番茄细菌性斑点病病原鉴定

番茄细菌性斑点病病原鉴定

筛选出番茄生长期,在番茄种植区采集具有典型症状的病叶、病果来研究番茄细菌性斑点病病原鉴定。

标签：细菌性斑点病；病原鉴定；番茄

1 实验设备及仪器

喷雾器,电镜,恒温水浴锅,若干试管,超净工作台,载玻片,冰箱。

2 实验药品

金氏B培养基（KB）和牛肉膏蛋白胨培养基（NA）培养基,番茄,辣椒,茄子,马铃薯,磷钨酸（PTA）,1～1.5%二甲对苯,0.2%的可溶性淀粉,特罗姆斯陀夫试剂,涅斯勒试剂,3%氢氧化钾（KOH）等等.

3 实验思路

3.1 培养性状观察

供试菌株在KB培养基上培养48h后观察菌落形态、大小,并在紫外灯下观察是否有荧光产生。

3.2 病原细菌的形态观察

将供试菌株在27℃下培养16h,用磷钨酸（PTA）负染,然后在电镜GEM—1200EX下放大10000倍观察其菌体形态、鞭毛数目及其着生位置。

3.3 最适、最高生长温度测定

将菌株接于KB培养液中,于15～2℃温度范围内每隔2℃一个处理,在恒温水浴锅中通过观察其浑浊度测定最适生长温度,并于41℃、42℃测定其最高生长温度,以不接菌为对照。

3.4 耐盐性测定

在KB培养液中分别加入灭菌的NaCL溶液,使其盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8% 8个浓度,接菌后振荡培养,以相应盐浓度的不接菌KB培养液为对照。

3.5 葡萄糖氧化发酵测定

用Hayward培养基,每菌株针刺接菌6管,2管用凡士林封管,2管不用凡士林封管,2管为不接菌的对照,27℃培养7d,观察所接菌株是否生长和试管内培养基颜色的变化。

3.6 马铃薯软腐试验

将无病新鲜的马铃薯片经灭菌在凹槽内接种新鲜培养物,每个菌株2个重复,以无菌水为对照,24h后检查结果。

3.7 原细菌的生化性状

（1）氧化酶测定：用1～1.5%二甲对苯撑的水溶液滴湿滤纸,用灭菌牙签接菌苔于滤纸上观察反应,在5～10S内呈现玫瑰红到暗紫色是阳性反应,否则为阴性。

（2）接触酶测定：移一环新鲜培养的细菌放在洁净的载玻片上,加1滴3%过氧化氢,观察气泡产生的情况,有气泡产生是阳性,否则为阴性。

（3）淀粉水解：在NA培养基中加0.2%的可溶性淀粉。平板划线培养2～5d后在平板上加碘液。观察菌落周围培养基颜色的变化。

（4）明胶液化：在肉汁胨培养液（NA）中加10%的明胶,每管7毫升,115℃灭菌10min。明胶培养柱经穿刺接种后,放在27℃温度中培养,定期将试管取出,放在冷水中使明胶凝固,观察明胶是否分解而液化。

（5）硝酸盐和亚硝酸的还原将含有硝酸盐（KNO3）的培养液接种测定的细菌,培养3d后测定其中有无亚硝酸盐的产生,测定时,在白色瓷质试碟中加试剂（特罗姆斯陀夫试剂Trommsdorf）3滴和稀硫酸1滴,混合后加1滴培养液,呈现蓝色表示有亚硝酸根存在。

（6）革兰氏染色：用牙签挑取菌落放在载玻片上与3%氢氧化钾（KOH）液滴搅拌1～2min,然后慢慢地拉出看有无粘丝出现。革兰氏阴性菌的细胞壁易被碱液溶解,而拉出丝状物,革兰氏阳性菌则不被溶解而无丝状物出现。

（7）硫化氢的产生：将白色滤纸剪成小条,在饱和的醋酸铅溶液中浸过后在120℃的烘箱中灭菌1h。培养液接菌后,将纸条夹在塞子与试管壁之间,不要碰到培养液,观察纸条颜色的变化,如变黑表示有硫化氢的产生。

（8）吲哚的产生：小纸条在饱和草酸溶液中浸过后取出,等到完全干燥后,将纸条夹在培养10d的菌种的管壁与棉花塞之间,观察纸条颜色的变化,如有吲哚产生则滤纸呈淡红色。

（9）对碳源的利用：将经过115℃,10min灭菌的10%的D-木糖、葡萄糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、乳糖、麦芽糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、L-丝氨酸母液分

别加入无菌的Dye培养基中,使其糖的最终浓度为1%,27℃下放置3d后证明无杂菌后接种供试菌株,每个菌株接3管,对照为加入糖但不接菌的Dye培养基,一周后观察培养基颜色的变化。

4 结果与分析

（1）从表1可知,供试菌株的生理生化性状的试验结果与标准菌株一致。

表1 供试菌株的生理生化性状

注：+表示阳性反应, -表示阴性反应.

4.2 碳源利用

从表2可知,供试菌株与标准菌株的测试结果一致:各菌株能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、D-木糖、甘露醇、肌醇、D-山梨醇；不能利用纤维二糖、乳酸、乙酸、丙酸。

表2 供试菌株的碳源利用测定结果

注：+表示阳性反应, -表示阴性反应.

参考文献

［1］任欣正,植物病原细菌的分类和鉴定［M］. 北京：农业出版社,1994.

［2］吕丽英,番茄细菌斑点性的发生与防治［J］.现代农业,2010.