荧光原位杂交 FISH 实验操作步骤
羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤
羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤未培养羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤一、羊水标本玻片制备1.Hanks胰酶消化：5-8ml未培养羊水标本离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入5ml水浴加热至37℃的Hanks胰酶溶液（0.25%），充分混匀，37℃水浴25min；2.低渗：离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入8ml水浴加热至37℃的低渗液（0.075M KCL），充分混匀，37℃水浴30min；3.预固定：迅速加入1ml新鲜配制的固定剂（甲醇∶冰乙酸=3∶1），并立即轻柔混匀细胞悬液，2500转/分钟离心10min，弃上清；4.固定：加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，固定30分钟以上或放置过夜，2800转/分钟离心10min弃上清，加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，2800转/分钟离心10 min弃上清，根据细胞多少加入0.2-0.5ml新鲜配制的固定剂，调至适宜浓度后滴片；5.滴片：将2-3滴细胞悬液滴加在用冰水预冷的干净载玻片上，并立即将玻片放入75℃的烤箱中，待表面干燥后取出编号；6.烤片：将玻片放入60℃烤箱中烘烤2 hr；7.Rnase A处理：标本玻片杂交区用40μl 0.1mg/ml RNAase A 溶液（溶解于2×SSC）于37℃处理30-50min，再用2×SSC于室温洗2min，依次放入70%，90%，100%的酒精中脱水各2min，室温晾干玻片。
8.胃蛋白酶消化：将玻片放入水浴加热至37℃的胃蛋白酶溶液（0.25%）中处理5min,立即取出玻片，在室温条件下，依次将玻片放入2×SSC、70%、90%、100酒精中各处理2分钟，气干玻片。
二、探针、玻片变性及杂交9.探针变性：按试剂说明书配制探针液，于75℃水浴变性5min；10.玻片变性：玻片于75℃变性液（70%甲酰胺/2×SSC）中变性5min，酒精梯度脱水迅速风干玻片；11.将已变性探针5μl加在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周压紧，再用透明胶包扎密封玻片，放入湿盒中于37℃杂交过夜；二、杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号12.洗脱：小心揭去透明胶和蜡膜，玻片依次于洗脱液I(WS-I)中45℃洗3次×2min，洗脱液II(WS-II)中25℃洗3次×2min,洗脱液III(WS-III)中25℃洗1次×2min，酒精梯度脱水风干玻片；13.结果观察：加5μl DAPI（0.5mg/ml）复染，盖上盖玻片，20min后用荧光显微镜观察信号，照像并计数。
FISH操作步骤
FISH 荧光原位杂交基本的实验方法。
（mRNA 和基因组DNA）基因组DNA 荧光探针染色步骤1、细胞爬片/涂片/冰冻切片的复水0.1mol 枸橼酸缓冲液浸泡冰冻切片室温10 分钟使组织细胞恢复水性。
2、置打孔液中室温10 分钟，给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜。
0.1M PBS 冲洗三次。
3、50% 去离子甲酰胺60度 1 小时2XssC洗一次2N 盐酸30 分钟室温PBS 洗2 次后，95度水浴加热15 分钟（置0.1molPBS 中防止组织细胞干涸）后，迅速置于冰育防止DNA复性减低杂交信号。
0.1M PBS 冲洗三次。
4、滴加复合消化工作液，覆盖组织表面，室温10-30 分钟。
（根据实验组织和实验的条件情况确定消化时间和温度，需实验者摸索最佳条件。
如条件成熟有利于杂交的顺利完成，具体原理参照“组织细胞的通透性”和“复合消化液的配制”一章。
0.1M PBS 冲洗三次。
0.2Xssc 洗一次（室温3 分钟）。
5、滴加预杂交工作液覆盖组织42 度湿盒孵育4-8 小时,注意盖上原位杂交专用盖玻片（预杂交工作液反应时间，需实验者摸索最佳条件，如条件成熟有利于杂交后的背景降低。
如预杂交工作液反应时间过长反而影响杂交信号。
具体原理参照“预杂交原理”一章。
6、预杂交后的洗涤——揭去盖玻片以0.2Xssc 室温洗三次，每次洗涤5 分钟。
7、滴加杂交工作液覆盖组织42 度湿盒孵育8-12 小时。
注意：探针浓度和时间需实验者摸索最佳条件，具体原理参照“探针浓度和杂交时间”一章。
8、杂交后的洗涤——揭去盖玻片以2Xssc 37 度洗三次，每次洗涤5 分钟，0.2Xssc 37 度洗三次，每次洗涤5 分钟，0.1 mol TBS 37 度洗3-5 次每次洗涤5 分钟。
9、荧光显色- --甘油封片荧光显微镜下以激发光488-492nm 时观察到黄绿色荧光。
如荧光强度或背景太亮时，可以用0.1mol PBS 多洗若干次。
荧光原位杂交FISH操作规程
荧光原位杂交FISH操作规程
一、主要试剂
1变性液20SSC 4ml ddH 2O 8ml甲酰胺28ml
2PBD液 1000ml 20SSC中加入1.25gTween20
二、操作流程
1硅化玻片切片烤片60过夜
2脱蜡入水斜置切片空干
32SSC洗涤三次每次5min下简写为35
4 0.2M HCl处理室温10接步骤3
5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3
6切片入20梯度酒精脱水各2空干
7切片入85变性液8
8迅速入20梯度酒精脱水各2空干
9杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片
37过夜
10反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
112SSC洗涤405min2SSC洗涤375min
12PBD洗涤切片32
13滴加异硫氢酸荧光素标记的亲和素Avidin FITC,塑膜封
片3730min
14洗涤同步骤12
15滴加抗亲和素Anti Avidin, 3730min
16) 重复步骤121312
17滴加DAP/I(二脒基二苯基吲哚/碘化丙啶)直接封片荧光
镜检
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FISH技术全攻略
FISH技术全攻略FISH技术，即荧光原位杂交技术，是一种常用于细胞和组织中DNA 和RNA分子的定位和检测的方法。
它利用荧光标记的探针与待测物（DNA 或RNA）特异性结合，并通过显微镜观察荧光信号的强弱、位置等特征，从而实现对目标分子的检测和定位。
下面是FISH技术的全攻略。
一、实验准备1.准备标记探针所需的DNA或RNA杂交模板。
2.选择适合的荧光标记物，如荧光素或荧光染料。
根据待测物的特异性，选择合适的探针序列。
3.选择适当的杂交缓冲液和嵌合反应缓冲液。
4.准备样本制备所需的试剂和器材，如细胞培养液、组织切片等。
二、标记探针1.获得待测物的DNA或RNA序列，并设计与之特异性结合的引物。
2.利用引物将待测物扩增，并进行纯化。
3.利用PCR或反转录-PCR等方法将引物和合适的荧光标记物连接起来，形成标记探针。
4.对标记探针进行纯化和定量，确保其纯度和浓度适当。
三、样本制备1. 细胞样本制备：将待检测的细胞培养在无菌条件下，收集并进行固定处理，如用甲醛溶液固定细胞，并进行膜通透处理，如用0.1% Triton X-100等溶液处理。
2.组织样本制备：将待检测的组织收集起来，并进行固定处理和脱水处理，如用乙醚和乙醇等溶液处理。
四、杂交反应1.准备杂交缓冲液：根据具体要求配制适当的杂交缓冲液，如SSC缓冲液（含盐和柠檬酸），并加入适量含有探针的杂交模板。
2.加热探针和杂交目标：将探针和待测物的杂交模板一起加热处理，使其变性。
