常见微生物数量测定方法比较(共12张PPT)
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高中生物同步课件：1.3 测定微生物的数量(中图版选修1)
30～300 培养皿内有__________个菌落为宜。霉菌以
10～100 每个培养皿内有__________个菌落为宜。
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第一章
微生物培养技术
②同一稀释倍数各个重复的菌落数相差不要 太悬殊。 ③计算每克样品菌数公式为：每克土壤样品 某稀释倍数的菌落平均数 菌数 ＝ ×稀释 细菌培养时所用的稀释液体积 倍数。
下观察的载玻片，样品就滴在计数室内。计 数室由25×16＝400个小室组成，容纳液体总
体积为0.1 mm3。某同学操作时将1 mL酵母
菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸 取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并 用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。
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第一章
微生物培养技术
Байду номын сангаас
(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是 这样的：①从静置试管中吸取酵母菌培养液
第一章
微生物培养技术
第3节 测定微生物的数量
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第一章
微生物培养技术
学习导航
1.概述微生物计数的基本方法。
2.运用稀释平板法测定样品中微生物的数量。 [重、难点]
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第一章
微生物培养技术
新知初探思维启动
一、直接计数法 1.常用方法：显微镜直接计数法。 2.具体步骤：将待测样品制成悬液→取一定 量的悬液放在显微镜下进行计数→观察并计 算出单位体积内的微生物总数。
第一章
微生物培养技术
【解析】
实验结论是否正确与是否设置对
照有直接关系，但实验结果与是否设计对照 无关。
【答案】
A
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第一章
微生物培养技术
变式训练 下列调查活动或实验中，计算所得数值与实
空气中微生物的检测(共24张PPT)
空气中微生物数量的检测
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果计算 五、结果评价
一、实验目的和意义
41μ个m同学一孔组径，0.分别采用自然沉降法和Anderson采样器，采样时间设为5min和10min，比较两种采样方法的结果。
掌握检测和计数空气中微生物的基本方法 室特内点空 ：气此质法量简标单准方便（，G但B/稳T1定88性83差-2，00直2）径1～5μm的粒子在5min中内沉降距离有限，使小粒子采集率较低。
由An6d个er带so有n采微样细器针（孔F的A-金1型属）撞击盘构成，盘下放置有培养基的平皿，每个圆盘上有400个环形排列小孔，由上到下孔径逐渐减小。
空图气书中 馆微、生阅物览数室量的的空检气测卫生标准：空气细菌总数≤2500cfu/m3（撞击式），或≤30个/皿（沉降式）
学习对室内空气进行初步的微生物学评价 根细据菌空 选气用中的携指有标微是生菌物落气总溶数胶，粒表子示在方地法心为引cfu力/皿的或作者用c下fu/，m以3 垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上，经过24h，37℃温箱培养计算出菌落
各采级集撞 粒击谱盘范捕围获广粒，子一范般围在及0. 孔径大小 日5m光,采，样波时长关为闭25门4窗纳，米减的少紫人外员线走光动具有杀菌作用
气学流习， 对不室仅内可空以气把进室行外初的步细的菌微带生入物室学内评，价也会将地面、墙壁的含菌粒子扬起。
特将点平： 皿此依法次简放单入方圆便盘，但固稳定定并性做差好，标直记径1～5μm的粒子在5min中内沉降距离有限，使小粒子采集率较低。
各沉种降粒 法径测大定小的的菌菌落落总易数沉要降多的，部在位实及验意条义件下比撞击法多24. 沉特降点法 ：测此定法的简菌单落方总便数，要但多稳，定在性实差验，条直件径下1～比5撞μm击的法粒多子2在4. 5min中内沉降距离有限，使小粒子采集率较低。
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果计算 五、结果评价
一、实验目的和意义
41μ个m同学一孔组径，0.分别采用自然沉降法和Anderson采样器，采样时间设为5min和10min，比较两种采样方法的结果。
掌握检测和计数空气中微生物的基本方法 室特内点空 ：气此质法量简标单准方便（，G但B/稳T1定88性83差-2，00直2）径1～5μm的粒子在5min中内沉降距离有限，使小粒子采集率较低。
由An6d个er带so有n采微样细器针（孔F的A-金1型属）撞击盘构成，盘下放置有培养基的平皿，每个圆盘上有400个环形排列小孔，由上到下孔径逐渐减小。
空图气书中 馆微、生阅物览数室量的的空检气测卫生标准：空气细菌总数≤2500cfu/m3（撞击式），或≤30个/皿（沉降式）
学习对室内空气进行初步的微生物学评价 根细据菌空 选气用中的携指有标微是生菌物落气总溶数胶，粒表子示在方地法心为引cfu力/皿的或作者用c下fu/，m以3 垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上，经过24h，37℃温箱培养计算出菌落
各采级集撞 粒击谱盘范捕围获广粒，子一范般围在及0. 孔径大小 日5m光,采，样波时长关为闭25门4窗纳，米减的少紫人外员线走光动具有杀菌作用
气学流习， 对不室仅内可空以气把进室行外初的步细的菌微带生入物室学内评，价也会将地面、墙壁的含菌粒子扬起。
特将点平： 皿此依法次简放单入方圆便盘，但固稳定定并性做差好，标直记径1～5μm的粒子在5min中内沉降距离有限，使小粒子采集率较低。
各沉种降粒 法径测大定小的的菌菌落落总易数沉要降多的，部在位实及验意条义件下比撞击法多24. 沉特降点法 ：测此定法的简菌单落方总便数，要但多稳，定在性实差验，条直件径下1～比5撞μm击的法粒多子2在4. 5min中内沉降距离有限，使小粒子采集率较低。
最新食品中细菌菌落总数的测定-PPT文档
同时分别取1ml稀释液（不含样品） 加入两个灭菌平皿内作空白对照。
5 、稀释液移入平皿后，将冷却至 46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml， 并转动平皿，混合均匀。
6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置 36±1℃温箱内培养48±2h，水产品 30±1℃温箱内培养72±3h。
如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥 漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面 覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固 后培养。
7、为使菌落能在平板上均匀分布， 检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并 旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样 从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时 间不宜超过20min，以防止细菌有所死 亡或繁殖。
