成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备
【国家自然科学基金】_条件性敲除_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731
2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
2014年 科研热词 推荐指数 黏蛋白1 1 锌指蛋白(plzf) 1 表型分析 1 精原干细胞 1 神经元损伤 1 生物学功能 1 条件性敲除 1 条件性剔除技术 1 常用系统 1 常染色体显性遗传性多囊肾疾病 1 展望 1 小鼠 1 功能研究 1 前脑缺血 1 内源性组胺 1 vil-cre 1 pten基因敲除 1 pkd2 1 perp 1 lck-cre 1 cre/loxp系统 1 cre-loxp系 1 adpkd 1
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8
科研热词 基因敲除 肝纤维化 肝癌 肝炎 杂合子 小鼠 cre/loxp技术 cdc42
推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
2008年 序号 1 2 3 4
科研热词 骨骼发育 条件性基因敲除 小鼠 fgfr1
推荐指数 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
科研热词 过表达 软骨发育不全 软骨内成骨 肺腺癌 细胞转化 细胞成瘤性 甲基苯丙胺 条件性基因敲除 条件性位置偏爱 敲除小鼠鉴定 小鼠 多巴胺d3受体 多克隆抗体 基因敲除 内源性 低氧诱导因子-1α von'hippel-lindau pten p53 orai2 k-ras fgfr3
基因敲除小鼠的制作方法
基因敲除小鼠的制作方法基因敲除小鼠是一种常用的遗传工具，在科学研究中被广泛应用于功能基因组学和疾病模型研究。
基因敲除是指通过特定技术手段，将小鼠体内的目标基因完全沉默或失活，从而研究该基因在发育、生理以及疾病机制中的功能。
本文将介绍基因敲除小鼠的制作方法，包括设计目标基因的敲除载体、胚胎干细胞的筛选和注射、外显子敲除策略的选择等。
1.设计目标基因的敲除载体敲除载体是嵌入目标基因的重要工具。
它通常包含正向与反向的同源臂（homology arms）以及选择标记（如抗生素抗性基因）。
同源臂的长度通常在2-5 kb之间，确保在同源重组时准确而有效地替代目标基因。
此外，敲除载体中还应该包含可诱导甲基化的Cre-loxP重组体系或者FLP-FRT重组体系，以用于后续的基因定向敲除或基因重新组装。
2.筛选胚胎干细胞胚胎干细胞是从内胚层发育而来的多潜能细胞，可以分化为整个鼠体的各种组织和器官。
敲除载体首先需要通过电转或霰粒枪等手段转染到胚胎干细胞系中。
转染后，胚胎干细胞需要进行抗生素筛选，以过滤未转染的细胞。
为了确保目标基因的敲除率，可以使用增强绿色荧光蛋白（eGFP）等标记基因，通过荧光显微镜观察转染细胞的表达情况。
3.敲除载体注射到小鼠受精卵中一旦确认胚胎干细胞中存在敲除载体，接下来就是将胚胎干细胞植入小鼠受精卵。
这个步骤一般由经验丰富的研究人员或者专业公司进行。
首先，选择合适的受精卵（通常为C57BL/6J小鼠品系），然后利用显微操作技术，将敲除载体注射到受精卵的核酸注入腔。
注射后，将受精卵转入对应营养液中培养一定时间，以期达到最佳着床率。
4.敲除鼠胚移植到配子体内经过培养后，将敲除的胚胎植入雌性激素准备好的代孕小鼠（通常为白色的株系，如ICR）。
移植后，将代孕小鼠继续养育，直至分娩。
5.验证敲除小鼠的敲除效果通过提取敲除小鼠的DNA，可以利用PCR、Southern blot和DNA测序等技术验证敲除效果。
成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)对骨形成的直接调控作用
第三军医大学硕士学位论文
楚。 骨损伤后的再生修复是局部骨骼的再发育过程。一些参与调控骨骼发育的分子如
IHH/PTHrP、BMPs、Wnt 等在骨再生过程中也起着重要调控作用。研究发现，FGFR3 参与调节骨损伤后的再生过程，且在一定程度上，FGFR3 对骨再生和骨生长发育中的 软骨内成骨过程可能发挥相似的负性调控作用。而 Rundle 等发现 FGFR3 表达于骨折 部位成骨细胞和骨膜下间充质细胞，提示 FGFR3 直接参与调控骨再生过程中的成骨细 胞骨形成过程。那么 FGFR3 在骨再生过程中对成骨细胞骨形成的影响是否与 FGFR3 在成年期骨重建中的作用类似呢？
既往研究表明，FGF/FGFRs 信号通路与骨骼发育、再生和骨骼疾病有密切联系。 FGFR1、2、3 功能增强或丧失突变可导致包括颅缝早闭(craniosynostosis, CS)、软骨发 育不全(achondroplasia, ACH)和 CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss)综合征在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病。
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ห้องสมุดไป่ตู้
第三军医大学硕士学位论文
主要结论 1. 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变小鼠体型变小，但生长板软骨未 见明显异常，提示成骨异常在 ACH 侏儒体型发生中有一定作用。 2. 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变小鼠成年期骨形成增加，导致骨 量增多。 3. FGFR3 功能增强促进成骨细胞分化，抑制其矿化。 4. FGFR3 功能增强对成骨细胞的影响可能部分是通过 FGFR1、FGFR2 及 BMPRIA 的继发性改变所致。 5. FGFR3 功能增强导致小鼠骨皮质缺损愈合延迟。 关键词：FGFR3；骨形成；成骨细胞；破骨细胞；骨再生
基因敲除小鼠的制作方法
..一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：基因敲除其他方法：一、ZFN技术制作基因敲除鼠ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
Hepcidin基因敲除对小鼠骨代谢的影响及相关机制研究的开题报告
Hepcidin基因敲除对小鼠骨代谢的影响及相关机制
研究的开题报告
背景介绍：Hepcidin是一种铁调节激素，其作用是调节体内铁的吸
收和排泄，进而影响机体内的铁代谢。
近年来的研究表明，Hepcidin除
了对铁代谢的调节作用外，还与骨代谢存在着密切的关系。
然而，目前
关于Hepcidin对骨代谢的作用机制还存在很多争议和未知之处。
目的：本研究旨在探讨Hepcidin基因敲除对小鼠骨代谢的影响及其
相关机制。
研究内容：采用Hepcidin基因敲除小鼠作为研究对象，通过比较敲
除小鼠和野生型小鼠的骨代谢指标，如骨密度、骨形态、骨质量、骨小
梁结构等，来初步探究Hepcidin对骨的影响。
同时，将从细胞分子水平
上分析Hepcidin基因敲除后对骨细胞分化及功能的影响，如成骨细胞和
破骨细胞的数目、形态、分泌细胞因子的能力、骨再生能力等，以此揭
示Hepcidin调节骨代谢的机制。
研究意义：通过本研究，将进一步认识Hepcidin在骨代谢中的作用，并且为解决一些与骨代谢相关的疾病提供新的治疗思路。
神经干细胞的增殖与分化调控机制
。
研究表明, NSC 广泛存在于发育期和成年哺乳 动物的 CNS 中。在对人胚胎期 NSC 的研究中, 已先 后从大脑皮质、 海马、 纹状体、 嗅球、 侧脑室、 室管膜 下层、 小脑和脊髓等区域分离出 NSC 。自从 1992 年 Reyno lds和 W e iss 周内
。
大鼠海马神经元数量明显减少, 但随后在坏死区和 边缘带可见显著的神经元新 生, 同时证实这些 N e uN 细胞来源于内源性神经前体细胞。上述研究表 明, NSC 的增殖和分化与局部微环境信号密切相关。 2 3 NSC 增殖和分化的内在机制 各类细胞因子对 NSC 的影响 最终在基因水平
