免疫组化小知识点(较好-Jane-2014.01.15)
免疫组化基本知识
免疫组织化学技术: 基本原理免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。
用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。
免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。
但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
一、免疫荧光法免疫荧光法的基本原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。
常用的荧光素有①异硫氰酸荧光素（fluorecein isothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂。
分子量为389，最大吸收光谱为490～495，最大发射光谱为520～530urn，呈现明亮的黄绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。
②四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC）是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明（rhodamine）的衍生物。
最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。
按照抗原抗体反应的结合步聚，免疫荧光法可分为以下三种。
1．直接法用荧光素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以检查出相应的抗原成分。
2．间接法先用特异性抗体与相应的抗原结合，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的抗特异性抗体（间接荧光抗体）与特异性抗体相结合，形成抗原一特异性抗体一间接荧光抗体的复合物。
免疫组化基础知识
免疫组化基础知识免疫组化是指利用特异性抗体与被检测物相互作用，通过染色或荧光等方法对细胞或组织中的分子结构、分布、表达水平等进行检测的一种技术手段。
免疫组化技术广泛应用于生命科学领域，可用于研究细胞和组织的形态学、生理学、病理学等方面，是现代分子生物学和医学研究的重要工具之一。
免疫组化技术的基本原理是利用抗体与被检测物之间的特异性结合来检测目标分子。
抗体是由机体免疫系统产生的一种特异性蛋白质，可以识别并结合到其特异性抗原上，从而发挥免疫防御作用。
在免疫组化中，我们利用抗体的这种特异性结合作用，来检测细胞或组织中的目标分子。
具体来说，我们将一种特异性抗体标记上染色剂或荧光素等物质，然后将其加入到待检测的细胞或组织中，让其与目标分子发生结合反应，最后通过染色或荧光等方法来检测抗体-抗原复合物的存在情况。
免疫组化技术的优点主要有以下几个方面：1. 特异性强：由于抗体对其特异性抗原具有高度的特异性结合能力，因此免疫组化技术具有非常高的特异性。
2. 灵敏度高：免疫组化技术可以检测非常微小的分子结构或表达水平，因此具有非常高的灵敏度。
3. 定量性好：通过对染色或荧光信号的定量分析，可以对目标分子的表达水平进行定量化分析。
4. 可视化：通过染色或荧光等方法，可以将目标分子在细胞或组织中的分布情况可视化出来。
免疫组化技术在生命科学领域中有着广泛的应用。
在细胞和分子生物学研究中，免疫组化技术可以用来检测蛋白质、核酸、多肽等生物分子的表达和定位情况；在病理学研究中，免疫组化技术可以用来检测肿瘤标志物、免疫球蛋白等分子的表达情况，从而辅助临床诊断；在药物研发领域中，免疫组化技术可以用来筛选药物靶点和评估药效等。
总之，免疫组化技术是一种非常重要的生命科学技术手段，在现代分子生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。
病理科普，迷雾追踪之免疫组化
病理科普，迷雾追踪之免疫组化如今，免疫组化是医学临床病理诊断的有效方法之一。
部分内科需要进行病理检查时，医生都会主动提出做免疫组化，然而相关患者及其家属不够了解免疫组化，难以积极配合检查与治疗。
由此，文章将详细解释何为免疫组化、什么时候需要做免疫组化、免疫组化都有什么作用、免疫组化的常用方法等问题。
1.什么是免疫组化？免疫组化是基于抗原抗体反应原理（抗原和抗体特异性相结合），借助化学反应致使显色剂显色而明确组织细胞内抗原，随后进行定性、定量研究的一类技术，也被称为免疫细胞化学技术等。
免疫组化利用了抗体与抗原结合的特异性，检验时先提取组织、细胞内的化学物质，将其设为抗原或者半抗原，随后借助免疫动物获取特异性抗体，利用此抗体检测人体内相同类型的抗原物质。
因其复合物无色，所以检验人员需要采用特定的组织化学法进行显示，以此进行定位、定性、定量研究，获得精准的检验结果。
2.什么时候需要做免疫组化？近些年，免疫组化等技术快速发展直接提升了疑难肿瘤诊断水平，例如，免疫组化对低分化、未分化肿瘤的诊断正确率超过50%。
当前，如下场景需做免疫组化：2.1辨别与诊断恶性肿瘤；2.2掌握转移性恶性肿瘤原发位置；2.3进行肿瘤病理分型；2.4诊断与治疗软组织肿瘤，因此类肿瘤类型多、形态相似，所以治疗前需要提前组织分类，借助免疫组化进行科学划分与标志；2.5发现微小转移灶，为制定治疗方案、明确手术范围提供可靠依据；2.6为制定与选择治疗方法提供可靠依据，例如是否需要选用靶向药等；免疫组化步骤多、环节关键、影响因素多、耗时长，由此多数医院选用全自动免疫组化染色机等，降低人为失误率，提升诊断精准率。
但需要注意，并非全部病理均需要做免疫组化，应由医生诊断并且针对性选择抗体组合，因为抗体几乎不会达到100%的特异性与敏感性。
3.免疫组化都有什么作用？当前，肿瘤形态较为多样，常规HE切面观察难以精准判定多数肿瘤，需辅助免疫组化。
