茚三酮法测氨基酸 - 360文档中心

氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

茚三酮比色测定氨基酸含量

茚三酮比色测定氨基酸含量1）原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。

该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。

2）试剂①1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。

滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。

②pH8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。

Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。

Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。

③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL常量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。

3）操作方法①标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。

静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。

以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

茚三酮显色分光光度法测定食品中α-氨基酸含量的方法探讨

ｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｐＨ５．５，ｉｎａｂｏｉｌｉｎｇｗａｔｅｒｂａｔｈｈｅａｔｉｎｇ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｓ０．９９９５，ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｆｒｏｍ９５．５％ｔｏ１０４．３％ｒａｎｇｅ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｗｉｔｈｓｉｍｐｌｅｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｃｃｕｒａｔｅｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｎｉｎｈｙｄｒｉｎ；ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｙ；ａｒｌｐｈａａｍｉｎｏａｃｉｄ；ｇｌ泽市疾病预防控制中心，山东菏泽
ＤＩＮＧＹｏｎｇｘｉａ
２７４０１０）
（Ｈｅｚｅｃｉｔｙｃｅｎｔｅｒｆｏｒｄｉｓｅａｓｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＳｈａｎｄｏｎｇＨｅｚｅ２７４０１０，Ｃｈｉｎａ）
１材料与方法

茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量

茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量◎侯旭南杨妍林川犇刘徐青霞本文利用茚三酮反应产生特征颜色，改变溶液的吸光度，采用可见光分光光度法对药膳鸡汤及其冻干粉中的氨基酸含量进行分析，建立快速评价冻干药膳鸡汤的新方法。

测定结果表明，茚三酮法测定冻干粉中氨基酸含量具有良好的线性（R2=0.9996），准确性（回收率98.51%～101.61%）。

12种冻干药膳鸡汤中氨基酸含量介于540～2510μg/ml之间；冻干药膳鸡汤中氨基酸含量随其煎煮时长和食盐的增加而提高。

中医药膳学是在中医理论指导下研究食药两用食材的理论及应用的学科，是中医学的一个重要组成部分，是在长期实践中积累逐渐形成的经验学科。

由于食疗药膳的传统烹饪方式商品化程度过低，无法满足快节奏时代的需要，导致其在现代社会的推广受限。

随着真空冷冻干燥技术成本的降低，冻干药膳产品有望实现产业化。

药膳鸡汤作为受众人群最为广泛的食疗药膳，是以药食两用的中药与鸡肉及天然调料熬煮而成。

《内经》记载，药膳鸡汤有益气温中、填精补虚、健脾胃、益五脏、强筋壮骨的功效，适用于营养不良、畏寒肢冷、易疲劳、月经不调等症状。

鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，含有多种人体必须氨基酸。

以鸡肉为基础开发药膳鸡汤，并以现代冻干技术制备方便快捷的药膳鸡汤冻干粉可以实现营养、功能和便捷性的高度融合。

药膳冻干鸡汤的开发有利于药膳的推广和工业化生产，是药膳鸡汤未来研究和发展的趋势。

谷氨酸是酸性氨基酸，分子内含两个羧基增加了其在极性溶剂中的溶解能力，因此微溶于水。

谷氨酸几乎不溶于乙醚等非极性溶剂，也不溶于甲醇和乙醇。

谷氨酸作为食品行业常见的呈鲜物质之一，对鸡汤鲜味具有重要的贡献。

L-谷氨酸可作为药品参与大脑的蛋白质代谢，促进氧化，是人脑中重要的兴奋性神经递质。

本实验以谷氨酸为研究目标，利用谷氨酸与茚三酮反应生成特征颜色的原理，采用可见光分光光度法测定570nm 波长下溶液的吸光度，根据朗伯-比尔定律计算其中的游离氨基酸的含量。

