茚三酮显色法测定氨基酸含量
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
茚三酮比色测定氨基酸含量
茚三酮比色测定氨基酸含量1）原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
2）试剂①1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
②pH8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL常量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
3）操作方法①标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
氨基酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：氨基酸(Amino acid ，AA)是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。
动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)(Amino Acid Assay kit)检测原理是在弱酸条件下，氨基酸与茚三酮共热情况下，能定量的产生蓝紫色的二酮茚胺(又称Ruhemans 紫)，其吸收峰在波长570nm 处，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与氨基酸浓度成正比。
该试剂盒主要用于检测血清、尿液、植物组织、食品、药品等中的总游离氨基酸含量。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，按植物组织：AA Lysis buffer=的比例加入AA Lysis buffer 匀浆或研磨，用去离子水稀释至，混匀，用滤纸过滤，滤液即为氨基酸粗提液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于氨基酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用AA Lysis buffer 进行适当匀浆，离心5min ，留取上清即为氨基酸粗提液，4℃保存备用，用于氨基酸的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高浓度的氨基酸，可以使用AA Lysis buffer 进行恰当的稀释。
2、 配制茚三酮工作液: 取适量的茚三酮显色液、AAAssaybuffer ，按茚三酮显色液：AAAssaybuffer=的比例混合，即为茚三酮工作液。
4℃避光密闭保存，2周有效。
3、 配制维生素C 工作液: 取出1支维生素C ，准确溶解于10ml 去离子水，混匀。
4℃预冷备用。
-20℃保存1周有效。
注意：该试剂盒提供的维生素C 及其配制的工作液为过编号 名称TC2153 100T Storage试剂(A): 氨基酸标准(50μg/ml) 1ml 4℃ 试剂(B): AALysisbuffer 250ml RT 试剂(C): 茚三酮显色液 120ml RT 避光 试剂(D):AAAssaybuffer 10.5ml RT 试剂(E): 维生素C 2支RT 使用说明书1份量。
茚三酮法测氨基酸
茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液（2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。
茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量
茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量◎侯旭南杨妍林川犇刘徐青霞本文利用茚三酮反应产生特征颜色，改变溶液的吸光度，采用可见光分光光度法对药膳鸡汤及其冻干粉中的氨基酸含量进行分析，建立快速评价冻干药膳鸡汤的新方法。
测定结果表明，茚三酮法测定冻干粉中氨基酸含量具有良好的线性（R2=0.9996），准确性（回收率98.51%～101.61%）。
12种冻干药膳鸡汤中氨基酸含量介于540～2510μg/ml之间；冻干药膳鸡汤中氨基酸含量随其煎煮时长和食盐的增加而提高。
中医药膳学是在中医理论指导下研究食药两用食材的理论及应用的学科，是中医学的一个重要组成部分，是在长期实践中积累逐渐形成的经验学科。
由于食疗药膳的传统烹饪方式商品化程度过低，无法满足快节奏时代的需要，导致其在现代社会的推广受限。
随着真空冷冻干燥技术成本的降低，冻干药膳产品有望实现产业化。
药膳鸡汤作为受众人群最为广泛的食疗药膳，是以药食两用的中药与鸡肉及天然调料熬煮而成。
《内经》记载，药膳鸡汤有益气温中、填精补虚、健脾胃、益五脏、强筋壮骨的功效，适用于营养不良、畏寒肢冷、易疲劳、月经不调等症状。
鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，含有多种人体必须氨基酸。
以鸡肉为基础开发药膳鸡汤，并以现代冻干技术制备方便快捷的药膳鸡汤冻干粉可以实现营养、功能和便捷性的高度融合。
药膳冻干鸡汤的开发有利于药膳的推广和工业化生产，是药膳鸡汤未来研究和发展的趋势。
谷氨酸是酸性氨基酸，分子内含两个羧基增加了其在极性溶剂中的溶解能力，因此微溶于水。
谷氨酸几乎不溶于乙醚等非极性溶剂，也不溶于甲醇和乙醇。
谷氨酸作为食品行业常见的呈鲜物质之一，对鸡汤鲜味具有重要的贡献。
L-谷氨酸可作为药品参与大脑的蛋白质代谢，促进氧化，是人脑中重要的兴奋性神经递质。
本实验以谷氨酸为研究目标，利用谷氨酸与茚三酮反应生成特征颜色的原理，采用可见光分光光度法测定570nm 波长下溶液的吸光度，根据朗伯-比尔定律计算其中的游离氨基酸的含量。
游离氨基酸的测定实验报告
游离氨基酸的测定实验方案（茚三酮比色法）一、实验目的茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸含量，利用氨基酸含量这个参数，控制发酵过程。
二、实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。
因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。
三、实验材料发酵液样品；实验试剂：水合茚三酮；氨基酸标准液；0.1%抗坏血酸实验仪器：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；移液器；枪头；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计四、实验方法1.溶液配制（1）水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。