前者主要从细胞形态、组织结构层面进行诊断，后者主要从分子层面进行诊断，通过患者细胞蛋白水平变动情况诊断肿瘤。
(整理)免疫组化知识
免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。
（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。
3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。
其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是在组织切片或细胞制片的基础上，通过利用特异性抗体与细胞或组织中特定分子间的特异性结合反应，以染色或标记方式来检测目标抗原的一种检测技术。
以下是免疫组织化学染色的一些基本知识点：
1. 抗体选择：根据实验目的选择合适的抗体，一般选择单克隆或多克隆抗体。
抗体可以是来自同种或异种动物，也可以是人源化的。
2. 组织或细胞预处理：包括固定、脱脂、脱水和切片等步骤，目的是保持组织或细胞的形态和结构完整，同时提高抗体的进入性。
3. 抗原解表：染色前需进行抗原解表处理，去除组织或细胞中的内源性酶等物质，以提高抗体的结合效率。
4. 特异性抗体结合：将经过解表处理的组织或细胞与选择的特异性抗体反应，抗体与目标抗原结合形成免疫复合物。
5. 二抗结合：特异性抗体结合后，使用与该抗体结合的二抗（常为抗种属免疫球蛋白）进行结合，放大信号。
6. 染色反应：根据具体实验的需要，可以选择不同的染色反应方法。
常用的染色方法有酶标法（如辣根过氧化物酶染色法，碱性磷酸酶染色法等）和免疫荧光染色法。
7. 结果观察和分析：观察染色结果，可以通过显微镜观察染色位置和程度，分析目标抗原在组织或细胞中的分布情况。
8. 数据分析和结果解读：根据染色结果，进行数据统计和分析，并结合实验设计和背景知识进行结果解读和推断。
总结：免疫组织化学染色是一种用于检测组织或细胞中特定抗原的技术，通过选择合适的抗体、预处理样品、特异性抗体结合、染色反应等步骤，可以获得目标抗原的位置和分布情况，并通过数据分析和结果解读来获取有效的实验结果。
免疫组化
免疫组化(Invitrogen Histostain-Plus Bulk Kit)免疫组化是利用抗原抗体特异性结合的原理，采用已知抗体检测组织或细胞内的抗原性物质，然后通过恰当的方式显示其结合信号以证明组织或细胞内是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量研究。
1.烤片：将选取的石蜡包埋组织以3-4μm厚度连续切片，贴于硅化防脱玻片上，4℃冰箱冷藏保存，使用前恒温箱中60℃烘烤3h或58℃烤片过夜。
2.脱蜡：置于二甲苯I中浸泡15分钟, 再在二甲苯II中浸泡10分钟，最后在二甲苯Ⅲ中浸泡5分钟。
使用宏兹实业的Van-Clear 环保透明剂，可以为10分钟×3次，脱蜡时间也可适当延长，在环境温度较低时尤其如此，因为Van-Clear对石蜡的溶解度与温度相关。
温度越高溶解度越大，36度左右为最佳。
3.水化：无水乙醇I中浸泡10分钟，无水乙醇II中再浸泡10分钟，随后依次在95%→70%→50%乙醇中浸泡5分钟,最后在蒸馏水中浸泡5分钟。
4.放入3%H2O2（30% H2O2用甲醇稀释至250ml,现用现配，配好后4℃避光保存）孵育10分钟，封闭内源性过氧化物酶活性。
5.蒸馏水冲洗后，PBST(1L PBS加入1ml Tween-20)浸泡2分钟×3次，涮洗后将其甩干。
6.抗原修复：由于石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联反应而使抗原决定簇隐蔽。
所以在进行免疫组化染色时，需先进行抗原修复，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，从而恢复抗原的原有空间形态。
A.微波修复：EDTA (PH8.0)或10mM 柠檬酸盐（PH 6.0）：高火5min，解冻2min，低火20min (注意平衡，修复液体积尽量加满，因为加热过程中会有大量损失）；在修复液中自然冷却10min，流水冷却15min(或室温冷却30min以上)。
B.高压修复：将1500ml-3000ml的抗原修复液放入压力锅中，对齐锅盖但无需盖紧，加热至沸腾。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化
1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存)，厚度为5～6μm。
2. 载玻片可不打底，裱片后，55度过夜烤片。
3. 如不马上染色，可密封后- 20℃保存。
4. 染色前用4%PFA在4℃固定10-20 分钟。
5. TBST 洗2 次，每次5 分钟，( 必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，20 分钟，避光;7. 用TBST 洗2 次，每次5 分钟;8. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清(与第二抗体同源动物血清)处理，37℃，15 分钟。
附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)：按1:20比例，用PBS 配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。
9.滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时(也可置于4℃冰箱过夜) 。
10.TBST：5 分钟，2 次(置于摇床) 。
11.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。
12.TBST：5 分钟，2 次(置于摇床) 。
13.滴加三抗(SAB 复合物) ，37℃，40 分钟。
14.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。