8、培养温度一般为37℃（水产品的 培养温度，由于其生活环境水温较低， 故多采用30℃）。培养时间一般为48h， 有些方法只要求24h的培养即可计数。 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培 养48h后，培养基失重不应超过15％。
2、采样的代表性
如系固体样品，取样时不应集中一 点，宜多采几个部位。固体样品必须经 过均质或研磨，液体样品须经过振摇， 以获得均匀稀释液。
3、稀释液
样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或 磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后 者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保 护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油） 进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
细菌菌落总数cfu/ml： ≤20 大肠菌群MPN/100ml： ≤3 致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出 霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出
时 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 7、 计算菌落总数 → 报告
五、 步骤
(一) 取样、稀释和培养
1、 以无菌操作取检样25g（mL），放于 225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻 璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内 ，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。
5 、稀释液移入平皿后，将冷却至 46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml， 并转动平皿，混合均匀。
6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置 36±1℃温箱内培养48±2h，水产品 30±1℃温箱内培养72±3h。
如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥 漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面 覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固 后培养。
7、为使菌落能在平板上均匀分布， 检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并 旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样 从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时 间不宜超过20min，以防止细菌有所死 亡或繁殖。
8、培养温度一般为37℃（水产品的 培养温度，由于其生活环境水温较低， 故多采用30℃）。培养时间一般为48h， 有些方法只要求24h的培养即可计数。 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培 养48h后，培养基失重不应超过15％。
2、采样的代表性
如系固体样品，取样时不应集中一 点，宜多采几个部位。固体样品必须经 过均质或研磨，液体样品须经过振摇， 以获得均匀稀释液。
3、稀释液
样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或 磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后 者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保 护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油） 进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
细菌菌落总数cfu/ml： ≤20 大肠菌群MPN/100ml： ≤3 致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出 霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出
时 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 7、 计算菌落总数 → 报告
五、 步骤
(一) 取样、稀释和培养
1、 以无菌操作取检样25g（mL），放于 225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻 璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内 ，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。
微生物检验(PPT)
第一页，共十六页。
第二页，共十六页。
第三页，共十六页。
细胞(xìbāo)数量的测定方法----七种方 法
测定微生物生长的方法很多，各种方法均有 其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在 微生物学(wēi shēnɡ wù xué)工作中一般常用的是平皿 菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种 方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等 各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计 数法
第十页，共十六页。
4、比浊法
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细 菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与 透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用 光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样 品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能(zhī nénɡ)检测含有大量 细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色 太深的样品，不能用此法测定。
第四页，共十六胞计数器进行计数。取一定体积的样 品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内， 用显微镜观察计数。由于(yóuyú)计数室的容积是 一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的 细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便 易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母 菌及霉菌孢子计数
第十二页，共十六页。
6、测定(cèdìng)细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分，含量较 稳定，测定(cèdìng)氮、碳的含量可以推知细 胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样 品。