3.杂交：将变性后的标记探针与杂交模板进行杂交，使其重新结合。
4.温度控制：根据具体情况选择合适的杂交温度和时间，并进行合适的温度控制。
五、信号检测与图像分析1.温度冲洗：在特定的温度和缓冲液条件下进行冲洗，去除未结合的探针和杂交模板。
2.荧光显微镜观察：将样本放在显微镜下，观察和记录荧光信号的强度和位置。
3.图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜下观察到的图像进行处理和分析，如测量信号的强度和位置。
荧光原位杂交(FISH)操作方法
荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
荧光原位杂交
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。
下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。
非生物学专业的同学请不要往下看了。
1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。
3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
荧光原位杂交 FISH 操作方法
荧光原位杂交（FISH）1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液；（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。
2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟；（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。
3.透化与脱水（约1h）现配proteinase k buffer：50mL1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL5M NaCl1mL10%SDS 2.5mLdd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟；（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。
（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。
4.杂交（约2h）（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱中，杂交1.5小时；（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。
fish原位杂交操作流程
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细胞荧光原位杂交检查
细胞荧光原位杂交检查
细胞荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是一种用于检测细胞内基因组序列的分子生物学技术。
它通过将特定的DNA或RNA探针与目标序列杂交，并用荧光素标记探针，然后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而确定目标序列的位置和数量。
FISH检查可用于研究细胞中基因组序列的改变，如染色体异常、基因扩增、基因缺失等。
它也可用于检测某些基因在特定组织或细胞类型中的表达情况。
下面是FISH检查的一般步骤：
1. 准备探针：根据需要，设计并制备特异性探针，通常为DNA或RNA探针。
2. 制备细胞样品：从组织或细胞培养物中制备样品，一般需要用胰蛋白酶消化、固定等步骤处理细胞。
3. 杂交：将探针与样品中的目标序列进行杂交，一般需要在一定温度和离子强度下进行。
4. 洗涤：去除未结合的探针，减少背景干扰。
5. 荧光素标记：用特定的荧光素标记探针，以便在荧光显微镜下观察。
6. 观察：用荧光显微镜观察杂交信号，并记录目标序列的数量和位置。
FISH检查的优点包括高特异性、高灵敏度、能够准确定位目标序列的位置。
然而，它也存在一些局限性，如需要昂贵的设备和试剂、需要训练有素的技术人员等。
FISH实验标准操作程序(FISH实验资料一)
FISH实验标准操作程序（成都新基因格实验室内部完整版）一实验目的通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：提高优生优育（产前诊断中的应用）、提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。
二实验原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况 三仪器设备及耗材（一） 仪器设备：①：全自动分子杂交仪②：荧光显微镜及分析软件③：恒温水浴箱3个以上（小型号）④：冰箱2台（提供试剂和标本存放，4摄氏度和-20摄氏度）⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）⑥：通风橱（配固定液，等操作）⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。
可离1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。
10：震荡混匀器11：计时器，温度计，温度湿度显示器。
12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。
（二）耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。
）大盖玻片（方形，用于镜检）小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）离心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管个人防护用品,标签纸等。
四实验样本及试剂样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。
试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075M Kcl、1M Hcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml 胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。
荧光原位杂交实验(FISH)
荧光原位杂交实验（FISH）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
1实验方法原理：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
羊水细胞荧光原位杂交(FISH)实验步骤
未培养羊水细胞荧光原位杂交（FISH）实验步骤一、羊水标本玻片制备1.Hanks胰酶消化：5-8ml未培养羊水标本离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入5ml水浴加热至37℃的Hanks胰酶溶液（0.25%），充分混匀，37℃水浴25min；2.低渗：离心（1000rpm×10min）去上清，向沉淀物中加入8ml水浴加热至37℃的低渗液（0.075M KCL），充分混匀，37℃水浴30min；3.预固定：迅速加入1ml新鲜配制的固定剂（甲醇∶冰乙酸=3∶1），并立即轻柔混匀细胞悬液，2500转/分钟离心10min，弃上清；4.固定：加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，固定30分钟以上或放置过夜，2800转/分钟离心10min弃上清，加入8ml新鲜配制的固定剂，轻柔吹散细胞，并混匀，2800转/分钟离心10 min弃上清，根据细胞多少加入0.2-0.5ml新鲜配制的固定剂，调至适宜浓度后滴片；5.滴片：将2-3滴细胞悬液滴加在用冰水预冷的干净载玻片上，并立即将玻片放入75℃的烤箱中，待表面干燥后取出编号；6.烤片：将玻片放入60℃烤箱中烘烤2 hr；7.Rnase A处理：标本玻片杂交区用40μl 0.1mg/ml RNAase A溶液（溶解于2×SSC）于37℃处理30-50min，再用2×SSC于室温洗2min，依次放入 70%，90%，100%的酒精中脱水各2min，室温晾干玻片。
