免疫荧光双重染色样品制备的最佳方法探讨
免疫组化4双重或多重标记
；
4. 保证试剂的清洁度与纯度 ( 双蒸水，亲和
免疫层析 ) ，注意增强组织片与载玻片的粘
合 度 ， 以 减 少 脱 片 机 率 ；
5. 封片剂选择应注意显色剂的溶解特性，
一般多采用水封片(10%缓冲甘油)，保存时
间不长，应及时观察记录。
反应。可视预实验结果来确定。
（三）双重及多重免疫金标记(电镜） 电镜下的双重免疫标记染色不是靠
颜色区分，而是靠标记物的不同电子密
度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，
有别于光镜下的双重免疫标记方法。
常用的方法多为双重免疫金标记 优点：高电子密度，分辨率高，抗原定 位精确，颗粒大小可人工控制，
标记试剂易制备。
缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大(背景)
金标抗体双重抗原标记常用间接法显 示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。 优点：敏感性提高，操作步骤减少
缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深。
可通过采用固相吸附或过量二抗封闭， 或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗 原结合部位（Fab段）灭活加以克服。
优点：方法敏感、特异 缺点： 需选用各自特定的激发滤光片分别观察或 二次曝光显影 样本不能长期保存 组织结构背景不清晰。
直接法---特异、快速
技术类型
间接法---敏感、多用
异种动物抗体---常混合应用，操 作步骤少，脱片率相对较低
抗体试剂
同种动物抗体---分别应用，操作步骤加
倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标记 交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲 醛蒸气处理
汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后，
以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；
(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来 水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/L pH7.2);
免疫荧光双标操作方法及注意事项之欧阳引擎创编
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在统一组织细胞标本上须要同时检测两种抗原时,需进行双重荧光染色.双重免疫荧光标识表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1)直接法双重免疫荧光标识表记标帜：将标识表记标帜有两种不合荧光素的抗体(如抗A和抗B)以恰当比例混杂,滴加在标本上孵育,然后洗去未联合的荧光抗体,在荧鲜明微镜下分离选择两种响应的激发滤片不雅察,即可对两种抗原进行定位和定量.直接法简即靠得住,但敏锐度较低.(2)间接法双重免疫荧光标识表记标帜：用未标识表记标帜的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞,洗去过剩的第一抗体后,再用两种不合的荧光素分离标识表记标帜的第二抗体孵育组织或细胞,洗去过剩的第二抗体,后在荧鲜明微镜下分离选择两种响应的激发滤片不雅察,从而对两种抗原进行定位和定量.运用此法应留意两种特异性第一抗体必须起源于不合种属,且荧光标识表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光双标技巧中操纵要点和留意事项一.免疫荧光技巧中标本制造的根本程序近似于酶免疫组化,不合点如下： 1.免疫荧光不须要运用双氧水处理,关闭和一抗孵育与其雷同. 2.免疫荧光的二抗运用不合荧光标识表记标帜的二抗孵育,孵育时光依据抗体的工作浓度肯定. 3.二抗孵育之后充分洗片后即可贴片.封片和不雅察. 4.免疫荧光在封片时常运用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1).前提允许,建议购置抗淬灭的封片液,使标本可以保管更久. 5.荧光抗体的孵育以及后续处理须要避光. 6.荧光抗体染色假阳性可能会多,须要分离设定阳性和阴性对比.二.留意事项 1.荧光染色后一般在1h内完成不雅察,或于4℃保管4h,时光过长,可能会使荧光提前阑珊. 2.每次实验均需设置以下三种对比： (1) 阳性对比：阳性血清+荧光标识表记标帜物; (2) 阴性对比：阴性血清+荧光标识表记标帜物; (3) 荧光标识表记标帜物对比：PBS+荧光标识表记标帜物.三.免疫荧光双标的经验之谈 1.拔取一抗时,请求起源于两种不合的动物,我用的是起源于家兔和大鼠的抗体,二抗则是不合荧光旌旗灯号标识表记标帜的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红). 2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度.孵育时光要自我探索,我感到一抗4℃孵育留宿比较好,布景比较清楚. 3.我的阳性对比采取的是阳性组织切片,阴性对比则分离是家兔和大鼠的IgG,荧光标识表记标帜物对比是PBS+荧光标识表记标帜物. 4.关闭血清是二抗起源动物的正常血清,我用的是10%正常donkey血清. 5.其余事项同免疫荧光单标操纵.免疫组化双重染色办法和步调在生物医学和临床研讨实践中,经常须要检测两种不合物资是否在统一样品中共存或统一种细胞中共存,是以消失了免疫组织化学双重染色.此办法有几种类型,包含免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法联合;统一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色,阳性部位摄影,再用酸处理使抗原抗体解离,继之,对第二种抗原染色.摄影);两种酶标抗体3又重染色(分离用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标识表记标帜第二抗体.用间接法分离显示A和B抗原,如两种一抗来自统一种属,常有重叠染色);不合种属起源的抗体双重染色.今朝,最经常运用的是最后一种办法.不合种属起源的抗体双重染色,两种抗体间无交又反响.特异性较高,即使细胞内抗原量很少也能检测.但是,当两种抗原消失于统一部位而个中之一浓度较高,占绝对优势时将妨害另一种抗原染色,此种情形应分离染色,起首染色含量较少的抗原,再显示含量丰硕的抗原.在该办法中运用最多的是把SABC法或SP法的实验流程反复两次,个中两种不合特异性抗体(可所以小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合),与一抗对应的不合种属生物素化二抗和两种不合显色体系.即可将不合部位或雷同部位的两种抗原显示出来.该办法用于白腊切片时应斟酌所选择的两个抗体的修复办法应当一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色成果没有影响.SP法双重染色步调1～6步调与SABC法雷同,但无需运用生物素阻断剂：7.