W e i Tu , Zh i F eng Deng , Y ang W ang 1 Depart m ent o f Neurosurgery , the Second A ffiliated H ospital o fM edical Co llege of N anchang 2 Un iv ersity , Nanchang 330006 , Ch in a ; Institute of U rological Surgery , the F irst A ffilia ted H osp ital o fM ed ic al Co llege of N anchang University , N anchang 330006 , Chin a Abstract N eural stem cells ( NSC s) have th e ab ility o f h ig hly se lf renew a l and can be dif ferentiated into neurons , astrocytes and o ligodendrocytes . NSC s can be iso lated from the brain s o f em bryon ic and adu lt m amm als. T he proliferation and d ifferent iatio n of stem ce lls are regu lated by both m icroenv iron m enta l factors and genes . It has been found th at a num ber of cy tok in es and genes can regu late the pro liferation o f NSCs, and deter m ine their d irectio n of d ifferent iatio n . Furth er understanding of the m echan ism s of pro liferat io n and d ifferent iatio n of NSC sw ill sign if icantly prom ote the c lin ical app lication o f NSCs. K ey W ords neural stem ce l; l proliferation ; d ifferent iation 神经干细胞 ( neural stem cel, l NSC )是具有高度 自我更新能力并能分化为神经元、 星形胶质细胞和 少突胶质细胞的神经前体细胞。 NSC 概念的提出彻 底改变了 以往认 为中 枢神 经系 统 ( central nervous system, CNS) 细 胞不能 再生 的观 念。 NSC 移 植为 CNS损伤和神经 退行性疾病的治疗 提供了新的方 向。因此, 对 NSC 增殖和分化调控的研究显得尤其 重要。 1 N SC 的特性 、 来源和分布 NSC 具有 2 个显著的特性 : ( 1) 高度自我更新 能力, 能够重复进行有丝分裂, 产生大量子代细胞 ; ( 2) 在一定条件下可分化为神经元、 星形胶质细胞 和少突胶质细胞。在对称分裂情况下, NSC 产生的 2 个子代细胞可以均为 NSC, 也可以均为神经祖细 胞; 而在不对称分裂情况下 , 则 产生 1 个 NSC 和 1 个神经祖细胞。后者的自我更新能力有限, 终将逐 步分化成熟。这样 , 既 能维持 NSC 的自我更新 , 又 能不断补充分化的神经祖细胞。巢蛋白 ( nestin) 属 于细胞骨架蛋白 , 可作为 NSC 的标志性蛋白 , 从而 为进一步研究 NSC 的特性提供了一把钥匙
成纤维细胞生长因子23在骨矿物质代谢中的作用及其调控机理
成纤维细胞生长因子23在骨矿物质代谢中的作用及其调控机理董中亮;任晓曼;卜舒扬;闪爱婷;王玉婷;杨建成【摘要】骨源性激素成纤维细胞生长因子23(FGF23)介导由甲状旁腺、肾脏、骨骼和维生素D组成的负反馈回路,建立"骨骼-肾脏-甲状旁腺"内分泌轴,参与骨矿物质代谢并发挥重要作用.钙、磷、铁、维生素D、甲状旁腺素(PTH)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)/FGF以及蛋白质翻译后修饰调控FGF23的分泌、活性和胞内过程.随着深入的研究,探索出了一些以FGF23为靶点治疗骨矿物质代谢障碍疾病的新疗法.本文综述了FGF23在骨矿物质代谢中的作用及其调控机理的研究进展,以期为相关研究提供参考依据.%fibroblast growth factor?23 ( FGF23 ) as a bone?derived hormone plays an important role in bone mineral metabolism by mediating the negative feedback loops formed by parathyroid gland, kidney, bone and vitamin D to constructing abone?kidney?parathyroid gland endocrine axis. The secretion, activity and intracel?lular processes of FGF23 are regulated by calcium, phosphate, iron, vitamin D, parathyroid hormone ( PTH) , fibroblast growth factor receptor ( FGFR)/FGF and posttranslational modifications. With the increase of study on FGF23, the researchers have explored new therapeutic interventions on bone mineral metabolism disorder. In order to provide reference for relevant research, functions and regulation mechanism of FGF23 in bone min?eral metabolism were reviewed in this paper.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2017(029)010【总页数】5页(P3467-3471)【关键词】成纤维细胞生长因子23;骨矿物质代谢;钙;磷;铁【作者】董中亮;任晓曼;卜舒扬;闪爱婷;王玉婷;杨建成【作者单位】沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳204医院,沈阳 110043;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】S852.2钙、磷是动物生长、骨骼发育和维持机能所必需的矿物质元素，是骨骼的基本组成成分，它们结合生成的羟基磷灰石构成骨盐。
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【摘要】BACKGROUND: The orphan nuclear receptors Rev-erbα and Rorα play important roles in lipid metabolism and glucose metabolism. But it is unclear whether they are involved in bone metabolism. OBJECTIVE: To observe the expression of Rev-erbα and Rorα during the osteoblastogenesis process of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: BMSCs were isolated and purified from C57BL/6 mice by the whole bone marrow adherence method followed by morphology observations and then BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. We detected their differentiation abilities using oil red O staining and alizarin red staining, respectively. Real-time PCR and western blot assay were conducted to detect the mRNA and protein levels of Rev-erbα and Rorα in BMSCs cultured in the osteogenic medium for 0, 7, 14 days. RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs fromC57BL/6 mice were mainly spindle-shaped and exhibited the swirl-like pattern of growth. Following induction, oil red O staining and alizarin red staining produced a positive reaction in these cells. Rev-erbα expression at both gene and protein levels decreased at 0, 7, 14 days after osteogenic induction, while Rorα expression increased at both gene and pro tein levels. These findings indicate that Rev-erbα and Rorα may participate in the osteoblastogenesis of BMSCs.