脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
茚三酮 显色剂
茚三酮中文名称：苯并戊三酮，茚三酮英文名称：Ninhydrin分子量：160.13CAS RN：485-47-2熔点：251℃密度: 0.86性状：本试剂近似为白色结晶,或浅黄色结晶粉末,微溶于乙醚及三氯甲烷,100℃以上变为红色。
特性反应：跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应。
作用茚三酮是一个有机化合物，被广泛用于检测氨、一级和二级胺，尤其是氨基酸。
氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。
此化合物最大吸收峰在570nm波长处。
由于此吸收峰的大小与氨基酸释放的氨量成正比，因此可作为氨基酸的定量分析方法法医学上这个反应被用于鉴定指纹。
茚三酮反应（Kaiser鉴定）也可用来在固相接肽时检验脱保护基是否已经完成，鉴定和比色法分离氨基酸以及鉴定铵离子（呈紫色）。
茚三酮与氨基酸反应生成蓝紫色化合物，但pro，羟-pro反应时呈黄色。
茚三酮用于脯氨酸含量的测定当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸的含量的高低。
在520nm 的波长下比色，从标准曲线（用脯氨酸标准溶液制得）上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
①茚三酮检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。
溶液：本品O.2g溶于乙醇l00ml中。
方法：喷后于110oC加热。
结果：呈红紫色斑点。
茚三酮对一级二级的胺显色肯定没问题的，三级胺有些可以，酰胺应该也没问题的，配制：1.5g 茚三酮 + 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸；显色的时候板子浸湿，用纸擦一下多余液滴，再用电热枪（电吹风太弱了）吹出斑点，显色因为氨基酸的不同而显示不同的紫色黄色等等，你想检测伯胺的话，肯定没有问题的！配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸茚三酮不是太好溶解，需要多搅拌才行。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)
加入物(ml)
1
2
3
4
5
6ห้องสมุดไป่ตู้
脯氨酸标准(100μg/ml)
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
蒸馏水
0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04
脯氨酸含量(μg)
1
2
3
4
5
6
4、 PRO 加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注 意避免产生气泡。如果样品中的脯氨酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进 行测定，样品的检测最好能设置平行管。
积。 4、 所测样本的浓度过高，应用 PRO Lysis buffer 稀释样品后重新测定。
有效期：6 个月有效。
相关：
编号 DF0135 NR0001 PS0013 TO1013
名称 多聚甲醛溶液(4% PFA) DEPC 处理水(0.1%) RIPA 裂解液(强) 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)
加入物(ml)
空白管 标准管
蒸馏水
0.1
—
系列脯氨酸标准(1-6 号管)
—
0.1
脯氨酸提取液
—
—
PRO Assay buffer
1.5
1.5
茚三酮显色液
1.5
1.5
混匀，沸水浴，溶液呈红色。
测定管 — — 0.1 1.5 1.5
5、PRO 测定：迅速冷却加入 PRO 萃取液，振摇 30s，静置片刻，取上清液转移至新的离 心管或试管，离心，取上清液备用。以空白调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)检测标准 管 520nm 处吸光度；以 PRO 萃取液调零，分光光度计(1cm 光径比色杯)检测测定管 520nm 处吸光度。
氨基酸含量的测定茚三酮比色法
5. 说明及注意事项
（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可 达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在440nm处。
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL， 置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性 炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线， 摇匀备用。
6. 思考题 （1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？ （2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点
各是什么？
氨基酸含量/μg 0 100 120 140 160 180 200
各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室 温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光度， 以氨基酸含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
3. 实验步骤
（1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL 烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃ 水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣 清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至 刻线，摇匀备用。
实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法）
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
离子交换色谱 氨基酸分离 茚三酮试剂
离子交换色谱氨基酸分离茚三酮试剂离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化化学物质的技术。
它基于样品溶液中离子与色谱填料表面固定载体之间的相互作用，通过控制溶液的pH值和离子浓度来实现分离。