切片参加A特异性抗体(如兔抗A抗体),4=C留宿孵育后,PBS冲洗3次,每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗),室温孵育切片10分钟,继而PBS冲洗3次,每次5分钟;9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶,室温孵育10分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次,每次5分钟;11.滴加0.05%盐酸,室温10分钟(可防止已显色的抗原褪色);12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清,37~C孵育10分钟;13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体),4~C留宿孵育.PBS冲洗3次,每次5分钟;14.滴加生物素化抗小鼠二抗,室温孵育切片10分钟.PBS冲洗3次,每次5分钟：15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶,室温孵育10分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次,每次5分钟17.苏木精复染细胞核;18.水溶性封片剂封片. 在运用SP法双重染色之前须要看待测抗原的性质.二抗的种属类型和显色体系进行具体设计.购置免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计计划雷同的配套试剂.在选择一抗时应防止定位在细胞的统一部位(如胞核.胞浆和胞膜)的两种抗原,假如不成防止,最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色办法,因为两种不合色彩的荧光重叠后呈现另一种色彩的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光),它比SP 法的显色体系更轻易差别和辨认阳性成果. 在进行双重染色之前,必须对所选择的一抗分离进行单独染色预实验,预实验前提必须与双染前提雷同,在不雅察预实验成果和抗体定位准确后,再进行双染实验.。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?（TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。
8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。
免疫荧光细胞化学双重染色法
免疫荧光细胞化学双重染色法
原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白―{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)
1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。
2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。
在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。
例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG 和生物素化―抗兔IgG。
进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。
孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。
其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。
此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。
换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。
若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
之袁州冬雪创作在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需停止双重荧光染色.双重免疫荧光标识表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1)直接法双重免疫荧光标识表记标帜：将标识表记标帜有两种分歧荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未连系的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原停止定位和定量.直接法简即靠得住，但活络度较低.(2)间接法双重免疫荧光标识表记标帜：用未标识表记标帜的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种分歧的荧光素分别标识表记标帜的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原停止定位和定量.使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来历于分歧种属，且荧光标识表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光双标技术中操纵要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，分歧点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标识表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察. 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1).条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保管更久. 5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光. 6、荧光抗体染色假阳性能够会多，需要分别设定阳性和阴性对照.二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保管4h，时间过长，能够会使荧光提前衰退. 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标识表记标帜物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标识表记标帜物; (3) 荧光标识表记标帜物对照：PBS+荧光标识表记标帜物.三、免疫荧光双标的经历之谈1、选取一抗时，要求来历于两种分歧的动物，我用的是来历于家兔和大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光信号标识表记标帜的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红). 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要自我试探，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，布景比较清晰. 