%背景:孤儿核受体Rev-erbα及Rorα已经被广泛证实与糖代谢、脂肪代谢等密切相关,但与骨代谢的关系尚不明确.目的:探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用.方法:采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察和成脂、成骨诱导分化,采用油红O染色,茜素红染色对其分化能力进行鉴定.在骨髓间充质干细胞成骨诱导分化第0,7，14天,采用Real Time PCR及Western Blot分别检测孤儿核受体Rev-erbα及Rorα的mRNA及蛋白表达变化.结果与结论:①骨髓间充质干细胞形态以梭形为主,呈典型的漩涡样生长.油红O染色及茜素红染色呈阳性;②在成骨诱导的第0,7,14天,Rev-erbα的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势,而Rorα的mRNA及蛋白表达均呈上升趋势,提示Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中可能发挥了一定的作用.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)017【总页数】6页(P2625-2630)【关键词】干细胞;骨髓间充质干细胞;成骨分化;核受体;Rev-erbα;Rorα【作者】林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【作者单位】西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学公共卫生学院,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市646000;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院正畸科,四川省成都市 610041【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：Rev-erbα：又名Nr1D1，是孤儿核受体超家族中的一员，Rev-erbα基因位于人类第17号染色体上。
FGFR1在骨骼发育、稳态维持和损伤修复中的作用研究进展
FGFR1在骨骼发育、稳态维持和损伤修复中的作用研究进展陈涵纲;陈华;苏楠;聂茂
【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》
【年(卷),期】2024(30)6
【摘要】骨骼是全身最大的器官之一,其发育及稳态维持异常可引起多种骨骼疾病,如骨骼遗传病、骨退行性疾病(如骨质疏松症、骨性关节炎)和骨折等。
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)家族重要成员FGFR1在骨骼发育和稳态维持中发挥关键作用。
FGFR1功能增强点突变可引起囟门早闭综合征等骨骼遗传病,同时也参与调节骨形成、骨吸收过程以及关节炎的发生。
此外,FGFR1在骨损伤修复不同阶段的骨骼相关细胞中均有表达,提示其参与骨修复过程。
笔者总结了FGFR1在骨骼发育、稳态维持及损伤修复中的作用和机制研究进展,为从干预FGFR1信号角度治疗骨骼相关疾病提供借鉴。
【总页数】6页(P869-874)
【作者】陈涵纲;陈华;苏楠;聂茂
【作者单位】重庆医科大学附属第二医院骨科关节外科中心;陆军军医大学大坪医院骨质疏松与骨发育中心/战伤组织修复与康复医学研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R681.1
【相关文献】
1.维生素D信号通路在骨骼稳态维持中的作用
2.不同亚型的真皮成纤维细胞在皮肤再生发育与稳态维持中作用的研究进展
3.Hippo信号通路在骨骼肌损伤修复中作用的研究进展
4.YAP/TAZ蛋白在骨骼形成及稳态维持中的作用
5.MicroRNA在骨骼肌生成发育及损伤修复中的研究进展
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FGFR1在雌激素调控成骨细胞增殖分化过程中的作用研究
FGFR1在雌激素调控成骨细胞增殖分化过程中的作用研究魏霆;肖国宁;孙惠强【摘要】目的:明确Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(FGFR1)在雌激素促成骨细胞增殖分化过程中的作用,并进一步探索其作用机制.方法:在雌激素作用下采用抑制剂PD166866抑制FGFR1的活性,(四唑甲基噻唑)MTT、(碱性磷酸酶)ALP检测成骨细胞增殖分化活性;Western Not比较各组成骨细胞Runx2和OCN表达水平以及(丝裂原活化蛋白激酶)MAPK信号通路关键因子ERK1/2,JNK,P38表达水平及磷酸化水平.结果:雌激素作用下,加入抑制剂后,成骨细胞中MTT值明显降低,ALP值明显增高(P＜0.05),且Runx2,OCN蛋白表达水平明显增高(P＜0.05);雌激素作用下,ERK、JNK和P38蛋白表达无明显改变,但磷酸化水平均显著升高,加入抑制剂后,仅ERK磷酸化水平明显上升(P＜0.05).结论:本实验结果提示FGFR1对成骨细胞具有促进增殖、抑制分化的作用,且介导雌激素调控成骨细胞增殖分化的过程;此外,多条MAPK信号通路中,仅ERK通路参与了该过程.%Objective:To investigate the role of fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) in the proliferation and differentiation of bone cells induced by estrogen,and to further explore the FGFR1 regulatory mechanism on MC3T3-E1 cells.Methods:Under the action of estrogen,inhibitor PD166866 was used to inhibit the activityofFGFR1.Methyl thiazol tetrazolium (MTT) and alkaline phosphatase (ALP) were used to detect the proliferation and differentiation acivties of osteoblasts.The expression levels of Runx2 and OCN of osteoblasts in each group,and the expression levels and phosphorylation levels of the key genes(ERKl/2,JNK,P38) in the MAPK signaling pathway by Western blot were compared and elevated.Results:Under the effects ofestrogen,treatment with inhibitor PD 166866 reduced the MTT values,increased ALP activity and increased the levels of Runx2 and OCN protein significantly (P＜0.05).And under the effects of estrogen,no significant changes on the expression level of ERK,JNK and P38 while the phosphorylation levels of ERK,JNK and P38 is higher (P＜ 0.05).After adding the FGFR 1 inhibitor PD 166866,only the phosphorylation level of ERK increased (P＜ 0.05).Conclusion:FGFR1 may promote osteoblast proliferation and inhibit osteoblast differentiation,and participate in the process of estrogen regulating osteoblast proliferation and differentiation.And in multiple MAPK signaling pathways,only the ERK pathway participates in the process.【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》【年(卷),期】2018(019)002【总页数】6页(P113-118)【关键词】雌激素;Ⅰ型成纤维细胞因子受体;成骨细胞;ERK/MAPK信号通路【作者】魏霆;肖国宁;孙惠强【作者单位】山东大学口腔医学院修复科山东250012;天津医科大学总医院天津300052;山东大学口腔医学院山东250012【正文语种】中文【中图分类】R780.2雌激素对人体多种生理功能的正常运行至关重要，既往研究表明，雌激素可促进骨形成，并在促进颌骨细胞增殖分化中发挥重要作用[1，2]。