在离子交换色谱中，色谱填料通常为树脂，它拥有具有特定电荷性质的功能团。
氨基酸分离是离子交换色谱的一种应用，它可以用于研究氨基酸的组成、结构和浓度等信息。
氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，了解氨基酸的组成和序列对于研究蛋白质的功能和结构至关重要。
离子交换色谱可以实现氨基酸的高效分离和纯化，为后续的分析和研究提供可靠的数据基础。
离子交换色谱中，茚三酮试剂（Ninhydrin）是一种常用的检测剂，它可以与氨基酸反应产生紫色或蓝色产物。
当氨基酸通过离子交换色谱柱时，通过检测紫色或蓝色产物的形成，可以确定氨基酸的存在和相对浓度。
离子交换色谱的原理是基于离子间的相互排斥和相互吸附作用。
离子交换色谱柱中的色谱填料通常是由合成树脂制成的，其功能团带有正电荷或负电荷。
当样品溶液通过色谱柱时，样品中的离子与色谱填料的功能团之间会发生相互作用。
具有相同电荷的离子会被色谱填料固定，而具有相反电荷的离子会被排斥出来。
在氨基酸分离中，一般采用阴离子交换色谱柱。
阴离子交换树脂具有正电荷的功能团，可以吸附带负电荷的氨基酸。
而对于带正电荷的氨基酸，可以无需柱化，直接通过。
样品溶液中的氨基酸会根据其电荷、大小和极性的差异，在色谱柱中以不同的速度移动。
通过调节溶液的pH值和离子强度，可以改变氨基酸与色谱填料之间的相互作用，从而实现对氨基酸的分离。
茚三酮试剂在离子交换色谱中的应用主要是用于氨基酸的检测。
茚三酮试剂可以与游离的氨基酸反应生成紫色或蓝色产物，这是因为茚三酮试剂与氨基酸中的氨基反应形成酰胺键。
酰胺键是一种特殊的共价键，它具有很强的光吸收能力，因此形成的产物可以被光谱仪检测到。
茚三酮试剂在氨基酸分析中的应用可以通过色谱柱前和色谱柱后的检测方式来实现。
测定脯氨酸药品配制及操作
测定脯氨酸药品配制及操作一、药品二、试验用具电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1个、50ml容量瓶6个、试管6支（制作标曲应用）、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。
三、溶液配制酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解贮于冰箱中。
6mol/L磷酸：浓度为85%的磷酸大约是14mol/l，如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的2.3倍即可。
3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
冰醋酸甲苯四、试验步骤1、标准曲线的制作(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 μg。
(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6 μg·ml-1。
(3)取6支试管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和3 ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。
表2-5脯氨酸标准曲线表试剂 1 2 3 4 5 6系列Pro 溶液(mL) 2 2 2 2 2 2冰醋酸 2 2 2 2 2 2酸性印三酮溶液 2 2 2 2 2 2Pro 含量 2 4 6 8 10 12(4)冷却后各试管准确加入5 ml甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。
(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml测定液中脯氨酸的含量(μg·2 ml-1)。
氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）
氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
仪器药品721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥研钵容量瓶移液管烧杯试管架试管0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0（见附表2）80%乙醇10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液*：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml 经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。
将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。
然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。
标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。
上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。
乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。
过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。
KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。
配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。
茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。
5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。
脯氨酸测定
在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。
植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
用人造沸石在pH=1-7范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使其不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。
此法具有专一性。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀，离心管。
（三）试剂1.80%乙醇2.人造沸石3.活性炭4.酸性茚三酮溶液：将2.5g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，试剂至少在24h内稳定。
贮于冰箱中；5. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；6. 甲苯。
