免疫组化试题参考答案

免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。

其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。

2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。

其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。

3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。

其不同点为三步法，且有放大作用，反应完全依赖于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应灵敏度高，背景低。

注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同一种动物，且二抗必须过剩。

4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。

无标记的探针称裸探针。

5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

杂交的双方分别为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。

6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术把握，是组织化学的关键环节，是取得满意效果的必要条件，是提高结果可信度的根本保证。

7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分子。

此技术目前主要应用在生物胺的显示中。

其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。

8.定量分析：定量判断是结果判断中最重要也是具有意义的判断，其判断结果有助于统计学的分析处理。

组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（最终阳性产物）进行测量，以数值反应被检测物质的含量。

此法是阳性结果的进一步检测和分析，更加直观地反应实验结果，更有力地说明实验结果。

常用有人工定量分析与仪器定量分析两类。

9.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。

10.组织化学：指在形态学基础上研究组织或细胞中物质的化学成分和活性，并进行定性、定位、定量及其代谢状态的学科。

其目的是联系形态、化学万分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。

11. ABC法：即亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法，其基本原理是在抗生物素和生物素之间形成共价和不可逆的结合，通过抗生物素在辣根过氧化物酶和第二抗体之间建立生物素桥联，使酶定位于所需测定的特异性抗体周围。

其优点在于易于找到合适的第二抗体。

12.细胞骨架：指细胞内的结构网架，由一些细丝成分组成，包括微丝、微管、中间丝和微梁网格。

二、问答题1.简述酶组织化学的基本原理。

答：在酶组织细胞化学方法中，从原理上讲，可分为两在类型。

一类是酶是活性——酶组织细胞化学方法，属于一般组织细胞化学方法。

一类是酶蛋白质的存在及存在的部位——免疫酶组织细胞化学方法，属于免疫组织细胞化学的内容。

目前，通常是将两者结合起来，即显示酶活性，又酶蛋白的存在、分布及代谢情况。

2.用箭头表示免疫电镜技术（包埋前法）的过程。

答：包埋前法实用于酶标法和PAP法。

具体过程如下：取材→→固定→→冰冻切片（40~150μm）→→免疫染色（同酶标法和PAP法）→→选择阳性部位，在解剖显微镜下，取下阳性部位，裱于盖玻片上→→1%的锇酸固定，1~1.5h→→脱水→→平板包埋聚合→→修块、超薄切片（50~80nm）、裱于铜网→→重金属盐双重染色→→电镜观察、记录、照片。

3.简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。

答：此过程包括：⑴杂交前准备：取材和固定→玻片及盖片的处理（粘附剂的使用）→器皿处理和溶液配制容器的处理→增加组织的通透性和核酸探针的穿透性→减低背景染色→防止RNA酶的污染；⑵杂交过程（杂交反应）：包括变性与杂交；⑶杂交后处理①冲洗：用一系列浓度不同的和温度不等的平衡盐液冲洗（一般原则是盐液的浓度由高到低，温度由低到高），并在冲洗的过程中防止切片干燥；②RNA酶消化处理：仅使用于RNA杂交。

⑷显示/杂交体的检测：①同位素标记者：用放射自显影技术显示。

②非同位素标记者：应选择相应的方式显示。

⑸对照实验：根据核酸探针和靶核苷酸的种类在现有可能条件下选定。

4.组织化学质量控制有哪些方法？答：组织化学质量控制的方法有：⑴实验过程的质量控制：①试剂的质量控制，包括：试剂的特异性和敏感性；最佳的稀释度；在已知阳性和阴性的标本上，观察其染色结果的复合情况；要确定染色的温度和时间；保存的时间和有效期的时间。

②操作步骤的质量控制，包括：组织标本制备的质量控制；操作过程各环节的质量控制a. 各种溶液的浓度、成分、PH值的控制，容器的质量标准。

b. 特殊试剂的配制：c. 步骤中间环节的控制；⑵背景染色的控制①疏水作用②离子作用—电荷作用③内原性酶活性作用④抗体污染或/抗体纯度不高⑤内原性抗生物素/生物素蛋白结合活性⑥抗原的扩散⑦交差反应⑧其它原因。

5.比较PAP法和ABC法的异同。

PAP ABC 灵敏性低（1倍）高（20倍）特异性高更高背景一般有背景一般很少或无背景复合物特点PAP复合物只用于PAP法，且抗体与一抗的种族相同ABC复合物用途广，可通用，用生物素标记的均可用途免疫组织化学（IHC）IHC、ELISA、原位杂交6.简述PAP法的过程。

答：⑴处理切片，封闭内源性物质和避免交叉反应；⑵抗孵育切片，湿室，37℃，30-60分钟；⑶PBS 漂洗，3次，5分钟/次；⑷2抗孵育切片，湿室，室温，37℃，30-60分钟；⑸PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑹加入PAP复合物，孵育30分钟；⑺PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑻染色0.01～0.02%H2O2+0.01～0.05%DAB+0.05～0.10UMTris-Hcl(PH7.40)室温，3-5分钟，避光；⑼漂洗，双蒸馏水洗涤；⑽复染；⑾漂洗，双蒸馏水洗涤；⑿脱水、透明、封片；⒀光镜观察，记录。