3、我的阳性对照采取的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标识表记标帜物对照是PBS+荧光标识表记标帜物. 4、封闭血清是二抗来历动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清. 5、其余事项同免疫荧光单标操纵.免疫组化双重染色方法和步调在生物医学和临床研究实践中，常常需要检测两种分歧物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色.此方法有几种类型，包含免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法连系;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位摄影，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、摄影);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标识表记标帜第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);分歧种属来历的抗体双重染色.今朝，最常常使用的是最后一种方法.分歧种属来历的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测.但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占相对优势时将妨碍另外一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原.在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种分歧特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的分歧种属生物素化二抗和两种分歧显色系统.即可将分歧部位或相同部位的两种抗原显示出来.该方法用于石蜡切片时应思索所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另外一个抗体的染色成果没有影响.SP法双重染色步调1～6步调与SABC 法相同，但无需使用生物素阻断剂：7.切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可防止已显色的抗原褪色);12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;13.滴加B 特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS冲洗3次，每次5分钟;14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS冲洗3次，每次5分钟：15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟17.苏木精复染细胞核;18.水溶性封片剂封片. 在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统停止详细设计.购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂.在选择一抗时应防止定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不成防止，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种分歧颜色的荧光重叠后呈现另外一种颜色的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光)，它比SP法的显色系统更容易区别和识别阳性成果. 在停止双重染色之前，必须对所选择的一抗分别停止单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验成果和抗体定位正确后，再停止双染实验.。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
之杨若古兰创作在同一组织细胞标本上须要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色.双重免疫荧光标识表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1)直接法双重免疫荧光标识表记标帜：将标识表记标帜有两种分歧荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种响应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量.直接法简即可靠，但灵敏度较低.(2)间接法双重免疫荧光标识表记标帜：用未标识表记标帜的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种分歧的荧光素分别标识表记标帜的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种响应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量.使用此法应留意两种特异性第一抗体必须来源于分歧种属，且荧光标识表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光双标技术中操纵要点和留意事项一、免疫荧光技术中标本建造的基本程序近似于酶免疫组化，分歧点如下： 1、免疫荧光不须要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其不异. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标识表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定. 3、二抗孵育以后充分洗片后即可贴片、封片和观察. 4、免疫荧光在封片时常使用公用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1).条件答应，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保管更久. 5、荧光抗体的孵育和后续处理须要避光. 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，须要分别设定阳性和阴性对照.二、留意事项 1、荧光染色后普通在1h内完成观察，或于4℃保管4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退. 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标识表记标帜物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标识表记标帜物; (3) 荧光标识表记标帜物对照：PBS+荧光标识表记标帜物.