15.DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。
附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，冻存。
② 工作液：DAB 储备液20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl16.自来水(细水)充分冲洗。
17.苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。
18.自来水冲洗返蓝，15 分钟。
19.梯度酒精脱水：80%，2 分钟95%，2 分钟100%，2 次，5 分钟。
20.二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各5 分钟21.封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。
免疫组化技术
B B B B
①标记抗生物素-生物素法
抗生物素蛋 标记物
生物素
物素，与生物素结合，然后进
行酶呈色反应。 • 间接法：用生物素标记二抗，
特异性抗体 组织抗原
E A E E B B
酶标记抗生物素，先用第一抗
体与组织抗原结合，再将第二 抗体与第一抗体相连结，最后
特异性抗体进行染色（常用于二抗），结果明显减弱Байду номын сангаас转为阴性。如
先加未标记的非免疫血清或正常血清，则不能抑制染色反应。
免疫组织化学技术应用 注意事项
一、无信号
染色结果对照/标本均无染色。
1、原因：
（1）真阴性结果： 组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号； 或表达抗原太低，所使用检测系统不足以达到检 测所需要的灵敏度。
结果应为阴性，说明染色方法可靠。若出现假阳性，应考虑二
抗、内源酶等。
４．替代对照 用一抗来源的同种动物的非免疫血清代替一抗，染色
结果应为阴性，可证明待检组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂血
清成分所致，而是抗体的特异性反应。 ５．吸收试验 用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体 结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收后的抗体不能再与组织内的 抗原反应，组化结果应为阴性，可证明抗体的特异性。若组化结果为 阳性，说明抗体不纯，阳性染色反应不是待检抗原与抗体特异性反应 形成的。用不相关的抗原吸收第一抗体应不影响染色结果。 ６．抑制实验 待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的
统。
亲和组织化学法
①标记抗生物素-生物素法（labelled avidin-biotin method，LA） ②抗生物素-生物素法( bridge avidin-biotin method， BRA) ③生物素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）
免疫组化
抗原修复
热处理后应注意自然冷却（至少半小时）； 热处理液不要让其煮干； 不要任何抗原的检测都使用该方法； 同一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。
实验步骤
二甲苯 梯度酒 精
石蜡切片
脱蜡、水化
ddH2O或PBS洗 抗原修复
冰冻切片
37度烤片
预 处 理
3%H2O2孵育原修复
抗原修复(Antigen Retrieval，AR)是以高温、高压对常规 固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消 化，以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。
修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸盐缓冲液(CB)；②
EDTA pH9.0。
修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃， 15min；③水浴锅100℃，10/20min；④高压锅/消毒锅 120℃，3min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。
孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟 ABC
放 大 法
去除内源性过氧化物酶
色结果是不可信的。
抗原表达必须在特定部位。如人白细胞共同抗原
LCA和上皮膜抗原EMA应定位在细胞膜上；肌酸激
酶 CK应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位
在细胞核内，等等。不在抗原所在部位的阳性着色， 一概不能视为阳性。
尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞
的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性
免疫组化
SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片，68℃，20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
改良后的SP法。
(1)前期处理:包括组织及时适当取材、充分固定和适宜的石蜡包埋、完整切片(厚度3~5μm),载玻片需经清洗和防脱片处理。
(2)组织切片在55℃~60℃温箱中过夜。
免疫组化1
效价 1：100 1：200 1：400
(参考效价：DAB 1：10002000)