骨骼系统的新型内分泌功能-科研院-四川大学
1.推荐奖种:中华医学科技奖医学科学技术奖2.项目名称：骨骼系统的新型内分泌功能3.推荐单位或推荐科学家：四川大学4.推荐意见：我单位认真审阅了该项目推荐书及附件材料，确认全部材料真实有效，相关栏目均符合四川省科学技术奖励工作办公室的填写要求。
按照要求，我单位和项目完成单位都已对该项目拟推荐情况进行了公示，目前无异议。
明确骨内分泌系统发挥调节作用的分子信号网络，可以为骨质疏松、钙磷代谢紊乱、肿瘤相关骨病，糖尿病、高脂血症等常见病及多发病的早期诊断、靶向治疗及药物开发提供理论依据、新的方法及靶向目标。
我们课题组在国家自然科学基金，教育部等各级课题的资助下，历时9年，围绕骨骼系统的新型内分泌功能这一核心问题，取得了如下的研究成果： 1.首次提出了FGF23 为内分泌激素的观点；2.首次发现磷在VDR 敲除小鼠中能够恢复FGF23 的表达；3.首次发现SHARPIN基因在骨代谢中发挥着重要的调控作用；4.较早提出骨与胰腺之间存在反馈环路。
上述成果发表SCI 收录论文65篇，他引2068次，其中8篇代表性论文被New England Journal of Medicine; Nature;Nature Reviewers Drug Discovery等杂志引用，单篇最高他引118次；肺癌骨转移的研究成果在AACR的2016年年度会议上入选年度被引用最高文章之一（中国地区唯一获奖者)。
综上，该成果起点高、难度大，创新性突出，每位完成人均对该项目做出了实质性贡献。
5.项目简介：骨、脂肪和肠道等一些非经典的内分泌组织器官近年来被发现具有重要内分泌功能。
骨内分泌包括两方面的生理病理作用，一方面是骨骼系统通过合成分泌一些新型的内分泌激素对其它组织器官的生理病理活动发挥重要的调节作用，如骨骼产生成纤维细胞生长因子23 (Fibroblast Growth Factor 23, FGF23)，通过血循环作用于靶器官肾调节磷代谢；骨骼合成分泌骨钙素调节糖脂代谢和雄性激素的产生；另一方面，胰岛、脂肪或者一些肿瘤组织通过胰岛素、瘦素、PTHrP及一些特殊的小RNA（miRNAs）等调节成骨和破骨细胞功能而调节骨骼的塑造和重建。
胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备
尊敬的《上海医学》编辑老师：您好！首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修，目前已按照修改意见进行了修改，以下是对修改意见的具体答复，希望回答专家的问题，谢谢。
1.“胰岛细胞特异性敲除APPL1基因”和“β细胞APPL1特异性敲除APPL1基因”这两种表达方法应该统一；在文章中已做修改。
2.从图3可以看出，β细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野生型，原因何在?正如文章所提及，我们收集APPL1flox/flox和β-APPL1KO两组小鼠多例样本，western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异，为了消除之前结果容易给人的误解，我们另外选择两组实验数据来作为结果图。
3.该研究目的是建立β细胞APPL1基因敲除小鼠模型，因此在表型分析方面应多关注β细胞功能，至少要提供血胰岛素水平方面的数据，而不是仅仅提供血糖数据。
这个意见提得很好，事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异，这部分内容我在文章的方法和结果中也已作了修改和补充。
4.如可以请引用《上海医学》杂志和《中国实用内科杂志》的参考文献各一条在文章中我已做补充。
此致敬礼李晓雯2015.1．30胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备李晓雯1 李羚1林紫薇1 孙赟1 陈辰2王琛1* 贾伟平1【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰岛细胞特异性敲除小鼠模型。
方法采用基因剔除打靶技术，囊胚显微注射法制备嵌合小鼠，利用Cre-loxp系统繁育APPL1胰岛特异性敲除小鼠。
Western blot检测APPL1蛋白表达水平。
结果成功制备胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型，与APPL1flox/flox小鼠相比，胰岛细胞特异性敲除基因APPL1并不影响小鼠体重，空腹血糖以及空腹胰岛素水平，western blot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的APPL1蛋白无表达。
成纤维样滑膜细胞的生理功能及其在炎性关节病诊疗中的应用进展
㊃综述㊃d o i:10.3969/j.i s s n.1671-8348.2021.08.030成纤维样滑膜细胞的生理功能及其在炎性关节病诊疗中的应用进展*熊翱1,2,熊仁平2,彭艳2综述,许建中1ә审校(1.郑州大学第一附属医院骨科,郑州450052;2.中国人民解放军陆军特色医学中心野战外科研究部,重庆400042)[摘要]运动障碍的主要原因是各类炎性关节病(I J D),关节滑膜的功能改变影响着患者的运动功能㊂滑膜组织中的滑膜成纤维样细胞(F L S),在生理状态下参与了骨关节的润滑和免疫调节及维持关节腔稳态;在病理状态下,参与了I J D的发生㊁发展,诱发关节炎症,破坏滑膜㊁关节软骨㊁关节㊂F L S在I J D病理过程中扮演着重要角色,为了深入研究F L S在I J D中的作用,搞清楚I J D的发病机制和寻求治疗靶点,F L S体外研究I J D是国内外热点㊂为此,本文将对F L S在生理和病理状态的功能及F L S在I J D诊疗中的应用进展进行综述,以期为I J D的病理机制研究和治疗靶点的探讨提供帮助㊂[关键词]成纤维样滑膜细胞;炎性关节病;骨关节炎;综述[中图法分类号] Q95-33[文献标识码] A[文章编号]1671-8348(2021)08-1399-05P h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n o f f i b r o b l a s t l i k e s y n o v i o c y t e s a n d i t s a p p l i c a t i o na d v a n c e i n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f i n f l a m m a t o r y a r t h r o p a t h y*X I O N G A o1,2,X I O N G R e n p i n g2,P E N G Y a n2,X U J i a n z h o n g1ә(1.D e p a r t m e n t o f O r t h o p e d i c s,F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y,Z h e n g z h o u,H e n a n450052,C h i n a;2.A r m y C h a r a c t e r i s t i c M e d i c a l C e n t e r o f P L A,C h o n g q i n g,400042,C h i n a)[A b s t r a c t] T h e m a i n c a u s e o f d y s k i n e s i a i s v a r i o u s k i n d s o f i n f l a mm a t o r y j o i n t d i s