8.胃蛋白酶消化：将玻片放入水浴加热至37℃的胃蛋白酶溶液（0.25%）中处理5min,立即取出玻片，在室温条件下，依次将玻片放入2×SSC、70%、90%、100酒精中各处理2分钟，气干玻片。
二、探针、玻片变性及杂交9.探针变性：按试剂说明书配制探针液，于75℃水浴变性5min；10.玻片变性：玻片于75℃变性液（70%甲酰胺/2×SSC）中变性5min，酒精梯度脱水迅速风干玻片；11.将已变性探针5μl加在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周压紧，再用透明胶包扎密封玻片，放入湿盒中于37℃杂交过夜；二、杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号12.洗脱：小心揭去透明胶和蜡膜，玻片依次于洗脱液I(WS-I)中45℃洗3次×2min，洗脱液II(WS-II)中25℃洗3次×2min,洗脱液III(WS-III)中25℃洗1次×2min，酒精梯度脱水风干玻片；13.结果观察：加5μl DAPI（0.5mg/ml）复染，盖上盖玻片，20min后用荧光显微镜观察信号，照像并计数。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。
脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。
2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。
稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。
用PBS冲洗。
再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。
5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。
6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。
7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。
（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。
8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。
9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。
10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。
荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术，其基本原理是依据碱基互补原理，应用荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化，进行定性和相对定量的分析检测。
FISH的实验流程主要包括以下步骤：
1. 探针标记：将荧光素直接或间接标记到探针DNA上。
2. 变性：将探针DNA和染色体或细胞核靶DNA分别变性成单链。
3. 杂交：将变性后的探针DNA与变性后的染色体或细胞核靶DNA按照碱基互补的原则进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸。
4. 观察记录：在荧光显微镜下观察并记录结果。
荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
fish实验室基本原理
fish实验室基本原理
FISH（荧光原位杂交）实验室是一种分子生物学技术，它用
于在细胞或组织样本中检测和定位特定的DNA或RNA序列。
FISH实验室的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 标记探针：FISH实验中使用的探针是一种DNA或RNA序列，经过标记后可以与目标序列特异性结合。
探针通常被标记上荧光染料，以便在显微镜下观察和定位。
2. 去除样本细胞核：FISH实验通常从组织样本或培养细胞中
提取细胞核。
这一步骤可以使用细胞裂解液或其他方法来破坏细胞膜，并释放出细胞核。
3. 杂交：将标记的探针添加到细胞核中，使其与目标序列结合。
在杂交过程中，探针与目标序列的互补碱基进行特异性配对，形成探针-目标DNA或RNA的杂交复合物。
4. 洗涤：将未与目标序列结合的探针和其他非特异性结合的物质洗掉。
通过洗涤的过程，只有与目标序列结合的探针能够留在样本中。
5. 显微镜观察：在荧光显微镜下观察样本。
荧光染料的激发和发射光谱特性使得可以检测到标记的探针，并确定目标序列的位置和存在情况。
FISH实验室是一种高分辨率的细胞遗传学技术，可以用于研
究细胞基因组结构、染色体重排、染色体异常等。
它在研究遗传疾病、癌症等领域具有广泛的应用。
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法
FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160℃以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。
-----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解----0．2M (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。
2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB ，加蒸馏水至1000ml，混匀------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。
3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50℃，------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60℃-------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。
-------1/3体积的PBS溶液，-------用Hcl将pH调至7.2，定容，-------用孔径为0.22μm的滤膜过滤，----4℃保存最多保存两天，或者取少量保存在-20℃。
（加热时温度不宜过高，为60℃-65℃，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。
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荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：
1）玻片处理
（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温
过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称
量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进
行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC
水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase
和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：
