8 基因组文库的构建与目的基因的获得
基因工程的操作步骤
利用PCR技术扩增目的基因
原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知 目的基因的脱 氧核苷酸序列, 以便合成引物。
过程
预变性 增加DNA变性的概率
高温变性 解旋为单链
低温退火 引物与单链互补结合 适温延伸 在Taq酶的作用下合成
与模板互补的DNA双链 重复循环
归纳: 基因工程的基本操作程序. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测:是否插入、转录、翻译
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,它能阻碍RNA聚合酶的移动, 并使其从DNA模板链上脱离下来,使转录终止。
RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质. 以模板转录 然后脱落
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
原核 细胞 的基 因结
构
编码区 能转录相应的信使RNA,能编码蛋白质
知识点二.基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细 胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
目的基因主要是__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因__
1.获取目的基因的途径
A.从自然界已有的物种中分离
B.人工合成
2.获取目的基因的方法
四、目的基因的检测与鉴定
检测:
是否插入目的基因 DNA分子杂交技术 是否转录 mRNA分子杂交技术 是否翻译 抗原—抗体杂交技术
基因组文库构建的基本过程
基因组文库构建的基本过程构建基因组文库,听起来是不是有点高大上?其实啊,这个过程就像是做一碗丰富的杂烩,里面有各种各样的成分,味道可好了。
今天就让我们轻松愉快地聊聊这个过程,从头到尾都不复杂,保证让你听完后恍若领悟了宇宙的奥秘!1. 基因组的准备首先,咱们得有“食材”,也就是目标基因组。
想象一下,像个侦探一样,你得先找到你要研究的生物,这可能是一只可爱的青蛙,或者一株神秘的植物。
然后,从这些生物体中提取DNA,这一步就像是把青蛙放在水里,慢慢观察它的变化。
提取DNA的过程其实也没那么神秘,简单来说,就是用一些化学试剂把细胞里的DNA分离出来。
就像剥蒜一样,简单又有效。
接下来,得把提取的DNA切割成小片段。
这就好比在厨房里把食材切成小块,方便后面的烹饪。
这个切割的过程,通常用一些特殊的酶,听上去高端,但实际上就是让DNA变得易于处理。
你可能会想,这么多小块到底怎么存起来呢?别急,接下来就要介绍基因组文库的“容器”了。
2. 构建文库2.1 载体的选择在我们的基因组文库中,载体就像是一个个小小的运输箱,专门用来存放那些切割好的DNA片段。
这里面有各种各样的选择,最常见的就是质粒,这种小圆圈状的DNA 能在细胞中独立复制,真是个省心的好伙伴!当然,也有其他的载体选择,比如病毒载体,听起来就有点神秘,实际上它们也只是利用病毒的特性来运送我们的DNA而已。
2.2 转化过程有了载体后,咱们就可以把这些小DNA片段装进去,进行转化了。
转化就像是给每个小箱子上锁,把它们装上货车,准备运输到指定地点。
通常我们会把这些装有DNA的载体放入细胞中,等待它们“安家落户”。
这一步可有讲究了,要控制好温度和环境,让细胞在“舒适”的状态下接纳这些新朋友。
3. 筛选与鉴定3.1 筛选一旦我们的载体和DNA片段都进了细胞,接下来就是筛选这些“小箱子”了。
这一步可以想象成是在参加一个聚会,大家都是陌生人,但你只想和那些有趣的、能引起你兴趣的人交朋友。
基因组文库的构建过程
基因组文库的构建过程1. 基因组文库到底是什么?说到基因组文库,很多人可能会一脸懵,觉得这跟他们平常的生活完全扯不上关系,其实这就是科学家们用来储存基因信息的一种方式。
简单点说,就是把所有的基因像书一样整理好,方便后人查阅、研究和利用。
好比我们会把一本厚厚的食谱分门别类,想吃什么菜随时翻出来,这就是基因组文库的妙处。
在它的庇护下,科研人员就能随时拿出各种基因的“身份证”,让小小的基因发挥出超大能量。
2. 构建基因组文库的步骤2.1 提取DNA首先,咱们得从细胞中提取出DNA,这可是整件事情的开端。
就像从果子里挤出果汁,如果不先把果子准备好,你再想喝到果汁,简直是白日做梦。
提取DNA的过程看似简单,但可得小心谨慎,免得“失之毫厘,谬以千里”。
科学家们用各种化学试剂,像是一场小型的化学派对,最终把DNA提取出来,然后像捡到宝一样,小心呵护着。
2.2 进行切割提取完DNA后,接下来就是切割了!没错,听起来有点儿暴力,但这其实是为了让DNA变得更小,方便我们后面进行分析。
科学家们用一种特别的酶,就像料理大厨用刀切菜一样精准,可以把DNA切割成许多小片段。
每一片都是独特的,有点像拼图的每一块,只等着我们组合拼接。
2.3 建库接下来说到建库,小伙伴们要聚焦了!这一步可是整件事的重头戏。
科学家们会把这些切割好的DNA片段拷贝到一种载体中,类似把拼图放进一个大盒子里,当然这个“盒子”可是经过特殊设计,能确保我们的DNA安全无虞。
这个过程就叫做克隆,听起来是不是有点科幻感?别担心,脑子里别想太多电影情节,这可是正儿八经的科学探索。
3. 筛选和验证3.1 筛选目标片段库建完后,接下来就进入了筛选阶段。
就像我们去超市挑水果,总得挑一些看起来新鲜的,基因组文库也是如此。
一些基因有可能因为各种原因不太好,科学家们会通过培养和筛选,把一些很有潜力的基因片段挑出来。
这其中的细致和耐心,简直堪比工匠精神,得一丝不苟。
3.2 验证质量最后一步是验证,就像做一道菜,你不能光有调料,还得保证味道正宗。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少,对酶和碱极为敏感,
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction)法,又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是:已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法: 根据目的基因的全序列,分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊:化学合成DNA的单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片段化学合成的收率极低,例如,每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
目的基因的获取
目的基因的获取基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种。