三、免疫荧光双标的经验之谈 1、拔取一抗时，请求来源于两种分歧的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旌旗灯号标识表记标帜的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红). 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，布景比较清晰. 3、我的阳性对照采取的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标识表记标帜物对照是PBS+荧光标识表记标帜物. 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清. 5、其余事项同免疫荧光单标操纵.免疫组化双重染色方法和步调在生物医学和临床研讨实践中，经常须要检测两种分歧物资是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，是以出现了免疫组织化学双重染色.此方法有几品种型，包含免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标识表记标帜第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有堆叠染色);分歧种属来源的抗体双重染色.目前，最经常使用的是最初一种方法.分歧种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测.但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对上风时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原.在该方法中利用最多的是把SABC法或SP法的实验流程反复两次，其中两种分歧特异性抗体(可所以小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的分歧种属生物素化二抗和两种分歧显色零碎.即可将分歧部位或不异部位的两种抗原显示出来.该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应当分歧或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响.SP法双重染色步调1～6步调与SABC法不异，但无需使用生物素阻断剂：7.切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可防止已显色的抗原褪色);12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS冲洗3次，每次5分钟;14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS冲洗3次，每次5分钟：15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟17.苏木精复染细胞核;18.水溶性封片剂封片. 在使用SP法双重染色之前须要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色零碎进行具体设计.购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案不异的配套试剂.在选择一抗时应防止定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不成防止，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，由于两种分歧色彩的荧光堆叠后呈现另一种色彩的荧光(如红色荧光与绿色荧光堆叠呈现黄色荧光)，它比SP法的显色零碎更容易区别和识别阳性结果. 在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件不异，在观察预实验结果和抗体定位准确后，再进行双染实验.。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
想做多重免疫荧光收好指南教你一张片子染出七种颜色
想做多重免疫荧光？收好指南，教你一张片子染出七种颜色想做多重免疫荧光？需要先思考这几个问题：问题1：你认得全动物园里的动物们吗，比如大鼠，小鼠，兔，山羊，绵羊，鸡，荷兰猪（豚鼠）？不同种属的抗体需闹清楚。
问题2：你确定能分得清字母表并做得了十以内得加减法吗？有不同亚型鉴定的过的一抗，比如：IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgM，IgE 不知道怎能行？问题3：你确定能将动物和数字字母们对号入座，并找对门牌吗？有对应种属特异反应性的Fab 二抗，比如：F(ab')2 Fragment （避免Fc 反应性出现的非特异染色），Cross adsorbed（抗体纯化过程交叉吸附，避免物种交叉反应带来的背景）。
问题4：你确定能将重峦叠嶂移出两山排闼吗？选择合适的荧光素，明辨激发光和发射光，且不会导致荧光背景增强，比如：FITC、PE、Cy、Alexa Fluor、DyLight。
就算上面的问题你都能搞定，订购来了各种试剂，准备来了片子，你就一定能染出来多重颜色？你只是迈开了万里长征的第一步而已。
因为要得到理想的荧光实验结果，每一个步骤都需深(w ā) 度(kēng) 优(mái) 化(tǔ)，固定通透方法、浓度配比、抗体共孵育、抗体稀释液、封闭条件等等。
此时，有人在你发际线还没有升高，头发还乌黑浓密的时候，在你的耳边悄悄跟你说：做多重荧光简单，有种快捷省时的方法。
先让你们随意感受一下这种方法染出来的图片：接下来我们将仔细介绍该方法实验原理和实验步骤。
多重荧光免疫组化（mIHC）实验原理上述方法采用TSA 技术(Tyramide Signal Amplification?，酪胺信号放大技术)：简单来说，用该方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。
荧光素在HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
多重免疫荧光染色步骤
多重免疫荧光染色步骤引言：多重免疫荧光染色是一种常用的实验技术，可以同时检测多个目标分子在细胞或组织中的分布和表达情况。
本文将详细介绍多重免疫荧光染色的步骤和操作要点。
一、样品处理1. 固定样品：将细胞或组织样品固定在载玻片上，以保持其形态和结构的完整性。
常用的固定剂包括甲醛、乙酸乙酯和乙醇等。
2. 渗透化处理：使用适当的渗透化剂，如Triton X-100或Tween-20，使抗体能够渗透到细胞或组织中。
二、抗体染色1. 阻断非特异性结合：在样品中加入非特异性抗体，如牛血清白蛋白（BSA）或羊血清蛋白（GFP），以阻断非特异性结合位点。
2. 加入第一抗体：将第一抗体加入样品中，与目标分子结合。
第一抗体可选择单克隆抗体或多克隆抗体。
3. 温育：将样品在适当的温度下孵育一段时间，以促进抗体与目标分子的结合。
4. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。
5. 加入第二抗体：将与第一抗体来源不同的二抗加入样品中，与第一抗体结合。
第二抗体通常是标记有荧光染料的抗动物IgG。
6. 温育：将样品在适当的温度下孵育一段时间，以促进二抗与第一抗体的结合。
7. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的二抗。