（2）氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。
（3）0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配。
2.标准曲线绘制取6支20ml 试管，按下表加剂：试剂管号12 3 4 5 6 亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 氨基氮量（ug/管 ）1.02.03.04.05.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min ，取出后立即用冷水摇动冷却，用60%乙醇定容至20 ml ，摇匀。
λ=570nm 处测定吸光度0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图：茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线-0.0500.050.10.150.2氨基氮（ug）吸光度A3.样品中游离氨基酸的测定取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml ，坏血酸0.1ml ，混匀，封口。
氨基酸的测定实验报告
一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。
2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。
二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。
在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。
纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。
三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。
2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。
四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。
（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。
（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。
（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。
（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。
（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。
（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。
五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。
2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。
六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。
2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。
氨基酸总量的测定
氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量
茚三酮比色法测乙肝宁水提物中总游离氨基酸含量邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华【摘要】目的:建立乙肝宁复方水提物中总游离氨基酸含量测定的方法.方法:以乙肝宁复方水提物中总游离氨基酸含量和蛋白质含量为指标,对总游离氨基酸含量测定最佳除蛋白的乙醇浓度和药液比进行筛选；采用茚三酮比色分光光度法,于568 nm,测定乙肝宁复方中总游离氨基酸的含量.结果:醇浓度为70％,生药浓度为1g/mL(生药比1∶6)可较好除去蛋白质等大分子物质,减少测定干扰；采用茚三酮比色法,标准曲线方程为:A=0.055 9C-0.225 3(r=0.9991),平均回收率为98.8％,RSD为2.07％(n=9),线性关系良好.该法测得乙肝宁复方药材中总游离氨基酸的含量为1.47％,乙肝宁浸膏中含量为5.65％.结论:该方法简便、快速准确,可用于测定乙肝宁复方中游离氨基酸的含量测定.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】4页(P161-164)【关键词】乙肝宁;总游离氨基酸;含量测定;茚三酮比色法【作者】邹龙;李仲秋;刘辉;夏新华【作者单位】湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208;湖南中医药大学药学院湖南长沙 410208【正文语种】中文【中图分类】Q503乙肝宁复方为治疗病毒性乙型肝炎的一临床有效验方［1］，该复方由黄芪、白花蛇舌草、绵茵陈、金钱草、党参、蒲公英、制何首乌、牡丹皮、丹参、茯苓、白芍、白术、川楝子十三味药组成［2］，具有补气扶正、健脾化湿、滋肾养肝、利胆清热、活血化瘀等作用［3］。
在本实验早期对乙肝宁复方工艺制备方法优化研究中，发现乙肝宁水提液经絮凝澄清纯化处理后在吸湿性方面较传统醇沉纯化方法处理后有较大改善［4］。
故本课题旨在考察壳聚糖絮凝澄清法对乙肝宁中无效成分游离氨基酸、鞣质、蛋白质等的作用，以探讨其较低吸湿性的原理，说明引起中药制剂吸湿性强的原因。
测氨基酸含量的方法
测氨基酸含量的方法测氨基酸含量可不是一件简单的事儿呢。
有一种方法是茚三酮显色法。
这就像是一场神奇的化学反应魔法。
茚三酮这种东西就像一个侦探，专门和氨基酸打交道。
当它遇到氨基酸的时候，就会发生反应，然后变色。
我们可以把含有氨基酸的样品和茚三酮放在一起，在一定的条件下，比如说合适的温度、酸碱度这些，让它们充分反应。
反应完了之后，就会出现颜色变化。
然后我们可以用一个仪器，就像一个专门看颜色深浅的眼睛，去测量颜色的深浅程度。
颜色越深，就说明氨基酸的含量越高。
这就好像颜色是氨基酸含量的信号，我们通过解读这个信号来知道氨基酸有多少。
还有高效液相色谱法。
想象一下高效液相色谱仪就像一个超级复杂的赛道。