为此必须从现有生物群中,根据需要分离出用于克隆的此类基因。
这类基因称之为目的基因,即准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
目前目的基因的获取方法主要有以下2类:(1)已知基因的获得:PCR分离法和化学合成法等(2)未知基因的获得:直接分离法和基因文库分离法等第一节直接分离法1、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
应用对象:适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单。
(1)对已定序列的DNA分子,只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割,分离纯化所需要的DNA片断,与适当载体连接。
(2)对已知定位的目的基因,只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点,一次就可以获得。
(3)即使含目的基因的DNA分子未定序或定位,也只须通过酶切分析,随后再通过部分酶切,构建一个简单的基因文库,从钩出目的基因。
2. 随机片断化2.1. 限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间,使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
2.2 机械切割法(1)超声波超声波强烈作用于DNA,可使其断裂成约300bp的随机片断。
(2)高速搅拌1500转/分下搅拌30min,可产生约8kb的随机片断。
3. 物理化学法基本原理:DNA分子的两条链存在着G≡C、A=T碱基配对,其中GC间存在3个氢键、A T间存在2个氢键,如果不同基因片段的碱基组成差异较大,其理化性质,如浮力密度和解链温度等也明显不同,采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。
3.1密度梯度离心法由于富含碱基GC的双链DNA片段浮力密度较大,利用精密的密度梯度超速离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分离开来。
然后通过与某种放射性的mRNA杂交来检验,分离相应的基因。
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域,基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库,它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用,包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库,它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤:1、基因组文库的构建:首先需要获得该生物的基因组,然后将基因组进行分解,形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中,形成基因组文库。
2、表达文库的构建:为了筛选出具有特定功能的基因,还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达,以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时,需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤:1、选择相应的基因文库:首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因,可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因:根据研究目标,可以在文库中进行筛查,挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能:通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑:基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列,可以确定目标基因的精确位置和剪切位点,从而实现精准的基因组编辑。
基因工程基本操作四个步骤
PCR技术—聚合酶链式反应
概念:
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
原理:
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
前提:
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件: 模板DNA
(含有目的基因)
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶) 一对引物 温度控制
指数 方式扩增,即____ ④方式:以_____ 2n (n为扩增循 环的次数)
⑤结果:
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程: a、DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板 氢键 断裂,形成___________ 单链DNA 在热作用下,_____ b、退火(复性55℃-60℃):系统温度降低,引 双链 。 物与DNA模板结合,形成局部________ c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,从 引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补 DNA链 。 的________
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两段
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________
2、获取目的基多dna片断导入到受体菌的群体中各个取2基因表达载体的构建3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定一目的基因的获取1目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因2获取目的基因的常用方法有哪些
利用PCR技术扩增目的基因
(二)利用PCR技术扩增目的基因 选修1 P60