第十三页，共十六页。
7、颜色(yánsè)改变单位法〔colour change unit,简称CCU〕
这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法 计数的微生物，比方支原体等，因为支原体 的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透 明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支 原体固体(gùtǐ)培养很困难，用cfu法也不容易计 数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。 它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标， 来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲 原体为例，简单介绍其操作：
第二页，共十六页。
第三页，共十六页。
细胞(xìbāo)数量的测定方法----七种方 法
测定微生物生长的方法很多，各种方法均有 其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在 微生物学(wēi shēnɡ wù xué)工作中一般常用的是平皿 菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种 方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等 各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计 数法
第十页，共十六页。
4、比浊法
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细 菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与 透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用 光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样 品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能(zhī nénɡ)检测含有大量 细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色 太深的样品，不能用此法测定。
第四页，共十六胞计数器进行计数。取一定体积的样 品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内， 用显微镜观察计数。由于(yóuyú)计数室的容积是 一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的 细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便 易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母 菌及霉菌孢子计数
第十二页，共十六页。
6、测定(cèdìng)细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分，含量较 稳定，测定(cèdìng)氮、碳的含量可以推知细 胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样 品。
第十三页，共十六页。
7、颜色(yánsè)改变单位法〔colour change unit,简称CCU〕
这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法 计数的微生物，比方支原体等，因为支原体 的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透 明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支 原体固体(gùtǐ)培养很困难，用cfu法也不容易计 数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。 它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标， 来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲 原体为例，简单介绍其操作：
微生物限度检验PPT课件
- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
13
稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
7
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
13
稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
7
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件
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总结与比较
血细胞计数板和细菌计数板常用于测定单细胞或孢子, 相对比较准确;
膜过滤用于测定细胞浓度很低的样品,平板菌落计数对 多数微生物的测定都适用, 但是相对其他计数法要复杂;
比浊法相对准确,但需要作标准曲线; 对于丝状微生物的数量测定,国际上有明确的标准; 而凯氏定氮法和DNA 含量测定法都是通过对微生物细 胞内含量相对稳定的物质进行定量测定, 再算出细胞的数 量,操作相对复杂.
2.活细胞计数法
2.3 霉菌计数法
对于霉菌的计数一般比较困难,由于霉菌生长快, 菌丝叠加导致无法准确计数.国标霉菌计数法的原 理是:将待测菌液进行10 倍梯度系列稀释,利用高 盐察氏培养基(CAO)与待测菌液混匀后倒平板,25 一28℃下培养3d 后开始计数,选择菌落数在10150 之间的平板进行计数,取同稀释度的两个平板 的菌落平均数乘以稀释倍数,即为每g(或 mL)检样 中所含霉菌数。
常见微生物数量测定方法比较
ห้องสมุดไป่ตู้
微生物主要包括原核微生物,真核微生物,病毒等 三大 类,由于多数微生物的个体较小,肉眼无法观察, 对其计数 一般比较困难.在目前的微生物实验教学 中,对微生物计 数的方法主要有三大类:总细胞计数法,活细胞计数法和 微生物生长量测定法.并不是每种方法都是通用的,不同 的微生物种类需要不同的计数方法,目前多用以下8 种方 法进行计数:
1.总细胞计数法
1.3 膜过滤计数法
利用计数板对高浓度的菌液测定比较准确,但当样品中细菌 的数量很低时,如湖水, 海水或饮用水等,用膜过滤计数法更精 确些,可以将一定体积样品溶液加结晶紫染色,再用0.22mm的 聚偏二氟乙烯膜负压过滤,再用无菌水冲洗至无色后,将过滤的 膜进行抽干,将膜放到载玻片上,滴加甘油,盖上盖玻片,即可在 显微镜下计数.一般随机抽取20个视野进行计数,最后算平均数, 计算整个滤膜上的菌的数量,得到原菌液中的微生物数量. 此测 定方法一般只能用于样品中细菌数量很低的。
1.总细胞计数法
2.活细胞计数法
3.微生物生长量测定法
1.总细胞计数法
1.1 血细胞计数板计数法
血细胞计数板是一块特制的载玻片,其上划有计数室, 通过对计数室中的微生物数量的读取,计算原溶液中的微 生物数量.此方法由于计数板较厚,且计数室的高度是 0.1mm,不能采用油镜进行观察,故只能对体积较大的真 核微生物进行测定,如酵母菌,霉菌孢子等,只能测得所有 细胞的总数,不能区别死细胞和活细胞,尤其是对运动能 力强的活细胞难以计数.