（a）缓冲溶液
1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，
溶入1000mL超纯水；
3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，
溶入1000mL超纯水；
通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获
得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
称取2gPFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
然后向其中加入16.5ml 3×PBS缓冲液，在冰浴中
充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。
向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。
用0.45微米的膜过滤后使用。
（室温或4℃保存备用）。
注意：
1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），
因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺
激作用；
2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；
3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应
尽早使用。
4、PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保
持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。
样品固定时间在
2～3小时，RNA含量较为恒定。
过度延长固定时间会引起细胞内生
物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。
（d）DAPI溶液
用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL
H2O）。
（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。
取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10～50 µM的DAPI溶液。
3）取样及保存方法
（a）反应器沉淀前取样2～5mL至离心管。
（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。
（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h。
（d）样品离心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1×PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min，去上清夜（重复3次）。
（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。
4）样品固定：
稀释样品3～5倍，对样品进行超声处理（3W超声2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数。
然后取3μL样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h （或者在空气中干燥2h或者过夜）。
依次用50%、80%、98%（质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。
5）样品杂交
试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB），其组分如表1-1和表1-2。
表1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）
5%10%20%30%35%40% 0.05%SDS（μL） 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
50mM Tri-HCl (μL）242424242424
5mol NaCl（mL） 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32
甲酰胺（mL） 1.2 2.4 4.87.28.49.6
蒸馏水（mL）18.454817.254814.854812.454811.254810.0548
NIT3探针Nsm156Ntcoc206Ntspn693Nsv443Ntspa662
NS01225Nmv
表1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）
组分体积
0.05%SDS（μL）0.6μL
50mM Tri-HCl （μL）12μL
5mol NaCl（mL） 2.16 mL
蒸馏水（mL）42.8274 mL
（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。
（b）吸取10μL探针贮存液和80μL杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL，用无菌水稀释购买的
探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。
表1-3用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件
探针序列(5’~3’)标记细菌种属浓度a
35 NSO1225CGCCATTGTATTACGTGTGA Ammonia oxidizing
beta-proteobacteria
30
Nsv443CCGTGACCGTTTCGTTCCG Nitroso-spira，-lobus，
-vibrio
Nmv TCCTCAGAGACTACGCGG Nitroso-coccus35 Ntspa662GGAATTCCGCGCTCCTCT Nitrospira35
NIT3CCTGGCTCCATGCTCCG Nirtrobacter40 Ntcoc206CGGTGCGAGCTTGCAAGC Nitrococcus mobilis10 Ntspn693TTCCCAATATCAACGCATT Nitrospina gracilis20
注：
（a）表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（b）吸取9μL预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2～3h；（c）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。
杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
DAPI染色
每孔滴9uLDAPI，4℃暗处5min，4℃冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。
用带有360 nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
DAPI （4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。
封片
涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集20个不同区域。
每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。
细菌丰度或细菌数目（cells/g或cells/L）为AS1/(S2V)，其中A为视野中细菌平均数；S1为样品涂抹面积；S2为视野涂抹面积；V为样品体积。