5．荧光封片剂：0.01M PBS：甘油=13：1（我们用 1：1，稠稀之别，不甚重要）
4
2.5% DABCO (Sigma, D-2522):保持荧光不褪色。 DAB 呈色片封片剂：DPX 对照：加正常的山羊血清代替一抗，二抗和三抗正常加。
切片要换厚一些。 切片方法：1、切好后，将室温的玻片置于与刀平行的位置，接近，迅速贴片。
特点：速度快。 2、将玻片事先置于切片箱内（制冷），切好后，将玻片紧贴标本，贴
上后取出，在玻片标本的背面用食指紧贴划过。 注意：若切片老往防卷板上贴，是防卷板太热，不能直冲切片箱内呼
吸，以防箱内过热。 CT: chamber temperature （箱温） OT: objective temperature（头温）应低于箱温 3C 为好。例：箱温-20C 时，
倍。
采用间接荧光法，一抗的稀释浓度高，如 ABC 法为 1：2001000 时，间接法为 1：
100。
如果抗原丰度(abundance，天然含量)大，二者差别小，如果抗原丰度小，二者
差别大，甚至一个染出，一个染不出。
双标时要首先摸清 ABC 荧光法和间接荧光法的浓度。一般来讲，ABC 荧光法用抗
原丰度较小的，而间接荧光法用抗原丰度较大的。
五、切片（视网膜厚度200m）： 准备： 1、将金属头放入切片箱。 2、取视网膜（眼杯），扣出玻璃体（较好，扣不出亦无所谓），放入 0.01M PBS
（0.1M PB，对吗？）。将 0.01M PBS 滴在干净玻片上，平铺，用刀片修块。 3、白色泡沫塑料上挖洞，大小可放入塑料小杯。作用：保温，确保 OCT 上面融
免疫组化基础知识
1.常用的固定剂 （1）甲醛缓冲液
广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时 也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不 利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露， 固定时间不直超过24h。 （2）4％多聚甲醛磷酸缓冲液
广泛应用于光镜细胞化学研究。 （3）戊二醛～多聚甲醛缓冲液
1、荧光色素——能够产生荧光并能作为染料的化合物。 特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收一定频率光能 的生色团和能产生一定光亮子的荧光团。
2、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件： 1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结 合的色素及其降解产物容易排除。 2）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。 3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 4）与蛋白质结合的方法简便而快速。 5）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。 6）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。
胰蛋白酶、胃蛋白酶 2.消化时间
因组织而异，一般为5～30min，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏 抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。
3.非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反
应所出现的染色。
（1）原因分析 组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱
完全抗体；不完全抗体
多克隆和单克隆抗体
免疫组织化学的基本技术
一、取材 1.实验动物
麻醉 （处死），锋利刀片切成大小适中，厚度3mm～4mm。 小型实验动物：灌注（流）固定后取材（生理盐水和4％多聚甲醛） 2.人体材料 活检组织、手术标本、细胞和组织 二、固定 原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用 浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1～12h。
免疫组化
常用荧光素
异硫氰酸荧光素 FITC
吸收光谱：490-495 发射光谱：520-530
明亮的黄绿色光
四甲基异氰酸罗达明 TRITC
最大吸收光谱：550 最大发射光谱：620 橙红色光
免疫荧光显微技术
Substrate-chromogen solution
Fluorochrome-conjugated Secondary Antibody (anti species X) Primary Antibody (species X) Antigen expressing Cell
是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素， FITC) 与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本 的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗 体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作 鉴定和定位。 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。
直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染