目前已经提出一些方法,如结合特定的美蓝染色技术, 区别酵母菌死活细胞;将运动的细胞加入甲醛溶液中,破 坏其运动以便计数等.
1.总细胞计数法
1.2 细菌计数板计数法
细菌计数板是在血细胞计数板的基础上改进而 来,主要是降低计数板的厚度,同时将计数室的高 度从0.1mm降低到0.02mm,以用油镜对较小的原 核微生物进行计数.
为了使菌落数更接近实际菌液中细菌的 数量值,目前 多数办法是:尽量扩大稀释倍数,涂布平板时少取稀释菌 液,使平板中的菌落数减少,避免由于菌液中细菌数过多 造成多个细菌形成一个菌落。
2.活细胞计数法
2.2 比浊法
微生物细胞在一定浓度范围内,与浊度成正比, 即与光密度成正比,菌越多,光密度越大.故可通过 分光光度计测定吸光值,通常测定600nm下的吸光 值OD600,通过与标准曲线对比,求出样品中菌液 浓度,计算出细胞的数量。 实验测定时容易出现 误差,必须控制菌浓度在与光密度成正比的线性范 围内,否则不准确。
谢谢
3.微生物生长量测定法
3.1 凯氏定氮计数法
蛋白质是微生物细胞的主要成分,含量较稳定,可以通 过测定样品中含量稳定的蛋白质的量计算细菌的数量,将 细胞洗涤收集,用凯氏定氮法测全氮,蛋白质含氮量为 16%,细菌中蛋白质含量因种类的不同而有差别,平均值 为65%,微生物细胞内的蛋白质总含量可以计算出待测样 品中细胞的总质量,最后根据单个细胞的质量计算出样品 的细胞数量。
总含氮量与蛋白质之间的关系为:蛋白质总量= 含氮量 除以16%,那么,微生物细胞总质量=蛋白质总量 除以 65%,微生物细胞总数=细胞总质量除以单个细胞所含蛋 白质的质量,单个细胞的蛋白质质量都有差别,所以用此 方法测定的结果误差较大,只能作为参考。
3.微生物生长量测定法
3.2 DNA含量测定法
相比凯氏定氮计数法有较大误差,DNA 含量测 定法相对较准确。每个微生物细胞的 DNA 含量 非常恒定,平均为8.4-10 ng,将一定体积的细菌悬 液离心,从细菌细胞中提取DNA,得其重量, 则可计 算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数. 每 一种微生物细胞的蛋白质含量不同。
多数时候细菌个体由于粘附成团而影响结果. 所以,过滤前 的细胞分散处理很重要,例如将细菌悬液经过酸碱或超声波处 理,将聚团的细胞打散,可以增加 此方法的准确性。
2.活细胞计数法
2.1 平板菌落计数法
平板菌落计数法只能用于测定活细胞的数量,但是操 作过程相对计数板而言复杂些,而且测得的细菌数量往往 小于实际值。主要原因是在计算细菌浓度时,往往每个菌 落并不一定是由个单细胞生长繁殖而来,有可能是2个或 多个,致使结果比实际菌液样品中的细菌数量低,这也就 是为什么现在都用菌落形成单位数(cfu/mL)来取代过去 的绝对细菌数量。