚三酮比色法是一种简单、快速、准确的测定食品中氨基酸含量的方法。
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。
二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。
食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。
本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。
通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。
三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。
将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。
2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。
向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。
将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。
用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。
以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。
以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。
五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。
食品中氨基酸含量的测定
实验九食品中氨基酸含量的测定――茚三酮比色法1、目的通过实验，掌握茚三酮比色法测定氨基酸的方法。
2、原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
3、实验材料与仪器3.1材料大豆、奶粉、火腿肠等(1) 0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0(2) 80%乙醇(3) 10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）(4) KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。
将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。
然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。
(5 )标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。
上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。
(6) 乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。
过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。
KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。
配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。
(7) 茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。
5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
02-10-038氨基酸含量的测定-操作步骤(精)
天津现代职业技术学院
3、操作步骤
①．标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。
放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。
（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。
以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
②．氨基酸样品的测定
取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。
放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。
4、将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
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茚三酮比色法测定游离氨基酸含量
原理：
茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡
磷酸缓冲液（pH.8.04）：
称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液
2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作
溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的
氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml
亮氨酸
超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线
取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示
300
400
500
600
700
800
0.0
0.10.20.30.40.5
0.60.7吸光度
波长（nm ）
403 nm
565 nm
选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 50
0.621
55 0.692 60 0.754 65 0.834 70
0.968
使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
O D 565
氨基酸浓度（μg/mL ）
注意事项：
1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整
到中性（pH7左右），
2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中
的蛋白质，
因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，
3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不
清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍
4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，
防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。