多聚酶链式反应 ,是一项 ① 概念:PCR全称为_______________ 体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术 在生物____ ___________ DNA双链复制 ②原理:__________ 已知基因的核苷酸序列 、 ③条件:_______________________ 四种脱氧核苷酸 、___________ 一对引物 (做启动子)、 _______________ DNA聚合酶 前提条件: ___________. 指数 方式扩增,即____ ④方式:以_____ 2n (n为扩增循 环的次数) ⑤结果: 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(一)从基因中获取目的基因1.基因
基因工程的基本操作程序
1.2基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取(三种方法)1.从基因文库中获取:(1)分类:①基因组文库:含有某种生物的全部基因;② cDNA文库:含有某种生物的部分基因(2)基因文库的构建过程:略(课本P10;注意两种文库的区别)2.PCR技术扩增目的基因(1)概念:短时间内在体外大量复制DNA的技术。
(2)原理:DNA双链复制(3)条件:模板、Taq酶、引物(单链DNA片段,能与模板链互补配对)、4种脱氧核苷酸(4)过程:变性→退火→延伸3.通过DNA合成仪用化学方法人工合成:目的基因比较小,核苷酸序列已知第二步:基因表达载体的构建(核心步骤)1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在和表达,并且可以遗传给下一代2.组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因(+复制原点)(1)启动子(RNA聚合酶结合位点):位于基因的首端,能驱动基因转录出mRNA(2)终止子:位于基因的尾端,终止转录①启动子和终止子位于DNA上;起始密码子和终止密码子位于mRNA上②真核生物的基因结构非编码区:不能转录出mRNA,但能调控基因的表达(含有启动子和终止子)基因外显子:转录出的mRNA能翻译出蛋白质编码区(原核生物的基因无外显子和内含子之分)(能转录形成mRNA)内含子:转录出的mRNA不能翻译出蛋白质(加工时被剪切)第三步:将目的基因导入受体细胞1.转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程2.常用的转化方法:①导入植物细胞:主要是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物(植物受损伤时,伤口处细胞分泌大量酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞),农杆菌中Ti质粒的T-DNA能转移至受体细胞,并整合到受体细胞染色体的DNA上②导入动物细胞:最常用的方法:显微注射技术。
受体细胞:受精卵③导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的优点:繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少最常用的原核细胞是大肠杆菌,方法:感受态法(Ca2+处理法,增强细胞壁的通透性)第四步:目的基因的检测与鉴定目的基因是否成功导入:DNA分子杂交技术(用到基因探针)分子水平目的基因是否成功转录出mRNA:分子杂交技术(从细胞中提取mRNA,用检测基因探针与其杂交,观察是否形成杂交带)目的基因是否成功翻译成蛋白质:抗原—抗体杂交技术个体生物学水平鉴定:做抗虫、抗病接种实验;或将植物移栽至盐碱地;功能活性对比①基因探针:用放射性同位素标记含有目的基因的(单链)DNA片段②转基因实验成功的标志:成功表达出相关蛋白质和性状。
如何通过构建基因文库来获取目的基因
如何通过构建基因⽂库来获取⽬的基因⼀、概念主要有两种基因⽂库:基因组⽂库和cDNA⽂库。
基因组⽂库:⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切后,将酶切⽚段插⼊到载体DNA分⼦中,所有这些插⼊了基因组DNA⽚段的载体分⼦的集合体,将包含这个⽣物体的整个基因组,也就是构成了这个⽣物体的基因⽂库。
cDNA⽂库:是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合体。
⼆、构建基因⽂库的主要程序1、DNA提取及⽚段化或是cDNA的合成⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切或全部mRNA经反转录形成的cDNA⽚段。
2、载体的选择及制备这些载体可以分为两类,⼀类是基于噬菌体改建的,利⽤了噬菌体的包装效率⾼和杂交筛选背景低的优点;另⼀类经改造的质粒载体或⼈⼯染⾊体,其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源⽚段。
3、DNA⽚段或cDNA与载体连接⽤重组DNA技术将某种⽣物细胞的DNA的所有⽚断随机地连接到基因载体上。
4、重组体转化宿主细胞⽤质粒作为载体的重组DNA分⼦可以通过转化引进细胞。
⽤λ噬菌体的DNA作载体的重组分⼦直接经转染引⼊细胞的效率较低;⼀般需先⾏离体包装,即把重组DNA分⼦包在噬菌体外壳中,再通过噬菌体感染⽽把重组DNA分⼦引⼊敏感细菌细胞中。
三、鉴定和转化细胞的筛选当获得了含重组体的宿主细胞时,即完成了基因的克隆。
然⽽,它只是分离基因的第⼀步,基因克隆后还要对克隆的基因进⾏分离。
因此,还必须对其进⾏必要的检测与分析,如序列测定,体外转录及翻译、功能互补实验等。
通过这些实验确定基因结构及功能,此时才能算分离到了⽬的基因。
所以,基因克隆、克隆基因分离、分离基因鉴定是利⽤基因⽂库技术分离⽬的基因的主要内容。
从基因⽂库中筛选某⼀克隆的基因常⽤办法是分⼦杂交。
⾸先把属于⼀个⽂库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养⽫上以取得相当分散的菌落或噬菌斑,然后⽤硝酸纤维滤膜吸印,使培养⽫和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。
基因工程的基本操作程序的步骤
相同点
原则
碱基互补配对
原料 4种游离的脱氧核苷酸
模板
DNA双链
不同点 解旋方式
加热
解旋酶Biblioteka 场所体外细胞核
酶 结果
Taq酶 细胞内的 DNA聚合酶
大量的DNA 形成整个的
片段
DNA分子
(三)用化学方法直接人工合成 条件:基因较小,核苷酸序列已知。 仪器:DNA合成仪
二、基因表达载体的构建
1、元件:
复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子
与细胞膜无关 用Ca2+处理细胞→ 感受态细胞
重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
1、导入目的基因后需要检测哪些方面? 各采取什么方法?