e a s e(I J D).T h e c h a n-g e s o f j o i n t s y n o v i u m f u n c t i o n a f f e c t t h e p a t i e n t s'm o t o r f u n c t i o n.I n t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t u s,t h e f i b r o b l a s t-l i k e s y n o v i a l c e l l s(F L S)i n t h e s y n o v i a l t i s s u e p a r t i c i p a t e i n t h e l u b r i c a t i o n o f b o n e a n d j o i n t;i n t h e p a t h o l o g i-c a l s t a t e w h i c h p a r t i c i p a t e i n t h e o c c u r r e n c e a n d d e v e l o p m e n t o f I J D,i n d u c e a r t h r i t i s a n d d e s t r o y t h e s y n o v i-u m,a r t i c u l a r c a r t i l a g e a n d j o i n t.F L S p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e p a t h o l o g i c a l p r o c e s s o f(I J D.I n o r d e r t o f u r t h e r s t u d y t h e r o l e o f F L S i n I J D,u n d e r s t a n d t h e p a t h o g e n e s i s o f I J D a n d s e e k t h e t r e a t m e n t t a r g e t s,t h e i n v i t r o s t u d y o n I J D f o r F L S i s t h e h o t s p o t a t h o m e a n d a b r o a d.T h e r e f o r e t h i s p a p e r r e v i e w s t h e f u n c t i o n o f F L S i n p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l s t a t e,a p p l i c a t i o n p r o g r e s s o f F L S i n d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f I J D i n o r d e r t o p r o v i d e t h e h e l p f o r t h e s t u d y o f p a t h o l o g i c a l m e c h a n i s m a n d t r e a t m e n t t a r g e t o f I J D.[K e y w o r d s]f i b r o b l a s t l i k e s y n o v i a l c e l l s;i n f l a mm a t o r y j o i n t d i s e a s e;o s t e o a r t h r i t i s;r e v i e w运动障碍的主要原因是各部位炎性关节病(I J D),导致关节滑膜的功能改变从而影响患者的运动功能㊂关节滑膜㊁分泌滑液及免疫细胞,在生理状态下,营养软骨㊁清除微小损伤或吞噬细菌和病毒,抑制炎症产生,修复关节组织,维持关节腔稳态;在病理状态下,如I J D,可释放炎症介质,导致或加重骨关节炎症的发生[1-2]㊂成纤维样滑膜细胞(F L S)在滑膜的生理和病理功能中起着重要作用㊂F L S参与的润滑和免疫调节及维持关节腔稳态依靠的是F L S能分泌大量的长链多聚透明质酸和多种结缔组织;此外,F L S 是软骨组织工程中的优质种子细胞来源,因为其还具有离体分化成软骨细胞的潜能[3]㊂I J D导致滑膜炎症㊁增生㊁纤维化和新血管形成[4],同时使滑膜产生更多的促炎细胞因子,进一步诱导F L S的促炎状态,导致蛋白酶和促炎细胞因子产生增加[5-6]㊂采用慢病毒载体介导m i R-140行关节腔注射治疗大鼠实验性类风湿性关节炎,可以减轻滑膜炎症,减少新血管形成及关节软骨破坏[6-7]㊂F L S参与了I J D的免疫应答㊁血管新生和关节破坏等病理过程[8]㊂F L S在I J D病理过程中扮演着重要角色㊂为了深入研究F L S在I J D中的作用,搞清楚I J D的发病机制㊂对F L S的研究是国内外热点㊂本文将对F L S在生理和病理状态9931重庆医学2021年4月第50卷第8期*基金项目:国家自然科学基金项目(81701915)㊂作者简介:熊翱(1995-),在读硕士,主要从事骨科运动医学㊁创伤基础与临床研究㊂ә通信作者,E-m a i l:139********@163.c o m㊂下的功能及F L S在I J D诊疗中的应用进展进行综述,以期为I J D的机制研究和治疗措施提供帮助㊂1 F L S的生理特点和生理作用1.1关节滑膜的解剖学和组织学在解剖学上关节滑膜组织分为两层:内膜层和下膜层㊂内膜层与关节内腔相通,厚20~40μm,其基质膜上松散分布1~3层细胞,嵌入了Ⅰ~Ⅳ型胶原;而下膜层仅由散在分布的血管和细胞的结缔组织网构成,比内膜层更稀疏,主要由Ⅰ型胶原组成㊂正常的滑膜组织,主要由F L S和巨噬细胞样滑膜细胞(M L S)组成㊂F L S数量占所有滑膜细胞的2/3,是滑膜组织的主要功能细胞[9]㊂F L S呈梭形,细胞中央的核显椭圆形,内膜层的F L S数量多于下膜层[10]㊂波形蛋白是F L S的蛋白标志物[11]㊂C D68是M L S和F L S的互相鉴别标志物,M L S具有人类白细胞抗原(H L A)-Ⅱ类抗原,具有吞噬能力,C D68呈阳性;F L S 缺乏H L A-Ⅱ类抗原,不具有吞噬能力,C D68呈阴性[12]㊂1.2 F L S的生理功能1.2.1 F L S对关节具有平衡作用关节滑膜层具有可变形的牢固的组织结构,借此支撑着关节腔的运动㊂网状结构的滑膜层紧贴于软骨表面,允许通过血浆小溶质,这对营养没有血管的软骨细胞群至关重要,因为软骨是一种成分简单而结构复杂的组织,损伤后难于修复[13]㊂成熟的内膜层F L S分泌高浓度的长链-多聚-透明质酸完成关节腔润滑和免疫调节作用[12]㊂同时内膜层F L S还能产生糖蛋白润滑素,润滑关节腔,阻止关节腔纤维粘连,维持关节的正常活动㊂1.2.2 F L S对关节滑液量有调节作用滑液由血浆渗出形成㊂F L S受到过多滑液的机械压力,透明质酸会被F L S负反馈调节,胶体渗透压降低,进而减少了滑液的产生㊂影响滑液成分及含量的因素包括关节发生炎症时关节摩擦刺激㊁血管内皮细胞的开放及细胞间渗透压的协同作用等[14]㊂1.2.3 F L S对关节正常的炎性反应有控制作用F L S的D A F(C D55)及其受体C D97能诱导M L S 的免疫球蛋白F C RγRⅢ表达[15],以调节补体通路的应答[15]㊂补体受体21能够在体外培养的F L S中被诱导,F L S能够通过其与白细胞的相互作用调节白细胞的功能㊂因此,滑膜内膜层的F L S有可能阻止单个核细胞进入关节腔,继而控制白细胞的比例达到清理关节腔碎片的目的[16]㊂1.2.4 F L S对关节囊有修护作用F L S具有分泌多种结缔组织成分的能力[17]㊂F L S也合成组织蛋白酶㊁丝氨酸蛋白酶等基质重塑和细胞运动所需要的酶㊂这些酶一旦异常活化,就打破了对结缔组织的基质溶解㊁合成和组装之间的平衡㊂所以,F L S在滑膜重塑中作用重大[16]㊂2 F L S在I J D中的特征及其作用2.1 F L S表达的细胞因子和受体及其作用白细胞介素(I L)-1β活化F L S,使其产生与炎症相关的基质金属蛋白酶(MM P)-1和MM P-13[18]㊂另外,I L-1β通过上调F L S中的环加氧酶-2(C O X-2)诱导前列腺素E2(P G E2)的产生来影响O A等I J D病理过程[19]㊂P G E2能增加MM P s和其他分解代谢产物的产生,从而影响关节组织的结构和功能[20]㊂F G F-2/F G F R信号通路的激活,上调肿瘤坏死因子-α(T N F-α)㊁I L-1β,加剧软骨损伤㊂关节炎症产生的热休克蛋白和坏死细胞可刺激T o l l样受体(T L R s),继而通过经典的核因子-κB(N F-κB)转录因子诱发炎性反应,导致组织破坏㊂激活后的F L S,释放F G F-2/ F G F受体1(F G F