常见微生物数量测定方法比较(共12张PPT)

总结与比较
血细胞计数板和细菌计数板常用于测定单细胞或孢子, 相对比较准确;
膜过滤用于测定细胞浓度很低的样品,平板菌落计数对 多数微生物的测定都适用, 但是相对其他计数法要复杂;
比浊法相对准确,但需要作标准曲线; 对于丝状微生物的数量测定,国际上有明确的标准; 而凯氏定氮法和DNA 含量测定法都是通过对微生物细 胞内含量相对稳定的物质进行定量测定, 再算出细胞的数 量,操作相对复杂.
2.活细胞计数法
2.3 霉菌计数法
对于霉菌的计数一般比较困难,由于霉菌生长快, 菌丝叠加导致无法准确计数.国标霉菌计数法的原 理是:将待测菌液进行10 倍梯度系列稀释,利用高 盐察氏培养基(CAO)与待测菌液混匀后倒平板,25 一28℃下培养3d 后开始计数,选择菌落数在10150 之间的平板进行计数,取同稀释度的两个平板 的菌落平均数乘以稀释倍数,即为每g(或 mL)检样 中所含霉菌数。
常见微生物数量测定方法比较
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微生物主要包括原核微生物,真核微生物,病毒等 三大 类,由于多数微生物的个体较小,肉眼无法观察, 对其计数 一般比较困难.在目前的微生物实验教学 中,对微生物计 数的方法主要有三大类:总细胞计数法,活细胞计数法和 微生物生长量测定法.并不是每种方法都是通用的,不同 的微生物种类需要不同的计数方法,目前多用以下8 种方 法进行计数:
1.总细胞计数法
1.3 膜过滤计数法
利用计数板对高浓度的菌液测定比较准确,但当样品中细菌 的数量很低时,如湖水, 海水或饮用水等,用膜过滤计数法更精 确些,可以将一定体积样品溶液加结晶紫染色,再用0.22mm的 聚偏二氟乙烯膜负压过滤,再用无菌水冲洗至无色后,将过滤的 膜进行抽干,将膜放到载玻片上,滴加甘油,盖上盖玻片,即可在 显微镜下计数.一般随机抽取20个视野进行计数,最后算平均数, 计算整个滤膜上的菌的数量,得到原菌液中的微生物数量. 此测 定方法一般只能用于样品中细菌数量很低的。
1.总细胞计数法
2.活细胞计数法
3.微生物生长量测定法
1.总细胞计数法
1.1 血细胞计数板计数法
血细胞计数板是一块特制的载玻片,其上划有计数室, 通过对计数室中的微生物数量的读取,计算原溶液中的微 生物数量.此方法由于计数板较厚,且计数室的高度是 0.1mm,不能采用油镜进行观察,故只能对体积较大的真 核微生物进行测定,如酵母菌,霉菌孢子等,只能测得所有 细胞的总数,不能区别死细胞和活细胞,尤其是对运动能 力强的活细胞难以计数.
目前已经提出一些方法,如结合特定的美蓝染色技术, 区别酵母菌死活细胞;将运动的细胞加入甲醛溶液中,破 坏其运动以便计数等.
1.总细胞计数法
1.2 细菌计数板计数法
细菌计数板是在血细胞计数板的基础上改进而 来,主要是降低计数板的厚度,同时将计数室的高 度从0.1mm降低到0.02mm,以用油镜对较小的原 核微生物进行计数.
为了使菌落数更接近实际菌液中细菌的 数量值,目前 多数办法是:尽量扩大稀释倍数,涂布平板时少取稀释菌 液,使平板中的菌落数减少,避免由于菌液中细菌数过多 造成多个细菌形成一个菌落。
2.活细胞计数法
2.2 比浊法
微生物细胞在一定浓度范围内,与浊度成正比, 即与光密度成正比,菌越多,光密度越大.故可通过 分光光度计测定吸光值,通常测定600nm下的吸光 值OD600,通过与标准曲线对比,求出样品中菌液 浓度,计算出细胞的数量。 实验测定时容易出现 误差,必须控制菌浓度在与光密度成正比的线性范 围内,否则不准确。
谢谢
3.微生物生长量测定法
3.1 凯氏定氮计数法
蛋白质是微生物细胞的主要成分,含量较稳定,可以通 过测定样品中含量稳定的蛋白质的量计算细菌的数量,将 细胞洗涤收集,用凯氏定氮法测全氮,蛋白质含氮量为 16%,细菌中蛋白质含量因种类的不同而有差别,平均值 为65%,微生物细胞内的蛋白质总含量可以计算出待测样 品中细胞的总质量,最后根据单个细胞的质量计算出样品 的细胞数量。
总含氮量与蛋白质之间的关系为:蛋白质总量= 含氮量 除以16%,那么,微生物细胞总质量=蛋白质总量 除以 65%,微生物细胞总数=细胞总质量除以单个细胞所含蛋 白质的质量,单个细胞的蛋白质质量都有差别,所以用此 方法测定的结果误差较大,只能作为参考。
3.微生物生长量测定法
3.2 DNA含量测定法
相比凯氏定氮计数法有较大误差,DNA 含量测 定法相对较准确。每个微生物细胞的 DNA 含量 非常恒定,平均为8.4-10 ng,将一定体积的细菌悬 液离心,从细菌细胞中提取DNA,得其重量, 则可计 算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数. 每 一种微生物细胞的蛋白质含量不同。
多数时候细菌个体由于粘附成团而影响结果. 所以,过滤前 的细胞分散处理很重要,例如将细菌悬液经过酸碱或超声波处 理,将聚团的细胞打散,可以增加 此方法的准确性。
2.活细胞计数法
2.1 平板菌落计数法
平板菌落计数法只能用于测定活细胞的数量,但是操 作过程相对计数板而言复杂些,而且测得的细菌数量往往 小于实际值。主要原因是在计算细菌浓度时,往往每个菌 落并不一定是由个单细胞生长繁殖而来,有可能是2个或 多个,致使结果比实际菌液样品中的细菌数量低,这也就 是为什么现在都用菌落形成单位数(cfu/mL)来取代过去 的绝对细菌数量。