氨基酸们就像一个个小小的运动员，在这个赛道上奔跑。
我们把样品注射到这个仪器里，然后通过各种设置，比如流动相的选择、流速的控制等等，让氨基酸在赛道上按照不同的速度前进。
最后它们会一个一个地到达终点，被检测出来。
不同的氨基酸在这个过程中会有不同的表现，我们可以根据这些表现来计算出每种氨基酸的含量。
这就像一场精确的赛跑比赛，我们通过观察运动员的成绩来统计数据。
再说说氨基酸自动分析仪法。
这个仪器就像一个专门处理氨基酸的小工厂。
我们把样品送进去，它就会自动地进行一系列的操作。
它里面有各种复杂的部件，就像工厂里的机器一样。
这些部件会把氨基酸分离出来，然后进行检测。
它能非常精确地测量出氨基酸的含量，就像一个经验丰富的工人，能够把工作做得又快又好。
我记得在一个实验室里，他们要检测一种植物里的氨基酸含量。
他们先用茚三酮显色法做了一个初步的检测。
把植物样品处理好之后，和茚三酮混合在一起，然后在特定的温度下反应了一段时间。
等反应结束后，他们用分光光度计去测量颜色的变化。
通过颜色的深浅，他们大概知道了氨基酸的含量范围。
然后他们又用高效液相色谱法进行了更精确的测量。
他们仔细地准备样品，调整仪器的各种参数，让氨基酸在色谱柱里好好地“跑”一趟。
氨基酸茚三酮反应
氨基酸茚三酮反应
氨基酸茚三酮反应，也称为米氏试验，是一种检测蛋白质中是否含有氨基酸的化学反应。
这个反应的原理是，当茚三酮在酸性环境下与氨基酸结合时，会发生显色反应，产生紫色或蓝色的化合物。
在实验中，首先要将待测的蛋白质加入一定量的酸性溶液中，使蛋白质分解成氨基酸。
然后加入一定量的茚三酮溶液，让它与氨基酸反应。
如果样品中存在氨基酸，则会发生显色反应，产生紫色或蓝色的化合物，而没有氨基酸的样品则不会出现颜色变化。
茚三酮反应的原理是基于氨基酸中存在α-羰基和氨基两个基团，它们在酸性条件下可以发生酸解离，使α-羰基上的羟基离去，形成不稳定的离子，并与茚三酮中的酮基发生亲核加成反应，生成产物并发生颜色变化。
这种反应的特点是比较敏感，只要氨基酸含量达到一定程度，就能够产生显色反应，因此适用于检测蛋白质中氨基酸含量的多少。
这种检测方法在生物化学实验中经常被使用，是一种常用的方法之一。
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。
二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。
食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。
本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。
通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。
三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。
将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。
2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。
向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。
将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。
用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。
以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。
以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。
五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。
食品中氨基酸含量的测定
实验九食品中氨基酸含量的测定――茚三酮比色法1、目的通过实验，掌握茚三酮比色法测定氨基酸的方法。
2、原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
3、实验材料与仪器3.1材料大豆、奶粉、火腿肠等(1) 0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0(2) 80%乙醇(3) 10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）(4) KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。
将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。
然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。
(5 )标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。
上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。
(6) 乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。
过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。
KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。
配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。
(7) 茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。
5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。
植物生理生化实验【范本模板】
实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法P199原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚—二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫.其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量.①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。