游离氨基酸的测定方法

游离氨基酸的测定方法
游离氨基酸咋测定呢？其实有不少方法呢！比如说茚三酮比色法。

先准备好样品，把它处理成合适的状态。

然后加入茚三酮试剂，经过一系列反应后，通过比色来确定游离氨基酸的含量。

这过程中可得小心操作，要是弄错了一步，那结果可就不靠谱啦！那安全性咋样呢？只要按照正确的步骤来，一般没啥大问题。

稳定性嘛，只要试剂没问题，操作规范，结果还是挺稳定的。

这方法能用到好多地方呢！像食品检测领域，你想想，要是不知道食品里的游离氨基酸含量，咋能保证食品的质量和营养呢？优势也不少呢！操作相对简单，成本也不高。

咱举个实际案例哈。

有个食品加工厂，用这个方法检测产品中的游离氨基酸含量，及时调整了生产工艺，提高了产品质量。

这效果多棒啊！
游离氨基酸的测定方法真的超实用，能帮我们了解各种物质中的氨基酸情况，为我们的生活和生产带来很多好处。

咱可得好好利用这些方法，让它们发挥更大的作用。

茚三酮鉴定氨基酸概述

茚三酮鉴定氨基酸概述1.茚三酮简介茚三酮(Ninhydrine),又称水合茚三酮,水合茚满三酮,为白色或浅黄色结晶性粉末。

茚三酮是一种用于检测氨或者一级胺和二级胺的试剂。

当与这些游离胺反应时，能够产生深蓝色或者紫色的物质，叫做Ruhemann紫。

茚三酮常用来检测指纹，这是由于指纹表面所蜕落的蛋白质和肽中含有的赖氨酸残基，其上的一级胺被茚三酮检测。

在室温条件下，它是一种白色的固体物质，溶于乙醇和丙酮。

茚三酮可以看作是是二氢茚-1，2，3-三酮的水合物。

1901 年,茚三酮被成功研制出来以后主要用于生物医学领域,1954年,瑞典科学家Oden 和Hofsten 将其应用于潜在汗液手印的显现。

茚三酮与汗液中的氨基酸、多肽、蛋白质等发生反应, 生成蓝紫色的手印纹线。

茚三酮也可以用于蛋白质的氨基酸分析。

除去脯氨酸之外的大多数氨基酸，水解之后可与茚三酮反应。

水解中某些氨基酸的侧链也会被降解。

因此对于那些与茚三酮不反应或者发生其他反应的氨基酸需要另作分析。

其余的氨基酸经过色谱分离后可以比色定量。

在分析化学反应的薄层色谱（TLC）中，它可以用于检测所有的胺类，氨基甲酸酯类，在经过充分热处理后可以检测酰胺类物质。

2.实际运用2.1指纹鉴别汗液手印中的汗液成分绝大多数是水(约99%以上),其余是少量的无机物和有机物,有机物中包括了人体所含有的各种氨基酸。

茚三酮与手印汗液中的氨基酸发生显色反应而现出手印。

二氧化碳中的碳原子来源于氨基酸当茚三酮与氨基酸反应时可以释放CO2的羧基碳。

在考古研究中，这个反应用于释放古老骨骼中羧基碳用于稳定同位素分析，以帮助重现古代生物的食物结构。

用一种标记底物处理的土壤，随后利用茚三酮与氨基酸的反应释放羧基胺，可以证明这种底物是否被吸收进微生物蛋白质。

这种方法成功的发现了一些氨氧化细菌（也叫做硝化细菌）利用土壤中的尿素作为碳源。

法医常用茚三酮溶液分析诸如纸张等多孔表面上的潜指纹。

手指所分泌的细微汗液聚集于独特的手指纹路表面，也即含有氨基酸的指纹，经过茚三酮处理可以将氨基酸指尖纹路变为可见的紫色。

氨基酸的测定实验报告

一、实验目的1. 了解氨基酸的基本性质和分类。

2. 掌握氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。

3. 通过实验，学会运用化学分析方法测定氨基酸的含量。

二、实验原理氨基酸是构成蛋白质的基本单位，具有酸碱两性。

在酸性条件下，氨基酸可以与茚三酮反应生成紫色产物，通过比色法测定氨基酸含量。

纸层析法是一种分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，通过分析氨基酸在层析纸上的迁移距离，可以判断氨基酸的种类。