2、什么是DNA分子探针?检测时的DNA探 针通过什么原理来检测目的基因和相 应的mRNA?
3、利用抗体-抗原杂交检测的原理是什 么?
基
片段 拼接到载体上
因
组
导入受体细胞DN?
依据目的基因的有关信息。
如:根据 基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性。
b.使目的基因能够表达和发挥作用。
载体与基因表达载体的区别:
载体的组成:
复制原点+目的基因插入位点+标记基因 基因表达载体的组成:
复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子
同:二者均有标记基因和复制原点 异:表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、
终止子三部分结构 (其中启动子、终止子对于目的基因的表达(转录步骤)
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种:
1. PCR扩增法:利用聚合酶链反应(PCR)从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。
这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物,通过PCR扩增
特定片段。
2. 基因合成法:利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。
这种方法可以通过合成多个片段,再进行连接而合成完整的目的基因。
3. DNA文库筛选法:构建基因文库,将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。
然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选,找出含有目的基因的载体。
4. 基因克隆法:将目的基因从一个生物体中剪切出来,然后将其插入到另一个载体中,形成重组DNA。
这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。
5. 基因编辑法:利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术,直接对细胞或生物体进行基因编辑,将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。
这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。
胰岛素目的基因的获取方法
胰岛素目的基因的获取方法
胰岛素目的基因的获取方法有多种,常用的有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选。
1.从基因文库中获取:基因文库是指将含有不同基因的许多DNA 片段构建在基因组文库或cDNA文库中储存起来。
通过筛选文库,可
以找到目的基因。
2.利用PCR技术扩增:通过特定的引物,利用PCR技术在模板DNA上进行体外酶促扩增,获得大量的目的基因片段。
3.化学合成法:如果已知目的基因的核苷酸序列,可以采用化学合成法来获得目的基因。
4.从cDNA文库中筛选:cDNA文库是指将mRNA逆转录成cDNA,
构建在质粒或噬菌体中储存起来。
通过筛选文库,可以获得目的基因的cDNA序列。
此外,还可以利用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离,或者使用细胞工程、基因工程等方法获取目的基因。
总之,获取胰岛素目的基因的方法因目的和条件而异,需要综合考虑实验条件、目的基因的特性以及实验目标等因素进行选择和应用。
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第二链的合成
自身引导合成法 置换合成法 PCR合成法
第二链的处理
同聚源的 mRNA 除去,使其中一个细胞系中 不同的mRNA保留并被克隆
SSH:
Suppression subtractive hybridization
抑 制 消 减 杂 交
寡聚(dT)纤维素柱
mRNA分离
反转录酶
cDNA第一链合成
表达分析
接头克隆 引物-转接头克隆 同聚尾克隆 Okayama-Berg载体克隆
自身引物合成、置换合成或外加引物合成
cDNA第二链合成 第一链的合成
反转录:以oligo(dT)为模板由反转录酶合成。
EST:expressed sequence tag
在人类基因组测序工作中,有一个区别于“全基因 组 战 略 ” 的 “ cDNA 战 略 ” , 即 只 测 定 基序列 作为表达序列标签,其作用相当于全基因组测序 时的序列标记位点( STS ),即可用来验证和整 理不同实验室发表的cDNA测序资料。 两端又重叠序列的EST可以装配成全长的cDNA序列。 特定的EST序列有时通过克隆方法保存在适当宿主中的 某种生物、组织、器官或细胞类型的所有 DNA 片段而构成的克隆3 目的基 基因组DNA的分离; 插入片段的制备; 插入
载体名称
质粒 λ噬菌体载体
容量
15kb 25kb
黏粒载体
酵母人工染色体 细菌人工染色体
45kb
400kb 300kbλ噬菌体基因组的构建黏粒基因组的构建
YAC基因组的构建BAC基因组的构建
基因组的大小和代表性8.2 cDNA文库的构建
总RNA提取
8.3 目的基因的获得
已知基因序列基因的知序列基因的分离
染色体步移 杂交捕捉和释放 DDRT 限制性标记cDNA扫描
基因的人工合成
染色体步移
限制性标记cDNA扫描
人类基因组计划
目标: 构建“遗传图、物理图、转录图和序列图”。