7.脯氨酸标准液：准确称取25mg脯氨酸溶于少量80%乙醇中，再用蒸馏水定容至250ml，其浓度为100μg/mL。
再取此液10mL，用蒸馏水稀释至100mL。
即成10μg/mL的脯氨酸标准液。
8.冰醋酸三、实验步骤1. 标准曲线的绘制：分别吸取脯氨酸原液（10μg/mL）0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL放入7支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至2mL,其脯氨酸含量分别为0，2，4，8，12，16，20μg。
分别向以上试管中加入冰醋酸2mL，茚三酮试剂2mL，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热15min。
冷却后各试管准确加入5ml 甲苯，充分摇匀萃取，避光静置待完全分层，用吸管吸取甲苯层与比色皿中，用分光光度计于波长520nm下测定吸光度值，以零浓度为空白对照。
脯氨酸测定方法
磺基水杨酸法
一：原理
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长 520nm 处有一最大吸收峰。
脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。
二：试剂
1：质量分数为3%的磺基水杨酸溶液
2：甲苯
3：2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和 6mol/L 磷酸以 3︰2 混合，作为溶剂进行配制，此液在 4℃下 2～3 日有效
4：脯氨酸标准溶液----用蒸馏水配置成100ug/ml（可以不用，看相对含量的高低就好）
三：方法
（1）脯氨酸提取取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入 5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提 10min。
（2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液 2ml，加 2ml 冰乙酸和 3ml 显色液，于沸水浴中加热 40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。
（3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下
式计算样品中脯氨酸含量的百分数。
脯氨酸（μg/g FW 或 DW）= CV/Wa
式中C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得；
V—提取液总体积（ml）；
a—测定时所吸取的体积（ml）；
W—样品重（g）。
*****标准曲线。
脯氨酸含量测定
逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定【实验目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。
2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。
【实验原理】1.逆境条件下（干旱、盐碱、热、冷害、冻害）,植物体内脯氨酸含量会显著增加，并且积累指数与植物的抗逆性有关，因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。
酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。
用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色,再用甲苯萃取，则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
【实验材料】1.材料：小麦幼苗：（1）对照（2）100mM、200mM NaCl处理48h（3）5%、15% PEG-6000处理48h2.试剂：3%磺基水杨酸；冰醋酸；甲苯；2.5% 酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50 μg/ml3.器材：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅【实验内容】1.脯氨酸标准曲线的测定（2）分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml 2.5％的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。
（3）冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。
（4）轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。
2.样品的测定（1）称取不同处理的小麦叶片各0.5 g，于2.5 ml 3%磺基水杨酸试管中，沸水浴中提取10 min。
（2）吸取1ml上清于另一试管中，加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml 2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中显色30 min。
（3）冷却后加入4 ml甲苯，摇荡30S，萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在520nm比色。
【实验结果】查标准曲线，得脯氨酸含量c（µg）脯氨酸含量（µg.g-1）＝c ×(v／a )／w其中V为提取液总体积ml; a为测定液体积ml；W为样品质量g。
干样试验方法
准备: 5毫升移液器, 1毫升移液器1、脯氨酸含量的测定原理：当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
在酸性加热条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，再用甲苯萃取，此缩合物在520nm波长有一最大吸收峰。
脯氨酸含量的高低在一定范围内与其消光度成正比。
从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
步骤：1、脯氨酸提取：称取干样0.05g（精确记录样品质量）放入13毫升带盖离心管中，加10ml 超纯水，将管口套上封口袋(用油性记号笔标记管内溶液高度), 加盖后沸水浴提取60min，冷却后静止大约三个小时，放置冰箱保鲜层静止过夜, 用超纯水补充蒸发水分(根据记号笔做的记号), 最后吸取上清液到另一13毫升带盖离心管中,保存上清液用于测定脯氨酸,总氨基酸, 游离阳离子（Na、K、Ca、Mg、Fe），NO3–, Cl–, H2PO4–, SO42–, 可溶糖。
没测完一个指标后，提取液要放在水浴锅100度5分钟灭菌，然后冻在冰箱中。