R1),二者相互作用,从而激活多种信号通路,调节滑膜炎性反应,影响修复损伤的软骨㊂T N F-α㊁I L-1β㊁I L-17㊁干扰素(I F N)-γ㊁I L-6和转化生长因子-β(T G F-β)等细胞因子,C C R2㊁C C R5㊁C X C R4㊁C X3C R1等趋化因子受体,血管细胞黏附因子-1 (V C AM-1)/C D106㊁细胞间黏附因子-1(I C AM-1)/ C D54等白细胞相互作用的细胞表面受体,都在I J D 的发病机制中起着重要作用[21]㊂2.2 F L S的增生及其作用越来越多的研究显示,风湿性关节炎(R A)等I J D 的典型病理变化特征是滑膜明显增厚,其F L S的异常增殖和侵袭,是R A等I J D发生㊁发展的重要机制[22-25]㊂F L S的增殖特性类似肿瘤细胞,可突破屏障向软骨及骨侵入,直至破坏关节[24]㊂除此之外,I J D 病程到一定阶段,F L S具有过异常表达生长因子的作用[22-25]㊂这些生长因子使F L S有丝分裂过度,导致F L S增生和肥大㊂F L S增殖导致滑膜组织过度增生,耗氧增加,乏氧微环境形成,从而使缺氧诱导因子(H I F)活化,导致其介导的相关基因表达,影响滑膜新生血管形成和加重I J D病情向前发展[26]㊂2.3 F L S激活产生的炎性反应及其破坏作用F L S被激活后,I L㊁I F N㊁T N F㊁集落刺激因子㊁生长因子和趋化因子等细胞因子应运而生㊂N F-κB通路作为炎症的主要通路,参与了I J D炎性反应的各个阶段[27]㊂I J D,激活I L-1㊁T N F-α等炎症因子,产生炎症级联,使细胞降解酶类,同时趋化因子及其受体被诱导产生[28],从而使软骨关节破坏㊂软骨细胞H I F-2α在骨性关节炎(O A)等I J D发生过程中的激活,使F S L大量分泌基质金属蛋白酶(MM P)-1㊁MM P-2㊁MM P-3等多种降解酶及持续合成C O X-2㊁N O等分解代谢因子,加剧软骨的凋亡和软骨的炎性反应[27],使关节软骨进一步破坏[29]㊂3 F L S作为I J D治疗靶点的应用进展3.1针对F L S活化而导致的胞内代谢异常I J D使F L S活化㊁增殖和侵袭能力增强,同时糖代谢增强,增加乳酸含量,导致F L S的侵袭㊁血管异常0041重庆医学2021年4月第50卷第8期增生㊁滑膜血管翳形成[30-31]㊂I J D的F L S富含血管内皮生长因子(V E G F)㊁血管细胞黏附因子(V C AM1)和琥珀酸,其有促进血管形成的重要作用㊂沉默和抑制T L R4可使F L S的I L-6㊁I L-8㊁MM P-1㊁N F-κB㊁激化蛋白-1(A P-1)㊁V E G F㊁MM P-9和增殖细胞核抗原(P C N A)蛋白表达下调,抑制F L S活化㊁增殖和侵袭,达到治疗I J D的作用,其中T L R4抑制剂T A K-242有潜力作为I J D的治疗药物开发[25,32]㊂在应用抗原诱导关节炎后的琥珀酸受体(G P R91)敲出小鼠,巨噬细胞活化程度下降,同时I L-1β水平降低[30,33]㊂下调糖酵解可抑制F L S的促进炎性因子分泌㊁血管形成及H I F-1α㊁磷酸化信号转导和转录活化因子3 (p S T A T3)㊁N o t c h-11C的活化㊂Z O U等[34]报道,磷酸果糖激酶(P F K F B3)在I J D患者F L S中表达增加;抑制F L S中的P F K F B3活性,减轻关节炎症,F L S摄糖能力下降和乳酸分泌减少㊂T A K A HA S H I等[35]报道,应用小分子R N A抑制剂转染F L S等治疗,可抑制F L S增殖和侵袭㊂胆碱激酶在I J D滑膜组织和培养的F L S中均有表达[36],胆碱激酶具有致炎作用,可刺激相应细胞因子的转录和分泌,磷脂酶D抑制剂可有效减少F L S分泌I L-6㊁I L-8㊁C C L-20[37],从而达到治疗I J D的作用㊂若能有效抑制F L S活化,下调促炎因子的释放,可有效地减弱I J D有害炎性反应的发生,达到治疗I J D的目的㊂3.2针对F L S胞内代谢改变与信号通路转导I J D释放T N F-α,从而介导F L S活化,进一步分泌I L-1β㊁I L-6和T N F-α,激活F L S细胞表面或胞内的特异性受体或通道㊂F L S信号转导通路的活化增强了胞内代谢活动[38],促进了I J D的病程进展,加重了I J D的病情㊂S U N等[39]发现S B203580作为p38-MA P K通路抑制剂可使促炎细胞因子的表达受到抑制㊂Z HO U等[40]向I J D大鼠模型注射m i R N A-27慢病毒过表达载体,上调的m i R N A-27可靶向抑制N F-κB信号通路,抑制I J D的发生㊂Z H A N G等[41]报道, N F-κB抑制剂(P D T C),可抑制F L S由m i R-125b引起的I L-1β㊁I L-6和T N F-α的过度表达,提示P D T C 对上调的促炎细胞因子有明显的下调作用,显示减少m i R-125b的表达,可能有助于R A等I J D的治疗㊂抑制磷脂酰肌醇激酶(P I3K)/蛋白激酶B(A k t)信号通路可上调F L S的N F-κB和促炎因子的表达,相反激活P I3K/A k t信号通路,对I J D有抑炎作用[42]㊂S P E I R S等[43]发现,磷酸腺苷(AM P)活化蛋白激酶(AM P K),可抑制信号通路J a n u s激酶(J A K)/信号转导与转录激活子(S T A T)和免疫及其炎性过程㊂F L S 胞内代谢改变与信号通路转导对炎症因子的表达具有调节作用,参与炎症生成和炎症消退阶段㊂因此,抑制或激活信号通路或许是未来治疗I J D的关键措施,这也许会成为抑制炎性反应和治疗I J D的一种有效途径和靶点㊂3.3针对F L S胞内代谢改变与功能异常I J D不断分泌促炎因子,慢性炎性反应持续,F L S 迁移㊁侵袭等,能量消耗增加,缺氧严重,这些生物过程必将改变F L S的代谢㊂例如,在R A患者中,虽然磷脂含量高,但其结构改变,脂肪链较短,对减轻关节活动时的摩擦力无效[44]㊂而且I J D患者滑液的润滑素的含量和质量下调,润滑能力降低,通过信号通路T L R4/M y D88途径转变为致炎信号[45]㊂抑制F L S 中葡萄糖或胆碱代谢,可以调控部分MM P s的表达[36]㊂凋亡抵抗是R A等I J D中F L S最显著的特点㊂在缺乏营养素或乏氧条件下,细胞存活机会是增加自噬㊂I J D中F L S的b e c l i n-1和L C3含量增加,自噬基因表达与细胞凋亡呈负相关[46]㊂研究发现,可以通过增加I J D的F L S的自噬,从而改善凋亡抵抗[47]㊂在I J D的致病机制中,表观遗传学改变存在显著的交叉调节,如D N A甲基化㊁组蛋白修饰和微小R N A表达[48]㊂深入研究F L S表观遗传与代谢之间交叉作用或许可以解释疾病早期和晚期阶段及F L S在I J D中是如何产生疾病促炎因子的,这有利于探讨抑炎机理和治疗I J D的有效途径和靶点㊂综上所述,F L S在I J D的发生㊁发展病理过程中起着重要作用,深入研究F L S在I J D的作用,有利于搞清楚发病机制和寻找治疗靶点,从而控制影响I J D 病程进展的有害因素,为临床提供有效治疗I J D的方向和思路㊂参考文献[1]韩广弢,李皓桓张宇标,等.滑膜在炎性关节病中的作用[J].广西医学,2019,41(12):1545-1548.[2]S I E B E R T S,T S O U K A S A,R O B E R T S O N J,e ta l.C y t o k i n e s a s t h e r a p e u t i c t a r g e t s i n r h e u m a-t o i d a r t h r i t i s a n d o t h e r i n f l a mm a t o r y d i s e a s e s[J].P h a r m a c o l R e v,2015,67(2):280-309.[3]A I R,L A R A G I O N E T,H AMMA K E R D,e t a l.C o m p r e h e n s i v e e p i g e n e t i c l a n d s c a p e o f r h e u m a-t o i d a r t h r i t i s f i b r o b l a s t-l i k e s y n o v i o c y t e s[J].N a t C o mm u 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肿瘤性骨软化症的致病机制及治疗方法
DOI：10.3969/j.issn.1674-2591.2020.06.009-综述.肿瘤性骨软化症的致病机制及治疗方法倪晓琳，夏维波［摘要］肿瘤性骨软化症(tumor-induced osteomalacia,TIO)是一种由于肿瘤分泌过量成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor23,FGF23)引起肾脏排磷增多的罕见代谢性骨病，以进行性发展的骨痛、肌肉无力、骨折等为临床表现。