色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检 测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再 用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感 性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可 用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增 加。 补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一 步抗原—抗体反应时加入补体，使之与抗原— —抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗 体进行示踪。
临床应用
1.感染性疾病
各种病原体感染后，体内能检出特异抗体或抗原，因此抗 原抗体反应广泛用于感染的确定传染病的诊断、传染后免疫力 的确定等。
2.免疫缺陷病
免疫细胞的鉴定、计数以及功能试验，可帮助免疫细胞缺 陷的诊断。
3.免疫学监测
感染性疾病的免疫学监测有助于疾病的转归与预后判定， 如监测乙型肝炎病毒抗原与抗体的消长有助于乙型肝炎的预后 判定，HIV感染者的CD4＋细胞计数有助于艾滋病的诊断、病情 分析、疗效判定。
免疫组化
一、溶液的配置多聚甲醛配置40g溶于0.1mol/L的PBS液1000ml中，加热至60度。
PH值调节至7.3 PBS的配置取1片PBS溶解到100ml纯水中，加入0.5% TritonX -100 (100ml PBS + 0.5ml TritonX -100)过渡液的配置将20%蔗糖与OCT按2：1的体积混合20%的蔗糖秤取1g蔗糖加入到5ml的1*PBS中4度保存封闭液的配置PBS/TX-100+20%NGS 一张片子大概用100ul，其中加入20ul的NGS一抗的配置PBS+2% NGS+ 一抗（490ul PBS+10ulNGS+ 一抗）常见一抗种类以及稀释度Zpr1 视锥细胞（1:200）Zpr3 视杆细胞(1:200)Zn12 节细胞(1:200)C4C 小胶质细胞(1:200)Tublin 管蛋白（1:1000）GPF 绿色荧光蛋白（1:500）(7)二抗的配置PBS+2%NGS+二抗（490ulPBS+10ulNGS+二抗）常见二抗种类及荧光颜色红色荧光 Cy3 鼠单克隆 1:500兔多克隆 1:500绿色荧光 FITC 鼠单克隆 1:500兔多克隆 1:500二、实验步骤1冰冻切片（1）固定取20条幼鱼放到离心管中，吸去多余的水，然后加入500ul 4%多聚甲醛固定十分钟，然后换液，4度处理过夜（2）脱水吸去4%的多聚甲醛，加入1ml 20%的蔗糖，脱水1h以上（3）过渡吸去脱水液，加入1ml 过渡液，过渡处理1h以上（4）包埋模具内加入OCT将鱼放入槽内，一个槽内放三天鱼，头部均在同一水平面上，尾部指向凹槽的尖端，并标记好鱼的品系，大小以及时间还有人员的姓名（5）将冰冻切片机打开，调整温度为-20度，待温度降到合适温度后开始准备冰冻切片，切片在8um 以上，并使组织排成一条直线，用防脱载玻片粘片，在显微镜下观察组织，片子可以放到零下二十度存储使用前干燥处理一个小时2免疫组化（6）PBST清洗5min*3去除固定液（7）封闭液封闭1h（8）一抗孵化4度过夜（9）PBST清洗10min*3（10）二抗+ DAPI染色（1：1000）避光孵化1h（11）PBST清洗10min,移至玻璃杯，PBST 10min，PBS 10min1抗体的种类多克隆抗体：通过注射抗原得到，有较多的机会和多个不同的抗原决定基，即使某一抗原决定基分子发生改变也不会影响其他抗原和抗体的作用，免疫标记信号强。
免疫组化
三. 免疫组织化学染色的基本技术及注意事项 一) 取材:
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实验动物：取材迅速，器械锋利，灌注前先冲洗， 4%多聚甲醛固定，先快后慢。
人体标本: 活检标本：刀口锋利，减少挤压； 手术切除标本：主要病灶,病灶与正常组织交界处, 病灶周围正常组织。
5. 抗体的分装、稀释、滴加、保存
• 最佳稀释度：特异性染色很强，非特异性染色很弱。
6. 孵育:30min-1hr,RT/37℃,湿盒中或 4℃冰 箱过夜。 7. 切片的洗涤：PBS 充分 避免直接冲洗 8. 显色：光镜下控制5～15 min。
• 辣根过氧化物酶显色：DAB应充分溶解，DAB浓度不宜 过高，避免皮肤接触和吸入 • 碱性磷酸酶显色：NBT＋BCIP
I. 概念
是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应 答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能
与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外
特异性结合的物质。
• 抗原决定簇： 指抗原分子表面有一小部分具有化学活性 基团的区域。它决定了抗原的特异性。 每一种抗原决定簇均可刺激机体产生一种 特异性的抗体，目前已广泛应用单克隆抗体， 对抗原进行特异性的标记。 II. 种类
9.染色结果判断
• 熟悉HE片的诊断 • 理想结果：阳性部位明显，背景清晰，对比鲜明 • 定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细 胞间质 • 区别非特异性染色：染色强度相同、边缘效应
10.衬染：苏木素，甲基绿、核固红 11脱水、透明、封固
四. 免疫组织化学在病理学中的应用
• 用于鉴别肿瘤的组织来源 • 细胞受体检测 • 病毒性抗原检测 • 癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测
Ag*一抗*生物素化二抗*链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶
免疫组化ICH
收波长为490nm，最大发射波长为520nm。