2、脯氨酸含量测定：取1ml提取液+1ml3%磺基水杨酸+1ml冰醋酸+2ml 2.5%酸性茚三酮加入玻璃试管中沸水浴显色反应60min，冷却至室温后向其加入4ml甲苯振荡萃取红色物质，静止后用吸管或5毫升移液器吸取红色液体比色.。
注意: 每次比色时，都要用无水乙醇或甲苯将比色皿和吸管清洗，如果用5毫升移液器吸取红色液体比色，则用准备很多枪头就可以了。
药品配制：1、3%磺基水杨酸例如配置500ml，即将15g磺基水杨酸溶于500ml超纯水中。
2、2.5%酸性茚三酮显色液冰乙酸和6mol/L的磷酸以3:2混合作为溶剂进行配置。
即若配置250ml 2.5%的酸性茚三酮的话，所需试剂为：6.25g茚三酮；150ml冰乙酸；100ml 6mol/L 磷酸（40.8ml浓磷酸加59.2ml超纯水中）注意事项：1、磺基水杨酸需现用现配（24小时内失效）2、酸性茚三酮：于70℃加热溶液，冷却后置棕色试剂瓶中，4℃下保存备用，2-3天内有效。
游离脯氨酸——精选推荐
游离脯氨酸含量测定
一、试剂
1、3%磺基水杨酸水溶液：3g磺基水杨酸溶于100mL蒸馏水中
2、甲苯
3、2.5%酸性茚三酮显色液：将2.50 g 茚三酮于60 mL 冰醋酸和40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（70 ℃）溶解。
（冰乙酸和6mol/L磷酸以3：2混合，作为溶剂配制，此液在4℃下2-3天有效）
4、脯氨酸标准液：准确称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容到250ml，其浓度为100μg/mL。
再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/mL的脯氨酸标准液。
二、标准曲线制作
2、取出冷却后，向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。
静置待分层后吸取红色甲苯层于比色皿中，以0号管为对照在波长520nm下测定吸光度。
3、以吸光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
三、步骤
1、脯氨酸提取：取剪碎混匀叶片0.2-0.5g，放入具塞大试管中，加入5mL3%磺基水杨酸，加塞，于沸水浴中浸提10min，冷却待测。
2、含量测定：吸取上清2ml于试管中，加2ml冰乙酸和3ml酸性茚三酮显色液，沸水浴加热显色40min，取出冷却至室温，加入5mL甲苯，充分振荡，以萃取红色物质，静置分层后吸取甲苯层，于分光光度计520nm处测定。
3、结果计算：由标准曲线得出测定液中脯氨酸量C（μg）
脯氨酸含量（μg/g鲜重）=（C×提取液总体积V）/（样品重W×测定时所吸取的体积A）。
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法1. 原理样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm检测吸光度，并作空白对照实验。
2. 应用范围本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。
本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。
3. 试剂及仪器3.1脯氨酸3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配）3.3 2-甲氧基乙醇3.4 蚁酸(96%)，即甲酸3.5 异丙醇（2-丙醇）水溶液：水：丙醇=1：13.6 15ml旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉）3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm下3.8 1cm 玻璃比色皿4. 样品准备4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20的水进行稀释。
其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L(见稀释表)。
浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。
蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。
将样品在分析之前离心5min左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。
4.2原果汁稀释表样品类型稀释比例颜色空白期望值Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yesLemon 柠檬21:1 noLime 酸橙21:1 noMandarin 中国柑桔21:1 noMango 芒果1:1 yesNectarine 油桃21:1 noOrange 柑桔21:1 noPapaya 番木瓜1:1 yesPassion Fruit 西番莲1:1 yesPeach 桃6:1 yesPineapple 菠萝1:1 yesPlum 李子7:1 yesPrune 西梅16:1 yesRaspberry 悬钩子（树梅）5:1 yesStrawberry 草莓1:1 yesTangerine 橘子21:1 noTomato 番茄1:1 yes5. 标准溶液的制备5.1脯氨酸贮备液（500mg/L）：0.0500g脯氨酸加水定容至100ml。
植物体内游离脯氨酸的测定
植物体内游离脯氨酸的测定在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低。
但在逆境（如旱、寒、盐等）条件下，植物体内游离脯氨酸的含量可增加10-100倍，因此有人提出游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性指标。
植物体内的游离脯氨酸用磺基水杨酸或酒精提取。
在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物（结构如下），用比色法于520um波长下测定脯氨酸的含量。
仪器设备：分光光度计、析天平、恒温水浴、研钵、容量瓶、具塞试管：25毫升9支、移液管：2毫升4支、5毫升2支、漏斗、滤纸。
1．称取0.5000g剪碎烟叶加入试管，加5ml 3%磺基水杨酸，封口，沸水浴10min；过滤后备用。
2．吸取2ml提取液加入试管（对照管用2ml水代替），各加入2ml冰醋酸，4ml 茚三酮，摇匀，煮沸30min，冷却比色（OD520）试剂配制：1．3%磺基水杨酸：称3.000g磺基水杨酸溶解，定容至100ml。
2．茚三酮：称2.50g茚三酮，加60ml冰醋酸和40ml 6M磷酸，在热水（70°C）溶解，一般现用现配（24小时）6M磷酸：吸取86ml磷酸，定容至250ml.试剂酸性茚三酮：称取2.5克弗三酮，加入60毫升冰醋酸和40毫升6M磷酸（冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制），于70℃下加热溶解。