三、显微镜观察和图像分析1. 准备显微镜：调整显微镜的倍数和对焦，确保观察的图像清晰。
2. 拍摄图像：使用数码相机或显微镜系统，拍摄染色后的样品图像。
3. 图像分析：使用图像处理软件对图像进行分析，包括定量分析和定位分析。
可以通过计算荧光强度和位置来获取目标分子的表达水平和分布情况。
四、注意事项1. 抗体选择：选择适当的抗体对目标分子进行检测，确保其特异性和敏感性。
2. 温育条件：温育时间和温度需根据抗体和样品类型进行优化，以提高染色效果。
3. 洗涤条件：洗涤时需充分去除未结合的抗体和试剂，以减少背景信号。
4. 控制实验：进行相应的阴性对照实验，用于验证染色结果的特异性。
5. 图像分析方法：选择合适的图像处理软件和分析方法，确保准确、可靠地分析染色结果。
免疫荧光 样品制备及体会
免疫荧光细胞样品制备及体会●免疫荧光细胞化学技术：将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观察、检测具有特征性的荧光，可以定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白的方法称为免疫荧光细胞化学技术。
●结合了免疫反应的特异性和荧光检测的灵敏性。
●常用方法：直接法、间接法和双标记法。
●使用免疫荧光染色，我们可以方便的观察目的蛋白在细胞中何时表达，对目的蛋白进行定性（有无表达）、定位（胞浆、胞核或胞膜）分析，以及比较其表达量的多少。
●不同的抗体通过标记不同的荧光染料，我们可以同时观察细胞中两种或多种蛋白的表达和分布。
蛋白质的不同定位提示其可能具有的功能：●胞浆：参与细胞内信号转导，蛋白质转运●胞核：可能是转录因子参与DNA转录，基因表达调节因子●胞膜：离子泵，参与构成离子通道、细胞间通讯，细胞内外物质交换，作为细胞因子受体荧光染料●具有吸收一定频率光能，并产生一定光量子的荧光团，在一定波长的激发光作用下可发射不同颜色的荧光。
●尽量了解所使用的荧光染料的特性：如激发光谱和发射光谱。
比较常用的荧光染料：FITC蓝光绿光TRITC绿光红光Cy3、Cy5绿光红光PI绿光红光DAPI紫外蓝光Hoechst紫外蓝光直接法●直接用荧光标记的抗体与细胞中的相应抗原结合。
本法简便快速，非特异性荧光干扰少；缺点是一种标记抗体只能测定一种抗原，需要的抗体量较大，昂贵且敏感性较低。
●未标记抗体（一抗）先与细胞中的相应抗原结合，再用荧光素标记的抗体（二抗）与一抗结合。
本法仅需标记一种抗体（二抗如羊）就可以检测很多由同一种动物（如兔）制备的不同蛋白的抗体；缺点是染色时间较长，出现非特异性染色的机会较多。
但较直接法更敏感，有信号放大作用。
间接法●双标记法：在同一个细胞标本上同时检测两种抗原，进行双重免疫荧光染色。
将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育。
抗A抗体用FITC标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TRITC标记，发红色荧光，这样就可以明确显示两种抗原在细胞中的定位。
免疫荧光双标操作方法及注意事项之欧阳与创编
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫组化-双重染色
免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
双重染色
一、[实验诊断综合]免疫组化双重染色方法和步骤在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合；同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照)；两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体．用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色)；不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应．特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
SP法双重染色步骤1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：7．切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟；9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟10．碱性磷酸酶显色液(BCIP／NBT)显色(紫蓝色)．PBS冲洗3次，每次5分钟；11．滴加0．05％盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色)；12．滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟；13．滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
之阳早格格创做正在共一构造细胞标本上需要共时检测二种抗本时，需举止单沉荧光染色.单沉免疫荧光标记表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为间接法战间接法.(1)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：将标记表记标帜有二种分歧荧光素的抗体(如抗A战抗B)以适合比率混同，滴加正在标本上孵育，而后洗去已分离的荧光抗体，正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，即可对于二种抗本举止定位战定量.间接法简即稳当，然而敏捷度较矮.(2)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：用已标记表记标帜的二种特同性第一抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第一抗体后，再用二种分歧的荧光素分别标记表记标帜的第二抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第二抗体，后正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，进而对于二种抗本举止定位战定量.使用此法应注意二种特同性第一抗体必须根源于分歧种属，且荧光标记表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光单标技能中支配重心战注意事项一、免疫荧光技能中标本创造的基础步调近似于酶免疫组化，分歧面如下： 1、免疫荧光不需要使用单氧火处理，启关战一抗孵育与其相共. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标记表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的处事浓度决定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可揭片、启片战瞅察. 4、免疫荧光正在启片常常使用博用启片剂或者苦油：0.01M PBS (1：1).条件许可，提议买买抗淬灭的启片液，使标本不妨保存更暂. 