十种中草药提取物用作新型多功能天然植物饲料添加剂初探

十种中草药提取物用作新型多功能天然植物饲料添加剂初探

作者：张馨如黄琰杨蕾吴利明朱继栋汪秀

来源：《南方农业·下旬》2015年第03期

摘要目的：研制新型多功能天然植物饲料添加剂。方法：选取10种中草药，获得乙醇提取物后进行饲料防霉，抗氧化和减轻黄曲霉毒素损伤的活性检测，最后综合实验结果，确定在三方面相对功能佳的中草药。结果：公丁香（Syzygium aromaticum）在这三方面的效果最佳，其抑制饲料发霉菌的最小抑菌浓度（MIC值）为20 mg/mL，抑菌率为60%。公丁香的综合抗氧化能力得分最高为7.77分。公丁香提取物（30 μg/mL）预处理人肝细胞HL-7702细胞后显著减轻了黄曲霉素AFB1（21μg/mL）对细胞的损伤（P

关键词中草药提取物；饲料；防霉；抗氧化；黄曲霉素；公丁香

中图分类号：S816.7 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）09-001-03

饲料的安全性能是食品安全的重要组成部分，保障饲料安全既是构筑坚实食物安全链的重要一步，也是我们落实十八大和“两会”精神，切实保障食品安全和人民健康的一个有力的落脚点。本文立足于天然植物饲料添加剂，针对当前广泛使用的传统的合成药物、抗生素等药用添加剂存在的安全性低、残留高、产生耐药性等问题的现状，对选取的公丁香等10种中草药提取物的抗霉菌、抗氧化和减轻黄曲霉素对人肝细胞损伤的活性做了系统的研究，旨在为新型多功能天然植物饲料添加剂的开发提供启示。

1 材料与方法

1.1 仪器

电热恒温水浴锅（DK-524；上海精宏），旋转蒸发仪（RE-52AA；上海亚荣），生化培养箱（SHP-150型），二氧化碳培养箱（MCO-20AIC），酶标仪（BIO-RAD680），恒温培养箱，可见分光光度计（722S），卧式落地培养摇床（TS-21113）。

1.2 试剂

小猪饲料（玉米-豆粕型）购于九鼎集团，货号my0158。人正常肝细胞系HL-7702。DPPH、DMSO、维生素C、硫酸亚铁晶体、水杨酸、邻苯三酚、山梨酸钾、高盐察氏培养基、MH肉汤培养基、RPMI-1640培养基、血清、胰酶和青链霉素。

1.3 方法

将选取的10种中草药粉碎成粉末，各称取200 g，用无水乙醇浸没，80 ℃冷凝回流三次得醇提物，滤液用旋转蒸发仪45 ℃，0.095 MPa抽提得到浸膏[1]。参考董妍玲[2]等的方法获得饲料发霉菌：小猪饲料自然发霉（湿度75%、温度28 ℃）9 d后，分离纯化发霉菌。

1.3.2 防霉活性检测

1.3.

2.1 纸片扩散法测抑菌圈

参考文献[3]、[4]的方法：DMSO滤纸片做空白对照，0.3 g/mL山梨酸钾做阳性对照，10种中草药提取物0.3 g/mL用量10μL，霉菌培养箱28 ℃培养3 d，测量抑菌圈直径。

1.3.

2.2 中草药最小抑菌浓度MIC值的测定

参考文献[5]、[6]的方法：采用MH肉汤培养，96孔中1孔为空白对照组：200 μL MH肉汤培养基；2孔为正常生长对照组：150 μL 106 cell/mL菌液和50 μL MH肉汤培养基；3孔为150μL 106 cell/mL菌液和50 mL DMSO；其他孔为样品组：150 μL 106 cell/mL菌液和50 μL不同浓度的样品溶液。28 ℃培养箱培养20 h后，进行涂布。

1.3.

2.3 饲料防霉效果评价

小猪饲料预混中草药提取物，自然发霉16 d后检测霉菌数量（方法按GBl3092-91《饲料中霉菌检测方法》），计算提取物抑菌率：提取物的抑菌率（%） =（对照样品的霉菌含量-试验样品的霉菌含量）/对照样品的霉菌含量×100%。

1.3.3 抗氧化活性检测

将10种中草药提取物分别进行DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力的测定，方法分别按参考文献[7]、[8]和[9]的方法进行，再综合3方面结果，参考陈永钧等[9]的方法做抗氧化能力综合评价。

1.3.4 霉菌毒素（AFB1）减毒实验

HL-7702细胞常规培养，设计如下。（1）对照组：加入含1%DMSO的1640培养液；（2）AFB1组（求AFB1的IC50值）：分别加入含60、50、40、30、20、10、5 μg/mLAFB1的1640培养液，每一浓度设3个复孔，48小时后，MTT检测细胞存活率[10]。（3）AFB1+中草药组：加入不同浓度的中草药提取物，每一浓度设3个复孔，48 h后加入AFB1的IC50浓度，再48 h后MTT法检测，计算细胞存活率。

2 结果与分析

依据饲料添加剂相关国标，结合传统中医药理论和相关研究报道，有针对性的选取10种中草药：山苍子、厚朴、公丁香、炒苍术、姜黄；积雪草、牛蒡子、金荞麦、升麻、淡豆豉。饲料发霉后分离纯化的霉菌：黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、雪白曲霉（Aspergillus niveus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、橘青霉（Penicillium citrinum）。

3.2 防霉活性检测结果

3.2.1 纸片抑菌圈

阳性对照山梨酸钾抑菌圈直径在12 mm；空白溶媒对照DMSO几乎没有抑菌圈出现；实验组里公丁香抑菌圈为14 mm，具强抗菌活性；厚朴次之，抑菌圈12 mm；姜黄（6 mm）、山苍子（5 mm）抗菌效果较弱；其余中草药的抑菌效果近于无。因此下面实验中只选取有抑菌效果的4种中草药进行。

3.2.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定

阳性对照山梨酸钾的MIC值是70 mg/mL，公丁香、厚朴、姜黄、山苍子的MIC值分别是20、30、63、65 mg/mL。因此，这4种有抑菌效果的中草药提取物的抗霉菌能力大小为：公丁香>厚朴>姜黄>山苍子。

3.2.3 饲料防霉效果评价

将有抑菌效果的4种中草药与饲料预混后，公丁香抑制饲料发霉效果最好，抑菌率为60%，厚朴52%、姜黄12%、山苍子14%。

3.3 抗氧化活性检测结果

将3大体系的数据结果进行处理，总分值越大体外抗氧化活性越好。由表1可见，公丁香是综合抗氧化能力最强的中草药。

3.4 公丁香提取物对肝细胞AFB1损伤的减轻作用

MTT法测得AFB1对HL-7702细胞的IC50浓度为21 μg/mL。加入公丁香提取物预处理HL-7702细胞后再加入（21 μg/mL）AFB1，规定细胞存活率大于70%为有损伤减轻作用。结果显示，预处理公丁香提取物终浓度30μg/mL时细胞存活率达到81.74%（大于70%），P

4 结论