7.定量分析有哪些方法？答：⑴人工定量分析；⑵仪器定量分析：①显微荧光分光光度计；②显微分光光度计/仪；③显微图像分析仪：灰度、长度、周边、面积、曲线长等；④流式细胞计数仪；⑤激光扫描共聚焦显微镜技术。

8.增强组织化学染色的方法有哪些？答：⑴酶消化在抗原暴露中的作用：①胃蛋白酶：0.4%、37℃、20～30分钟。

②胰蛋白酶：0.1%、 37℃、5～40分钟。

③链霉蛋白酶：0.06%、室温、10分钟。

⑵微波炉处理在暴露抗原中的作用：其原理在于通过微波管发射较高频率的电磁波而使组织内部的分子发生高速振荡，使组织温度升高，同时加速分子交联，促使组织中抗原决定簇暴露。

步骤：脱蜡、水化的标本微波处理10～20分钟，功率600W→室温冷却15分钟以上→常规免疫细胞化学染色。

⑶不同抗原组织准备方法的检测：主要在固定方法和固定剂上存在差异。

①细胞外和基底膜相关蛋白抗原：交联固定剂碳二亚胺和蛋白沉淀类固定剂乙醇。

②细胞膜和胞浆相关免疫球蛋白：首选蛋白沉淀类固定剂乙醇。

③胞浆酶和胞浆激素：醛类固定剂。

④各类组织和细胞抗原：低浓度的多聚甲醛4-5h（4℃）固定后直接进行冰冻切片。

9.简述结果的判断的类型及意义。

答：结果的判断类型：⑴定性判断，即实验结果真实性判断；⑵定位判断，即结果出现的部位的确定，可以协助定性判断；⑶定量判断是结果判断中最重要也最具有意义的判断。

意义：实验结果的判断直接关系着实验的成败，因此，结果判断是整个实验工作的核心和结论，必须是真实的结果，特别是一些实验结果与前人或与其它文献报道差异较大时，作出结果判断时应特别慎重。

10.简述核酸原位杂交技术的特点。

答：核酸原位杂交技术的特点如下：①特异性与敏感性高。

②在组织细胞内定位可检测的靶序列。

③能够将组织学表现与基因功能的变化相结合。

④可完好的保存组织与细胞的形态结构。

⑤不需要从组织细胞中提取核酸，避免了抽提中核酸量的损失。

⑥对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列。

⑦可用于研究个别细胞中的核酸，而不受组织中其他细胞的影响。

⑧不需要破裂细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。

11.用箭头表示石蜡切片技术的步骤。

答：石蜡切片技术步骤：①取材→②固定→③脱水→④透明→⑤浸蜡→⑥包埋→⑦切片。

12.简述免疫组织细胞化学技术的全过程。

答：免疫组织细胞化学技术全过程：抗原提取和纯化→→免疫动物→→抗体的分离、提取、纯化和效价的确定→→标记抗体→→标本制备→→免疫反应过程→→观察及结果判断与分析。

13.常见的免疫组织化学方法有哪些？答：常见的免疫组织化学方法：①免疫荧光组织/细胞化学技术；②免疫酶标组织/细胞化学技术；③过氧化物酶一抗过氧化物酶法（PAP法）；④抗生物素—生物素复合技术（ABC法）；⑤SPA免疫组织/细胞化学技术；⑥免疫电镜技术。

14.影响核酸杂交的因素有哪些？答：影响核酸杂交的因素：①核酸分子的浓度和长度：核酸浓度大，单链核酸间的碰撞几率大，复性几率大。

单链探针浓度越大，杂交效率高，但双链探针浓度过高会影响杂交的效率。

②温度：温度过高不利于核酸的复性，温度过低不利于少数碱基配对形成的局部双链分离。

③离子强度：离子强度低，杂交速度慢，随着离子强度增高杂交反应率增加。

④杂交液中的甲酰胺：甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可减低核酸杂交的Tm。

⑤核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，复杂性越高，形成正确配对难度越大，反应速度越慢。

⑥非特异性杂交反应：为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。

15.简述核酸分子原位杂交的基本原理。

答：核酸分子杂交是依据DNA双链碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法。

即双链核酸分子（DNA双链）分子分解为单链—变性（采用加热/提PH值来实现）→→杂交后单链聚合为双链—退火/复性。

16.简述组织化学的基本要求。

答：组织化学的基本要求：①保持组织细胞良好的形态结构。

②具备高度的特异性。

③应有一定的灵敏性。

④可重复性。

⑤生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。

17.简述免疫组化在人体研究中的主要用途。

答：免疫组化在人体研究中的主要用途：㈠免疫组化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用：（1）组织起源不明肿瘤的研究；（2）研究病原体与肿瘤的关系；（3）协助确定肿瘤的良恶性；（4）测定肿瘤细胞的增殖活性；（5）分化差的癌和肉瘤的鉴别；（6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶；（7）恶性淋巴瘤的诊断和分型；（8）为制定肿瘤的治疗方案提供依据。