5、荧光抗体的孵育以及后绝处理需要躲光. 6、荧光抗体染色假阳性大概会多，需要分别设定阳性战阳性对于照.二、注意事项 1、荧光染色后普遍正在1h内完毕瞅察，或者于4℃保存4h，时间过少，大概会使荧光提前出落. 2、屡屡考查均需树立以下三种对于照：(1) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (2) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (3) 荧光标记表记标帜物对于照：PBS+荧光标记表记标帜物.三、免疫荧光单目标体味之道 1、采用一抗时，央供根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于家兔战大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑). 2、尔的干法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要自尔摸索，尔感觉一抗4℃孵育过夜比较佳，背景比较浑晰. 3、尔的阳性对于照采与的是阳性构造切片，阳性对于照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对于照是PBS+荧光标记表记标帜物. 4、启关血浑是二抗根源动物的平常血浑，尔用的是10%平常donkey血浑. 5、其余事项共免疫荧光单标支配.免疫组化单沉染色要领战步调正在死物医教战临床钻研考查中，常常需要检测二种分歧物量是可正在共一般品中共存或者共一种细胞中共存，果此出现了免疫构造化教单沉染色.此要领有几种典型，包罗免疫酶构造化教战免疫荧光细胞化教法分离;共十足片的再度染色法(先对于第一种抗本染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗本抗体解离，继之，对于第二种抗本染色、拍照);二种酶标抗体3又沉染色(分别用辣根过氧化物酶战碱性磷酸酶标记表记标帜第二抗体.用间接法分别隐现A战B抗本，如二种一抗去自共一种属，常有沉叠染色);分歧种属根源的抗体单沉染色.暂时，最常常使用的是末尾一种要领.分歧种属根源的抗体单沉染色，二种抗体间无接又反应.特同性较下，纵然细胞内抗本量很少也能检测.然而是，当二种抗本存留于共一部位而其中之一浓度较下，占千万于劣势时将妨碍另一种抗本染色，此种情况应分别染色，最先染色含量较少的抗本，再隐现含量歉富的抗本.正在该要领中应用最多的是把SABC法或者SP 法的真验过程沉复二次，其中二种分歧特同性抗体(不妨是小鼠或者大鼠单克隆抗体战兔多克隆抗体的所有二个拉拢)，与一抗对于应的分歧种属死物素化二抗战二种分歧隐色系统.即可将分歧部位或者相共部位的二种抗本隐现出去.该要领用于石蜡切片时应试虑所采用的二个抗体的建复要领该当普遍或者一个抗体的建复对于另一个抗体的染色截止不做用.SP法单沉染色步调1～6步调与SABC法相共，然而无需使用死物素阻断剂：7.切片加进A特同性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS浑洗3次，屡屡5分钟8.滴加死物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，既而PBS浑洗3次，屡屡5分钟;9.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟10.碱性磷酸酶隐色液(BCIP/NBT)隐色(紫蓝色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可预防已隐色的抗本褪色);12.滴加抗小鼠二抗共种属的非免疫血浑，37~C孵育10分钟;13.滴加B特同性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS浑洗3次，屡屡5分钟;14.滴加死物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS浑洗3次，屡屡5分钟：15.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟16.过氧化物酶隐色液(AEC)隐色(陈黑色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟17.苏木粗复染细胞核;18.火溶性启片剂启片. 正在使用SP法单沉染色之前需要对于待测抗本的本量、二抗的种属典型战隐色系统举止仔细安排.买买免疫组化单染试剂盒时;应采用与安排规划相共的配套试剂.正在采用一抗时应预防定位正在细胞的共一部位(如胞核、胞浆战胞膜)的二种抗本，如果不可预防，最佳采用免疫荧光构造细胞化教单沉染色要领，果为二种分歧颜色的荧光沉叠后浮现另一种颜色的荧光(如黑色荧光与绿色荧光沉叠浮现黄色荧光)，它比SP法的隐色系统更简单辨别战辨别阳性截止. 正在举止单沉染色之前，必须对于所采用的一抗分别举止单独染色预真验，预真验条件必须与单染条件相共，正在瞅察预真验截止战抗体定位粗确后，再举止单染真验.。
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免疫荧光双重染色样品制备的最佳方法探讨
作者：阎继攀， 郑勇， 刘浩， 李睿， 张宁， 陈卫刚， YAN Ji-pan， ZHENG Yong， LIU Hao， LI Rui，ZHANG Ning， CHEN Wei-gang
作者单位：阎继攀,刘浩,YAN Ji-pan,LIU Hao(石河子大学医学院, 新疆维吾尔自治区石河子,832000)， 郑勇,李睿,张宁,陈卫刚,ZHENG Yong,LI Rui,ZHANG Ning,CHEN Wei-gang(石河子大学医学院第一附属医院消化内科)
刊名：
中国医师杂志
英文刊名：Journal of Chinese Physician
年，卷(期)：2012(z1)
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brain,liver,lung,and nasal epithetlium 2002(01)
2.陈卫刚;郑勇;宋丽秀内源性H2S对大鼠实验性肝硬化门脉高压的影响[期刊论文]-世界华人消化杂志 2011(05)
3.张宁;郑勇;王于理内源性硫化氢在不同时期大鼠肝硬化中的作用[期刊论文]-世界华人消化杂志 2009(03)
4.Oretti G;Becker M;Key G Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB1 and MIB3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections 1992(04)
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8.Jackson EL;Willis N;Mercer K Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K 2ras 2001(24)
9.Kim CF;Jackson EL;Woolfenden AE Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer
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本文链接：/Periodical_zgyszz2012z1002.aspx。