冷却后贮于棕色试剂瓶中备用。
4℃下2～3日内有效。
脯氨酸标准溶液：称取0.0250克脯氨酸，溶解在250毫升蒸馏水中，其浓度为100微克／毫升。
再取此液10毫升，用蒸馏水稀释至100毫升，即为10微克／毫升之脯氨酸标准液。
冰醋酸甲苯若用磺基水杨酸提取，需要配制3%的磺基水扬酸溶液。
（若用酒精提取，需要80%的酒精，活性炭，人造沸石）。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。
茚三酮比色测定氨基酸含量
茚三酮比色测定氨基酸含量1）原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
2）试剂①1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
②pH8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL常量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
3）操作方法①标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
茚三酮 显色剂
茚三酮中文名称：苯并戊三酮，茚三酮英文名称：Ninhydrin分子量：160.13CAS RN：485-47-2熔点：251℃密度: 0.86性状：本试剂近似为白色结晶,或浅黄色结晶粉末,微溶于乙醚及三氯甲烷,100℃以上变为红色。
特性反应：跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应。
作用茚三酮是一个有机化合物，被广泛用于检测氨、一级和二级胺，尤其是氨基酸。
氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。
此化合物最大吸收峰在570nm波长处。
由于此吸收峰的大小与氨基酸释放的氨量成正比，因此可作为氨基酸的定量分析方法法医学上这个反应被用于鉴定指纹。
茚三酮反应（Kaiser鉴定）也可用来在固相接肽时检验脱保护基是否已经完成，鉴定和比色法分离氨基酸以及鉴定铵离子（呈紫色）。
茚三酮与氨基酸反应生成蓝紫色化合物，但pro，羟-pro反应时呈黄色。
茚三酮用于脯氨酸含量的测定当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸的含量的高低。
在520nm 的波长下比色，从标准曲线（用脯氨酸标准溶液制得）上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
①茚三酮检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。
溶液：本品O.2g溶于乙醇l00ml中。
方法：喷后于110oC加热。
结果：呈红紫色斑点。
茚三酮对一级二级的胺显色肯定没问题的，三级胺有些可以，酰胺应该也没问题的，配制：1.5g 茚三酮 + 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸；显色的时候板子浸湿，用纸擦一下多余液滴，再用电热枪（电吹风太弱了）吹出斑点，显色因为氨基酸的不同而显示不同的紫色黄色等等，你想检测伯胺的话，肯定没有问题的！配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸茚三酮不是太好溶解，需要多搅拌才行。
04-02-021茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤(精)
天津现代职业技术学院一、茚三酮比色法测定氨基酸态氮的操作步骤1、试剂a) 茚三酮试剂：称取1.2g茚三酮，加l5mL正丙醇，摇动使其溶解。
然后加入30mL正丁醇，60mL乙二醇，混匀。
再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。
保存于棕色瓶中，置于冷凉处。
试剂适用期限为10 d。
b) 4mol/L pH4.5乙酸缓冲液：称取27.2g乙酸钠(NaAc·3H2O)于烧杯中，加80mL水溶解。
在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH 4.5，然后用煮沸冷却水稀释至l00mL。
c) 氨基酸标准液：准确称取在80～90℃下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或α-丙氨酸31.8mg，加10％异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。
使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。
即成5μg氮/mL标准溶液。
d) 10g/L抗坏血酸溶液(制备液仅用一天)。
2、测定步骤标准曲线的绘制：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min。
取出后在间歇摇动下冷却15min。
加热时形成的红色茚满酮在冷却和摇动时被空气中氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。
于580nm波长下测定吸光度。
以氨基氮量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标制绘标准曲线。
样品处理：准确称取新鲜样品0.5g(或干样品0.1g)置研钵中，加5mL10％乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。
摇匀后过滤。
样品测定：吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL 10g/L 抗坏血酸溶液，混匀。
置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。
以60％乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。
植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定
植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。
在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。
该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit ），在PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。
3 ．酸性茚三酮试剂：称取2.5g 茚三酮，加入60mL 冰醋酸和40mL 6mol/L 磷酸，于70 ℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，4 ℃保存，两天内稳定。