免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。
二、免疫酶法
用酶标记抗体，在组织切片上进行特异的抗原
抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应
的底物，生成有色产物，在显微镜下观察，可间接
地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根
过氧化物酶、碱性磷酸酶等，以辣根过氧化物酶作 为标记物更常用。
亲和免疫组化
葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素－生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一
Biotin-peroxidase Complex, ABC) 生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合， 形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成
常用的免疫酶（染色）方法
免疫酶标法
非酶标法：PAP法
PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”， 既与第一抗体结合，再与PAP 复合物联接，最后用底物显色 剂显色。
抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制， 但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持 一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因 此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象）
阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织；
自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。 在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对 照即可。
出现假阳性的几种原因
1、酶-底物反应时间过长； 2、切片洗涤不充分，或在孵育中切片干燥； 3、抗体的交叉反应：抗体特异性不够，或本身含有与人体 组织发生交叉反应的成分； 4、非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等；
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二抗来源的动物血清封闭的是组织上带电荷基团。因为组织中非抗原抗体反应出现的非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。这并不影响接下来一抗的结合，因为这种结合是特异的，亲和力远远高于因电荷作用的结合，因此会竞争胜出。
过氧化氢的作用是去除组织中的内源性过氧化物酶。不能代替封闭血清。如果你用的是HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗体，过多内源性过氧化物酶会影响显色
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 又称免疫组织化学抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)法。
streptavidin-biotin-peroxidase complex [医]生物素-亲和素-过氧化物酶复合物
总结：
SP和ABC法均属于亲和连接法，另外还有抗原-抗体结合法(例如：PAP法即过氧化物酶-抗过氧化物酶法)
3.免疫组化结果如何分析？
（1）阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
2.SP检测试剂盒
Streptavidin链霉亲和素；链霉素抗生物素蛋白 Peroxidase过氧化物酶
SP法：链霉卵白素-过氧化物酶(streptavidin-horseradish peroxidase,SP)免疫组织化学法，我们常用的是HRP标记。
S-abc法：抗生物素蛋白-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC）
所有的链霉抗生物素蛋白的结合物被推荐用于与生物素-SP-共轭的亲和纯化的第二抗体和生物素-SP-的共轭ChromPure蛋白质 。与抗生物素蛋白-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC），HRP标记的链霉抗生物素蛋白相比更稳定，提供了更少的背景，并且是更敏感的。
对敏感性的增加可能是由于增强组织的渗透和更少的空间障碍，因为共轭的链霉抗生物素蛋白系统的所有组件都是标称分子量小于200,000，这大大低于的ABC。
AP：碱性磷酸酶
[Streptavidin-Alkaline Phosphatase] 链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物
链霉亲和素，从链霉菌分离的细菌蛋白，蛋清在其强大的抗生物素蛋白生物素的亲和力是相似的。因为它更有利的化学性质，所以它是用来作为蛋白的抗生物素蛋白的替代品。 与蛋清亲和素具有净正电荷在中性pH值和包含大约7%的碳水化合物,链霉抗生物素蛋白具有在中性pH值几乎没有净电荷，不含有碳水化合物，并显示出较低的非特异性背景。
（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1-4分为0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最终可以分数相加，再进行比较。