②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水,生成二酮茚-二酮茚胺.材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。
实验步骤：分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中,加入5ml醋酸(使蛋白质变性,沉淀），研磨成匀浆后,用无氨蒸馏置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60％乙醇定容20ml，在570nm 波长下测定吸光度。
样品氨基态含氮量(ug/100g鲜重）=CV T/V S W ＊100 ;C=A/k (k=0.103) ; V T=100/2 ；V S=1 ；W=1注意事项：1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2.样品要磨匀,用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3.抗坏血酸易被还原;加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4.水浴锅的液面要高于试管内的液面,使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇;5.稀释后要迅速比色;6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后,用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。
最适PH为4。
5,是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。
思考题：1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。
2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义?可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。
氨基酸定量测定的方法
氨基酸定量测定的方法氨基酸定量测定有好几种超酷的方法呢。
茚三酮比色法，这方法步骤挺有趣的。
先把含有氨基酸的样品处理好，让它变成适合测定的状态，就像给它梳妆打扮一番似的。
然后加入茚三酮试剂，在特定的温度和时间下反应。
反应完了，就可以用比色计来测定吸光度啦。
这过程中要特别注意温度和反应时间哦，稍有偏差，就像厨师做菜火候没掌握好一样，结果可能就差之千里了。
在安全性方面，茚三酮试剂本身没有特别大的危险，只要正常操作就好，稳定性呢，只要按照规定的条件来，还是比较可靠的。
它的应用场景可广了，在食品检测中经常用到，能快速知道食品中氨基酸的含量。
优势就是操作相对简单，设备要求也不是特别高。
比如说在检测牛奶中的氨基酸含量时，能很快得出大概的结果，这对保证牛奶的质量多重要啊！难道你不觉得这很厉害吗？高效液相色谱法（HPLC）也是个很牛的方法。
要先把氨基酸进行衍生化处理，这一步就像给氨基酸穿上一件特殊的衣服，方便后续检测。
然后把处理好的样品注入高效液相色谱仪，设定好各种参数，像流速、柱温这些。
这时候仪器就开始工作啦，把不同的氨基酸分离开来并进行定量。
这里面的注意事项可不少呢，衍生化试剂的选择和操作一定要谨慎，不然就可能搞砸整个实验。
从安全性来讲，一些衍生化试剂可能有点小危险，要小心使用，就像走钢丝一样得小心翼翼。
稳定性方面，只要仪器正常运行，数据的稳定性还是不错的。
在生物制药领域，HPLC可是大显身手，能精确测定药物中的氨基酸组成。
它的优势就是准确性高，就像神枪手打靶一样准。
拿一种新型的生物药来说，用HPLC测定其中的氨基酸含量，能保证药物的质量和效果，这多棒啊！还有氨基酸分析仪法。
这方法专门针对氨基酸测定设计的呢。
把样品处理好后直接放进氨基酸分析仪。
分析仪就像一个超级侦探，能把各种氨基酸都找出来并定量。
操作过程中要保证样品的纯净度，要是样品里有杂质，就像沙子混进米饭里一样讨厌。
安全性上，只要按照操作规程来，没有太大问题。
总氨基酸含量测定方法
总氨基酸含量测定方法咱今儿就来说说这总氨基酸含量测定方法。
你可别小瞧了这个，它就像是解开食物营养密码的一把钥匙呢！想象一下，氨基酸就像是一群小精灵，在各种食物里蹦跶。
我们要测定它们的含量，就得有巧妙的办法。
先来说说茚三酮比色法，这就好像是个神奇的魔法，能让氨基酸现形。
把样品处理好后，加上茚三酮试剂，然后就等着颜色变化。
这颜色一变，就好像小精灵们穿上了特定颜色的衣服，我们就能知道它们有多少啦！这多有趣呀，就跟变魔术似的。
还有个方法叫甲醛滴定法，这就像是一场和氨基酸的小游戏。
加入甲醛，然后通过滴定来确定氨基酸的量。
就好像我们在和氨基酸捉迷藏，一点点找到它们的踪迹。
咱再说说高效液相色谱法，这可是个厉害的角色呢！它就像是个超级侦探，能把不同的氨基酸一个一个地分辨出来，准确又可靠。
把样品放进去，它就能把各种氨基酸都给揪出来，让它们无所遁形。
那我们为啥要这么费劲去测定总氨基酸含量呢？这可重要啦！你想想，知道了食物里有多少氨基酸，我们就能更好地搭配饮食呀，让身体更健康。
就好比我们知道了前方的路该怎么走，才能走得更稳当。
而且呀，这对食品行业也很重要呢！厂家可以根据测定的结果来改进产品，让我们吃到更好的东西。
这不是很棒吗？测定总氨基酸含量的过程也不是一帆风顺的哟，有时候也会遇到些小麻烦。
比如样品处理不好啦，或者操作的时候不小心出了点差错。
但咱可不能被这些小困难打倒呀，要像勇士一样去克服它们！总之呢，总氨基酸含量测定方法是个很有意思又很有用的东西。
我们要好好去了解它，掌握它，让它为我们的生活服务。
咱可不能小瞧了这些方法，它们就像是隐藏在科学世界里的宝藏，等着我们去挖掘呢！你说是不是？。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
茚三酮法测氨基酸
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
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一、实验原理
茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。 茚三酮和还原性茚三酮反应， 茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化 合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比， 合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比， 可通过测定570nm处的光密度， 可通过测定570nm处的光密度，测定氨基 570nm处的光密度 酸的含量