4 ．脯氨酸标准母液：称取10mg 脯氨酸溶于少量80% 乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL, 成100μg/L 母液。
测脯氨酸含量：1 ．脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0mL 分别放入8 个50mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL ，配成0.0 ，1.0 ，2.5 ，5.0 ，10.0 ，15.0 ，20.0 ，30.0μg/mL 的系列溶液。
分别吸取上述各标准溶液2mL ，冰醋酸2mL ，茚三酮试剂2mL ，加入到10mL 带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15 分钟，用分光光度计测定520nm 的光密度值，以零浓度为空白对照。
将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。
2. 测定样品的脯氨酸含量（ 1 ）提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份0.3g 。
剪碎，加入适量80% 乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。
匀浆液全部转移至25mL 刻度试管中，用80% 乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80% 乙醇定容至刻度，混匀，80 ℃水浴中提取20 分钟。
(2 ）除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g 的人造沸石和0.2g 活性碳，强烈振荡5 分钟，过滤，滤液备用。
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脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)
简介：
脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。
与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。
羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。
在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。
Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。
该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
自备材料：
1、蒸馏水
2、研钵或匀浆器
3、离心管或试管
4、滤纸或纱布
5、水浴锅
6、比色杯
7、分光光度计
操作步骤(仅供参考)：编号
名称TO1113
50T
Storage
试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃
试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT
试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT
试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份
1、准备样品：
①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高浓度的脯氨酸，可以使用PRO Lysis buffer进行恰当的稀释。
2、配制茚三酮显色液: 取出茚三酮，准确溶解于茚三酮稀释液，加热搅拌至完全溶解，混
匀，即为茚三酮显色液。
4℃避光备用，48h有效。
注意：茚三酮稀释液具有一定腐蚀性，请小心操作。
3、配制系列脯氨酸标准溶液：取出脯氨酸标准(100μg/ml)恢复至室温后，以脯氨酸标准
(100μg/ml)按下表继续稀释：
加入物(ml) 1 2 3 4 5 6
脯氨酸标准(100μg/ml)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 脯氨酸含量(μg) 1 2 3 4 5 6
4、PRO加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注
意避免产生气泡。
如果样品中的脯氨酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
加入物(ml) 空白管标准管测定管
蒸馏水0.1——
系列脯氨酸标准(1-6号管) —0.1 —
脯氨酸提取液——0.1
PRO Assay buffer 1.5 1.5 1.5
茚三酮显色液 1.5 1.5 1.5
混匀，沸水浴，溶液呈红色。
5、PRO测定：迅速冷却加入PRO萃取液，振摇30s，静置片刻，取上清液转移至新的离心管或试管，离心，取上清液备用。
以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管520nm处吸光度；以PRO萃取液调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测测定管520nm 处吸光度。
计算：
以系列脯氨酸标准(1-6号管)含量(μg)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算其脯氨酸含量。
根据如下公式计算具体样品中脯氨酸的含量：
植物组织样品PRO(μg/g)=C×V T/(W×V S)
式中：C=从标准曲线上查得的脯氨酸含量(μg)
V T=脯氨酸提取液总体积(ml)
W=样品鲜重(g)
V S=测定时加入提取液体积(ml)
血清、尿液等样品AA(μg/ml)=C×N/V S
式中：C=从标准曲线上查得的脯氨酸含量(μg)
N=稀释倍数
V S=测定时加入提取液体积(ml)
注意事项：
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于4℃。
2、PRO Assay buffer应密闭保存，防止挥发。
3、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑酶标仪的最大检测体
积。
4、所测样本的浓度过高，应用PRO Lysis buffer稀释样品后重新测定。
有效期：6个月有效。
相关：
编号名称
DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)
NR0001 DEPC处理水(0.1%)
PS0013 RIPA裂解液(强)
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)。