三、实验材料与仪器1. 试剂：茚三酮、氨基酸标准品、盐酸、无水乙醇等。

2. 仪器：分光光度计、电子天平、移液器、层析缸、层析滤纸等。

四、实验步骤1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量（1）配制标准溶液：准确称取一定量的氨基酸标准品，用无水乙醇溶解，配制成一定浓度的标准溶液。

（2）样品处理：准确称取一定量的待测样品，用盐酸溶解，配制成一定浓度的样品溶液。

（3）反应：将标准溶液和样品溶液分别加入反应管中，加入等量的茚三酮，置于沸水浴中加热5分钟。

（4）比色：用分光光度计在570nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（5）计算：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。

2. 纸层析法分离氨基酸（1）点样：将标准氨基酸和待测样品分别点在层析滤纸的原点处。

（2）层析：将点样的滤纸放入层析缸中，加入适量层析溶剂，使溶剂前沿距离滤纸底部约2cm。

（3）观察：待溶剂前沿到达滤纸底部后，取出滤纸，晾干，观察氨基酸在滤纸上的迁移距离。

（4）分析：根据氨基酸在滤纸上的迁移距离，判断氨基酸的种类。

五、实验结果与分析1. 茚三酮比色法测定氨基酸含量通过实验，得到了标准曲线，根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得氨基酸含量。

2. 纸层析法分离氨基酸通过实验，得到了标准氨基酸和待测样品在层析滤纸上的迁移距离，分析了氨基酸的种类。

六、实验总结1. 本实验成功掌握了氨基酸的测定方法，包括茚三酮比色法和纸层析法。

2. 通过实验，加深了对氨基酸性质和分类的认识。

氨基酸分离鉴定中显色剂为什么不能用茚三酮水溶液

氨基酸分离鉴定中显色剂为什么不能用茚三酮水溶液茚三酮根很多种氨基酸都显示紫色没办法分离鉴定呀茚三酮使氨基酸显色原理α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。

脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。

该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。

阿尔法氨基酸与水合茚三酮一起加热，经氧化脱氨变成相应的阿尔法酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮被还原成还原成还原型茚三酮。

在弱酸性溶液中，氨、还原型茚三酮，和另一分子水合茚三酮反应，缩合成蓝紫色物质。

注意事项（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。

（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。

（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。

本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如图3.2所示。

注意事项（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。

（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。

（3）整个实验操作应戴手套进行。

思考题1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2．为什么展层时要用两种溶剂系统？性质：又称比移值。

是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数。

定义为溶质迁移距离与流动相迁移距离之比。

在一定的色谱条件下，特定化合物的R f值是一个常数，因此有可能根据化合物的R f值鉴定化合物请问薄层层析时，Rf值在什么范围时，分离效果比较准我帮你查了相关书籍结合我的实验经验，薄层层析采用硅胶G-CMC板，通用展开系统：无水乙醇-苯（1：4）；苯-氯仿（1：3）；丙酮-甲醇（1：1）。

先用无水乙醇-苯（1：4）展开，Rf值如果>0.8，改用苯-氯仿（1：3），若Rf值如薄层层析时为甚麼Rf值要在0.2~0.8之间Rf值的大小与样品的结构、性质、溶剂系统等有关薄层层析时Rf值要在0.2~0.8之间主演是考虑的经济性，在效果比较好的情况下保持展开剂的用量少蛋白质的性质实验From： Update：2006-12-01【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