TIO肿瘤多来源于软组织及骨组织，大多数肿瘤病理类型为磷酸盐尿性间叶组织肿瘤混合结缔组织亚型(phosphaturic mesenchymal tumors mixed connective tissue variants,PMTMCT)。
目前PMTMCT的发生及其过量分泌FGF23的机制尚未明确。
研究报道将近一半的PMTMCT中发现融合基因FN1-FGFR1或FN1-FGF1阳性，推测其为促进肿瘤发生及FGF23分泌的重要机制；Klotho的过表达则可能促进融合基因阴性的PMTMCT的发生及FGF23分泌；缺氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor-1a,HIF-1a)的过度激活促进肿瘤FGF23转录及血管形成。
肿瘤切除是目前治疗TIO的最有效手段。
新兴的治疗方式包括FGF23单抗和FGFR抑制剂，有望成为不可切除、复发及恶性TIO的有效治疗方法。
［关键词］肿瘤性骨软化症；致病机制；融合基因；治疗中图分类号：R681；R738文献标志码：APathogenic mechanism and treatments of tumor-induced osteomalaciaNI Xiao-Un,XIA Wei-boDepartment of Endocrinology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Key Laboratory of Endocrinology of National Health Commission ofthe People's Republic of China,Beijing100730,China［Abstract］Tumor-induced osteomalacia(TIO)is a rare metabolic bone disease caused by renal phosphate wasting due to overexpression of fibroblast growth factor23(FGF23)by tumors.Clinical manifestations include progressive bone pain，muscle weakness，fracture，and so on.Tumors mainly stem from osseous tissue or soft tissue，being considered pathologically as phosphaturic mesenchymal tumors mixed connective tissue variants(PMTMCT).The mechanism of genesis of PMTMCT and excessive production of FGF23has not been clear yet.It was reported that FN1-FGFR1or FN1-FGF1 fusion gene was positive in nearly half of PMTMCT，indicating an important mechanism to promote tumor development and FGF23secretion.Overexpression of klotho may promote the tumor development and FGF23secretion in PMTMCT without fusion gene.Stimulation of hypoxia-inducible factor-1a(HIF-1a)leads to increased transcription of FGF23and angiogenesis in plete tumor resection is the definitive therapy of TIO.Novel treatments including monoclonal antibody against FGF23and inhibitors of FGFR are expected to become effective treatment for unresectable，recurrent and ma-基金项目：国家“十三五”重大新药创制专项子课题(2019ZX09734001-002)；国家自然科学基金面上项目(81670714,81970757)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程协同创新团队项目(2016-12M-3-003)作者单位：100370北京，中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科国家卫生健康委员会内分泌重点实验室通信作者：夏维波，E-mail:xiaweibo8301@lignant tumors.[Key words]tumor-induced osteomalacia；pathogenic mechanism；fusion gene；treatment肿瘤性骨软化症(tumor-induced osteomalacia, TIO)是一种因肿瘤组织分泌过量成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor23,FGF23)引起肾脏排磷增多的代谢性骨病，是获得性低血磷骨软化症的最常见形式［1］。
成纤维细胞生长因子在骨形成及骨分化过程中作用的研究进展
成纤维细胞生长因子在骨形成及骨分化过程中作用的研究进展成纤维细胞生长（FGF）因子通过其受体（FGFR）调控广泛的生物学效应，包括细胞增殖、存活、迁移和分化等。
FGF可以通过RAS/MAPK、PI3K/AKT 和PLCγ等信号通路发挥作用，而其中RAS/MAPK信号通路已被了解是起主要作用。
最近一些研究也证明了体外研究FGF对组织再生的生物学作用，未来的研究重点是FGF在神经传导系统和组织再生中的研究，包括皮肤、血管、肌肉、脂肪、软骨及骨等方面的研究，而本文将着重于介绍FGF在骨及软骨分化及形成方面的作用，包括已经被报道的促进或者抑制等，对其在骨方面的作用进行比较全面的综述。
标签：成纤维细胞生长因子；组织再生；骨形成；骨分化组织工程学近些年成为科学研究的重点，其成为通过组织再生修复组织损伤的的潜在方法[1]，在组织工程学中的一个关键因素，就是生长分化因子调控干细胞生物应答和分化的作用。
成纤维细胞生长因子（FGF）就是一类已经被证明的能够促进组织修复和再生的生长因子[2-6]，第一次被发现是在脑垂体提取物中，其广泛表达与细胞和组织中。
FGF1和FGF2最初是从脑和垂体中分离出来作为成纤维细胞的生长因子，到目前为止，FGF家族已经有23个亚型被分离和鉴定出来。
而人类主要含有22种FGF：FGF1、FGF2、FGF3 （INT2）、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7（KGF）、FGF8（AIGF）、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23[7]，人类没有FGF15基因而鼠有，但是鼠的FGF15和人的FGF19具有同源性[8]。
FGF发挥其生物学效应主要是通过与FGF受体结合，激活RAS/MAPK信号通路来实现的，其已被利用的潜在生物学功能是损伤组织的再生与修复，包括皮肤、血管、肌肉、软骨、骨及神经等组织。
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fgfr1flox/flox小鼠与在特定细胞 、组织或器官表达 Cre重组酶 的小鼠交配后 ,可以把表达 Cre细胞的 fgfr1基因的 8～14号外 显子区域敲除 (图 1 ) 。 fgfr1flox/ 小 flox 鼠与 OC2Cre转基因小鼠交 配 ,出生后代通过 PCR 筛选 。鉴定 Cre 引 物为 OCF1: 5′2AT2 GTCTAGGCATGCATAGGGT23′(位 于 O steocalcin 启 动 子 ) 和 OCR1: 5′2GCATCGACCGGTAATGCAGGC23′(位 于 Cre ) , 鉴 定
作者简介 :李福兵 ,男 ,重庆市铜梁县人 ,博士研究生 ,主要从事 fgfr1信号通 路在骨骼发育和骨折修复中的作用的研究 。电话 : (023) 68757040, E2m ail: abbilson@ yahoo. com. cn
通信作者 :陈 林 ,电话 : (023) 68757041, E2m ail: linchen70@163. com 收稿日期 : 2007209214;修回日期 : 2007211209
1. 3 fgf r1flox/flox小鼠鉴定及保种