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮， 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮， 0.5g茚三酮 用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将 12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。 沸蒸馏水溶解 0.5g维生素C 25ml温蒸馏水溶解， 0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅 维生素 温蒸馏水溶解 拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中， 拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中， 不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min， 不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后 搅拌15min 在冰箱内冷却到4℃，过滤、 在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗 4℃ 真空干燥， 涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥 器中保存备用
五、讨论与分析 六、思考题
茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的 定性鉴定？
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
四、结果与计算
氨基酸的含量(g/100ml)=X*100 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
——X为查标准曲线所获得每ml含量g数 X为查标准曲线所获得每ml含量g ml含量
自配样品
——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得 X*250/称取克数（ X*250/称取克数 ml含量 含量g 每ml含量g数） ——250为稀释的倍数 250为稀释的倍数 250
二、试剂与材料
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液 标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液 0.3mM 本实验用赖氨酸） 已配) （本实验用赖氨酸）(已配) pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M 2M醋酸缓冲液 （2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M 86ml 醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成 乙酸混合而成。 醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成。 pH计较正 250ml/班 计较正（ 用pH计较正（250ml/班） （3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和 茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和 85mg 15mg还原茚三酮 还原茚三酮， 10ml乙二醇甲醚溶解 15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解 15ml/组 （15ml/组）
（4）60%乙醇（50ml/组 ） （ 60%乙醇 50ml/组 乙醇（ （5）样品液：每ml含0.5-50ug氨基酸（已配） （ 氨基酸（ 样品液： ml含0.5-50ug氨基酸 已配） （6）分光光度计 （ （7）水浴锅 （
三、操作方法
1、标准曲线的制作
分别取0， 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的 分别取0 0.8,1.0ml0.3mM的 标准氨基酸溶液于试管中 用水补足到1ml。 溶液于试管中， 补足到1ml 标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加 1ml2M醋酸缓冲液 再加入1ml茚三酮显色液 醋酸缓冲液； 1ml茚三酮显色液， 入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充 分混合后盖住试管口， 100℃水浴中加热15min， 水浴中加热15min 分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min， 用自来水冷却。放置5min 5min后 加入3ml60%乙醇稀释 3ml60%乙醇稀释， 用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%乙醇稀释， 充分摇匀，用分光光度计测定OD 充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯 氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD ）。以 氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
氨酸酸样品的测定： 2、氨酸酸样品的测定：
取样品液1ml，加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮 样品液1ml 加入pH5.4,2M醋酸缓冲液 1ml， pH5.4,2M醋酸缓冲液和 混匀后于100℃沸水中加热15min 显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min， 显色液各1ml混匀后于100℃沸水中加热15min，自 来水冷却。放置5min 5min后 3ml60%乙醇稀释， 乙醇稀释 来水冷却。放置5min后，加3ml60%乙醇稀释，摇 匀后测定OD 生成的颜色在60min内稳定） 60min内稳定 匀后测定OD570（生成的颜色在60min内稳定） 将样品测定的OD570与标准曲线对照，可确定样品 将样品测定的OD 与标准曲线对照， 中氨基酸的含量 样品同时做三份取平均数