一种比较实用的氨基酸定量测定方法_茚三酮法

术可用于生产抗生素、维生素等常用药物和人胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、透明质酸等新药，用于微生物蛋白、氨基酸和一些食品添加剂（如柠檬酸、乳酸、天然色素等）的生产，用于生物固氮、微生物饲料的生产，可用微生物来净化有毒的高分子化合物，消除有毒气体和恶臭物质以及处理有机废水、废渣等等。利用发酵法或半合成法生产的维生素有 9:、 9;/、 9;-/、 96 以及 ! 4 胡萝卜素等。目前，微生物发酵生产及遗传工程技术将合成特定氨基酸的基因克隆进入微生物细胞质粒中，从而借助某些微生物增殖生产等，生物技术已在用新菌种生产氨基酸过程中被应用，这些方法具有产量较高、生产周期短、成本低等优点。<=*>?@AB>C 等人在生产苏氨酸的一些菌种以及在 D 4 赖氨酸、 D 4 苏氨酸的生产中已成功地使用了基因传导技术。随着理想氨基酸模型的深入研究，将具有生产不同氨基酸的菌种或其基因按理想营养模式进行组装，以期在体外或体内生产出满足动物需求的新一代理想天然产品—— — 理想氨基酸复合制剂的研究开发，将会成为今后研制生产氨基酸的发展趋势。日粮中添加氨基酸可以平衡氨基酸的比例，可以提高饲料蛋白质的利用效率，减少氮排出造成的环境污染，维生素可以提高动物机体营养物质的吸收代谢，维持动物生命和正常生长，在动物饲料中添加高剂量的某些维生素，可以增进动物免疫
%
测定结果的计算
氨基酸的含量（ 7） * !" "" ( !" . # ’’3 "" $ %
= #""7
式中： — 氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度（ !"—— "3 #452 6 ） 2 ；； — 氢氧化钠的体积（ ""—— &"42）（ —— — 盐酸标准溶液的摩尔浓度； ! "3 #452 6 2）； — 滴定所需盐酸的体积（ 42） "—— — 氨基酸（或者氨基酸盐）的分子量； #—— — 所称氨基酸（或者氨基酸盐）的质量（； %—— 9） — 二氧化碳的分子量。 ’’3 ""——

氨基酸茚三酮反应

氨基酸茚三酮反应
氨基酸茚三酮反应，也称为米氏试验，是一种检测蛋白质中是否含有氨基酸的化学反应。

这个反应的原理是，当茚三酮在酸性环境下与氨基酸结合时，会发生显色反应，产生紫色或蓝色的化合物。

在实验中，首先要将待测的蛋白质加入一定量的酸性溶液中，使蛋白质分解成氨基酸。

然后加入一定量的茚三酮溶液，让它与氨基酸反应。

如果样品中存在氨基酸，则会发生显色反应，产生紫色或蓝色的化合物，而没有氨基酸的样品则不会出现颜色变化。

茚三酮反应的原理是基于氨基酸中存在α-羰基和氨基两个基团，它们在酸性条件下可以发生酸解离，使α-羰基上的羟基离去，形成不稳定的离子，并与茚三酮中的酮基发生亲核加成反应，生成产物并发生颜色变化。

这种反应的特点是比较敏感，只要氨基酸含量达到一定程度，就能够产生显色反应，因此适用于检测蛋白质中氨基酸含量的多少。

这种检测方法在生物化学实验中经常被使用，是一种常用的方法之一。

实验7茚三酮法测定氨基酸总量

氨酸标准溶液。
3. 实验步骤
（1）样品的处理：量取0.5mL酱油于50mL 烧杯中，加入5g活性炭和40mL的蒸馏水，在电炉上加热至80℃左右，保持半小时后过滤至100mL容量瓶中，用蒸馏水将滤渣清洗数遍后转移容量瓶中，定容至刻度线备用。
（2）标准曲线的绘制及样品测定单位：mL
1 2 3 4 5 6 7、8、9
4.结果计算
氨基酸（μg/mL）=
C×K V
× 100
式中： C——从标准曲线上查得的氨基酸含量，μg K——稀释倍数 V——测定时取样量，mL
5. 注意事项（1）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。（2）有颜色的样品必需经脱色处理至无色后方可使用。
水
1.6 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 1.0
氨基酸标准溶液 0 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.6样品
茚三酮
0.4 0.4 0.4缓冲液 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
各种试剂加到比色管后混匀，于水浴锅上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以氨基酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂材料：酱油仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，
移液管，具塞刻度试管。试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸
氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
试剂配制：讲义P32 （1）2%茚三酮溶液（2）pH8.04的磷酸缓冲液（3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮

食品中氨基酸总量的测定实验报告

食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。

二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。

食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。

本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。

茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。

通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。

三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。

将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。

用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。

2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。

向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。

将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。

用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。

以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。

以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。

五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。

氨基酸总量测定方法

氨基酸总量测定方法咱今儿就来讲讲氨基酸总量测定方法，这可是个很有意思的事儿呢！你想想啊，氨基酸就像是我们身体里的小宝贝，它们的数量和状态对我们可重要啦！要说测定氨基酸总量，那方法可不少呢。

就好像我们要去一个地方，有好多条路可以走。

比如说茚三酮比色法，这就像是走一条大家都比较熟悉的大道，可靠又实用。

把样品和茚三酮试剂一混合，经过一系列反应，就能通过颜色的变化来大致知道氨基酸的量啦。

这多神奇呀！还有甲醛滴定法，这就好比是找到了一个特别的窍门。

利用甲醛和氨基酸的反应，然后通过滴定来确定数量。

是不是感觉很有意思呢？就像解开一个小小的谜题。

再说说电位滴定法吧，这就像是有个特别精准的仪器在帮我们把关，能非常准确地测量出氨基酸的量呢。

那我们在实际操作的时候可得注意一些小细节哦！就像做饭要掌握好火候一样，不能马虎。

比如试剂的选择，一定要挑质量好的呀，不然怎么能得出准确的结果呢？还有操作步骤，一步都不能错哦，不然就像走在路上迷路了一样。

你说，要是我们不认真对待这些方法，那不是就像闭着眼睛走路吗？能走到目的地才怪呢！所以呀，我们得好好琢磨这些方法，就像对待宝贝一样。

在测定的过程中，每一个环节都很关键呢。

从样品的处理到最后的数据分析，都需要我们细心再细心。

这可不是闹着玩的事儿呀！而且呀，不同的样品可能需要不同的方法来测定氨基酸总量呢。

这就好像不同的人穿不同的衣服才合适一样。

你总不能给一个大人穿小孩的衣服吧？总之呢，氨基酸总量测定方法是个很有学问的事儿，我们可得好好研究研究。

只有这样，我们才能真正了解氨基酸的奥秘，才能更好地为我们的健康服务呀！这可不是开玩笑的哦！。

食品中氨基酸含量的测定

实验九食品中氨基酸含量的测定――茚三酮比色法1、目的通过实验，掌握茚三酮比色法测定氨基酸的方法。

2、原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。

氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。

第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

3、实验材料与仪器3.1材料大豆、奶粉、火腿肠等(1) 0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0(2) 80%乙醇(3) 10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）(4) KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。

将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。

然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。

(5 )标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。

上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。

(6) 乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。

过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。

KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。

配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。

(7) 茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。

5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。

04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)

天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。

然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。

再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。

保存于棕色瓶中，置于冷凉处。

试剂适用期限为10 d。

b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。

在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。

c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。

使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。

即成5μg氮/mL标准溶液。

d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。

2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。

置沸水浴中加热15min。

取出后在间歇摇动下冷却15min。

加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。

以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。

于580nm波长下测定吸光度。

以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。

样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。

摇匀后过滤。

样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。

置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。

以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。

茚三酮显色法测定氨基酸含量

❖（2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M 86ml 醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成。用pH计较正（250ml/班）
❖（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和 15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解（15ml/组）
❖ 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将 0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥器中保存备用
• 样品同时做三份取平均数
四、结果与计算
• 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
——X为查标准曲线所获得每ml含量g数
• 自配样品
——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得每ml含量g数）
——250为稀释的倍数
• 五、讨论与分析
• 六、思考题
茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？
实验三茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、实验原理
• 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量
二、试剂与材料
❖（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液（本实验用赖氨酸）(已配)
•（4）60%乙醇（50ml/组） •（5）样品液：每ml含0.5-50ug氨基酸（已配） •（6）分光光度计 •（7）水浴锅
三、操作方法
1、标准曲线的制作
• 分别取0， 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570 为纵坐标，氨酸酸样品的测定：