1. 3. 1 小鼠基因组 DNA 的提取 采取剪取脚趾编号方法 , 从前肢到后肢 ,从右至左依次编号 。剪取的脚趾组织用于提取 基因组 DNA。基 因 组 DNA 提 取 大 致 步 骤 如 下 : 组 织 放 入 1. 5 m l EP管中 ,加入 200 μl 裂解液 ( 0. 5% SDS, 0. 1 mol/L NaCl, 0. 05 mol/L EDTA , 0. 01 mol/L Tris·HCl, pH 8. 0,用前加 20 mg/m l 蛋 白 酶 K 2 μl) , 55 ℃消 化 过 夜 。加 入 100 μl 6 mol/L NaCl,剧烈振荡 (大于 200次 )后 ,冰浴 10 ～30 m in,然 后 14 000 r/m in离心 10 m in,取上清 ,加入等体积异丙醇 ,颠倒 混匀 , 14 000 r/m in离心 10 m in,弃上清 ,干燥后加入 TE缓冲液 50μl, 56 ℃溶解 DNA 1 h, 4 ℃保存 ,用于基因型鉴定 。 1. 3. 2 fgf r1flox/flox小鼠基因型鉴定及保种策略 fgf r1flox/ 小 flox 鼠与 C57BL /6J小鼠交配后得到的后代理论上全为 fgfr1flox/ +杂 合子小鼠 ,用于保种 。 fgfr1flox/flox小鼠的基因型 [6 ]中 , 8～14号外 显子两端含有 2个 LoxP序列 ,采用引物 fgfr1b和 fgfr1c进行小 鼠的基因型鉴定 (图 1) 。2 条染色体都带有 2 个 LoxP序列的 纯合子小鼠 , PCR仅扩增得到 1条 400 bp 左右的条带 。1条染 色体带 2个 LoxP序列 ,同时另外 1条染色体为野生型的杂合 子小鼠 PCR扩增出 400 bp和 360 bp 2条带 。野生型小鼠 PCR 仅扩增出 1条约 360 bp的条带 。引物 fgfr1b和 fgfr1c序列分别 为 : 5′2CTGGTATCCTGTGCCTATC23′和 5′2CAATCTGATCCCAA 2 GACCAC23′。 PCR反应体系参照天为时代公司的试剂说明书 。 PCR条件 : 94 ℃ 4 m in; 94 ℃ 40 s, 58 ℃ 1 m in, 72 ℃ 30 s 32 个循环 ; 72 ℃ 10 m in; 4 ℃保存 。 PCR产物行 2%琼脂糖凝胶 电泳 。电泳完成后用 B io2Rad凝胶电泳成像仪照相 。
M ilitary M edical University, Chongqing 400042, China)
Abstract: O b je c tive To obtain differentiated osteoblast2specific inactivation of fgfr1 m ice. M e tho d s To obtain fgfr1△/ + /OC2C reTG/ + m ice, fgfr1flox/flox m ice obtained from N IH were cro ssed w ith OC2C re m ice. To obtain fgfr1△/△ /OC2C reTG/ + m utan t m ice, fgfr1△/ + /OC2C reTG/ + fu rther cro ssed w ith them selves o r fgfr1flox/flox m ice. A fter fgfr1△/△ /OC2C reTG/ + crossed w ith fgfr1flox/flox m ice, half of their offsp ring were m utant m ice. R e su lts D ifferentiated osteoblast2specific fgfr1 knockout m ice were obtained. Co nc lu s io n fgfr1△/△ /OC2 C reTG/ + m ice were obtained through p roper crossing strategy, which p rovides a suitable p latform for studying
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第 30卷第 4期 2008年 2月
ACTA
第 三 军 医 大 学 学 报 ACADEM IAE M ED IC INAE M IL ITAR IS TERT
IA
E
Vol. 30, No. Feb. 2008
4
论著
文章编号 : 100025404 (2008) 0420280204
成纤维细胞生长因子 1 型受体 ( fibroblast grow th factor recep tor 1, fgfr1 ) 属 于 酪 氨 酸 激 酶 受 体 家 族 , fgfr1信号通路在胚胎发育 、骨骼发育 、血管生成等多种 生物信号通路中有着重要的生物学功能 [ 1 - 3 ] 。 fgfr1
第 4期
李福兵 ,等. 成熟成骨细胞 中 敲除基因 fgfr1小鼠的制备
281
1 材料与方法
1. 1 实验动物
fgfr1flox/flox小鼠从美国国立卫生研究院 (N IH )引进 ,雌雄各 2只 。OC2Cre转基因小鼠 [7 ]由军事医学科学院杨晓教授惠赠 , 雌雄各 2只 ,该小鼠在成熟成骨细胞中表达 Cre重组酶 。 SPF 级 C57BL /6J小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司 [许可证 编号 : SCXK (沪 ) 200320003 ] ,饲养于第三军医大学大坪医院野 战外科研究所实验动物中心 。所有实验动物操作均经第三军 医大 学 实 验 动 物 管 理 委 员 会 许 可 [执 行 标 准 SYXK (军 2002032) ]。
成熟成骨细胞中敲除基因 fgfr1小鼠的制备
李福兵 ,赵 玲 ,鲁秀敏 ,余 瑛 ,何启芬 ,陈锚锚 ,段亚琪 ,戚华兵 ,陈 林 (第三军医大学大坪医院野战外科研究
所全军创伤中心 ,创伤 、烧伤与复合伤国家重点实验室 ,重庆 400042)
摘 要 : 目的 制备在成熟成骨细胞中敲除基因 fgfr1 的特定细胞阶段性基因敲除小鼠 。方法 从美国 N IH 引进
SPF级 fgfr1条件性基因敲除 ( fgfr1flox/flox )小鼠 ,进行饲养 、繁殖和 PCR 鉴定 ; fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达 Cre重
组酶的 OC2Cre小鼠交配 ,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠 ;杂合子小鼠之间交配 ,或者杂合子小
鼠与 fgfr1flox/flox小鼠交配 ,可以获得在成熟成骨细胞中敲除 fgfr1基因的小鼠 fgfr1△/△ /OC2CreTG/ + 。结果 成功制备在成熟
fgfr1 function in bone development and fracture healing.
Key words: fibroblast grow th factor recep tor 1; conditional gene knockout; m ice; bone developm ent
文献标识码 : A
Genera tion of d ifferen tia ted osteobla st spec if ic fgfr1 knockout m ice
L I Fu2bing, ZHAO L ing, LU Xiu2m in, YU Ying, HE Q i2fen, CHEN M ao2mao, DUAN Ya2qi, Q I Hua2bing, CHEN L in ( State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Trauma Center, Institute of Surgery Research, Dap ing Hosp ital, Third
基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 “( 973”项目 ) (2005CB522604) ;国家 自然科学基金杰出青年基金 (30425023) ;国家自然科学基金重点 项目 (30530410) Supported by the National Key Basic Research and Development Plan of China (“973”Project, 2005CB522604) , the National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (30425023) and the Key Pro2 gram of the National Natural Science Foundation of China (30530410)