动物病理组织免疫组化制片操作规程
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化操作流程
免疫组化操作流程免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或组织中是否存在其中一种抗原或蛋白质，并进一步定位其在细胞或组织中的分布情况。
下面是免疫组化的一般操作流程：1.样本制备：a.细胞培养：对于体外培养的细胞，将其定植在培养皿中，使其附着在载玻片上。
b.组织切片：将组织固定、石蜡包埋后，用切片机将其切割成小片。
2.抗原修复：a.细胞：用4%的甲醛或冰醋酸将细胞固定，然后用PBS（磷酸缓冲盐溶液）进行洗涤。
b. 组织：将石蜡包埋的组织切片用xylene去除石蜡，并通过一系列浓度递减的酒精进行洗涤。
3.抗体选择和制备：a.选择合适的一抗体与待检测的目标蛋白或抗原有特异性结合。
b.对于小分子抗原，可以直接用抗体进行染色。
对于较大的蛋白质抗原，需要通过特殊方法将抗体标记。
4.抗体染色：a.细胞：将细胞孵育在含有一抗体的PBS中，并进行特定时间的孵育，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
b.组织：将抗体加到待检的组织切片上，经过适当的孵育时间，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
5.反应显色：a.一抗染色：根据抗体的结合情况，选择适合的检测方法，如发光、颜色显现等。
b.二抗染色：对于无法直接检测的一抗染色结果，需要加入二抗，二抗可以与一抗特定的Fc部分结合，形成复合物。
二抗通常被标记为酶，可以与底物反应产生颜色或发光。
6.显微镜观察：a.细胞：将染好的细胞载玻片通常先底片固定，然后在显微镜下观察并拍照。
b.组织：将染好的组织切片在载玻片上，然后将其加入显微镜下观察，并通过摄影或记录图像。
7.数据分析和结果解读：a.根据具体的研究目的，对显微镜下观察到的结果进行统计和分析。
b.根据染色的结果和显微镜下观察到的细胞或组织分布情况，对目标蛋白或抗原的表达进行解读。
总结：免疫组化是一种重要的实验方法，可用于检测和定位细胞或组织中的目标蛋白或抗原。
操作流程包括样本制备、抗原修复、抗体选择和制备、抗体染色、反应显色、显微镜观察、数据分析和结果解读。
免疫组化操作步骤(自编)
免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化标准操作规程(SOP)
免疫组化标准操作规程(SOP)一、实验目的：蛋白物质的定性、定位检测。
二、实验原理：基于利用放射性核素和其他标记物（荧光素，酶，重金属离子等）作为示踪剂，通过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。
三、实验准备材料：移液器（P1ml，P200，Gilon）吸头（10ul，100ul，1000ul，A某ygen）6cm、10cm培养皿（corning）EP管（1.5mL）试剂：胎牛血清(10099-141Invitrogen)1mol/L的TBS缓冲液0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g3%H2O2溶液仪器：通风橱，医用微波炉；四、操作流程1）脱蜡前，应将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。
2）组织芯片置于二甲苯中浸泡15分钟；3）更换二甲苯后再浸泡15分钟；4）二甲苯：乙醇=1:1混液中浸泡10分钟；5）无水乙醇中浸泡10分钟；6）95%乙醇中浸泡10分钟；7）85%乙醇中浸泡10分钟；8）75%乙醇中浸泡10分钟；9）蒸馏水中浸泡10分钟；10）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10分钟；11）抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；12）自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；13）10%血清（TBS配制）封闭30分钟；14）吸弃血清，勿洗加入对应的一抗孵育过夜；15）回收一抗，TBS洗2遍，每次5分钟；16）加入二抗，室温孵育60分钟；17）TBS洗4遍，每次5分钟；18）加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；19）用苏木精30秒，清水漂洗7-8遍；20）脱水封片75%乙醇中，浸置5分钟；21）85%乙醇中浸泡5分钟；22）95%乙醇中浸泡5分钟；23）无水乙醇中浸泡5分钟；24）二甲苯：乙醇=1:1混液中浸泡5分钟；25）二甲苯后再浸泡5分钟；26）更换二甲苯后再浸泡5分钟；27）取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片28）晾干，观察结果。
免疫组化标准操作程序
免疫组化标准操作程序
Elivision™plus免疫组化染色原理：Elivision™plus试剂盒将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。
一、染色步骤：
1、蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3*3分钟）。
2、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3、如有必要，每张切片加1滴或50ul3%过氧化氢溶液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
PBS冲洗3*3分钟。
4、甩去PBS,每张切片加1滴或50Ul的第一抗体，室温下孵育60分钟或4。
C过夜，具体参阅各种抗体的说明书。
5、PBS冲洗3*3分钟。
6、甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul聚合物增强剂（试剂A）,室温下孵育20分钟。
7、PBS冲洗3*3分钟。
8、甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,室温下孵育30分钟。
9、PBS冲洗3*3分钟。
10、甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC 显色液，显微镜下观察3-10分钟。
11、蒸储水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。
12、如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透
明）中性树胶封片；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。
二、染色结果：
镜下观察阳性显色为棕色或红色。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。
取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。
用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。
取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。
一、动物的致死法及取材(一)致死法(1)空气栓塞法向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。
一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。
(2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。
适用于鼠等小动物。
(3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。
适用于小动物。
(4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。
(二)取材注意事项易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。
(2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。
因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。
二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。
(1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。
(3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。
(3)脾一块。
(4)胰一块。
(6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。
右肾一块切成正方形，左肾一块切成长(7)膀胱一块。
(8)肾上腺左、右各取一块。
(9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。
(10)骨脊椎骨一块。
(11)胸腺一块。
(12)子宫宫颈和宫体数块。
(13)睾丸或卵巢各一块。
(14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。
免疫组化操作过程精简版
二步法（无生物素PV6000系列），试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml （根据一抗宿主而定）免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化二甲苯1涮洗一下，二甲苯2中放置15min，接着在三个二甲苯中涮洗（脱蜡彻底表现为组织玻片透明光滑），之后2个100%乙醇，2个95%乙醇，1个85%乙醇中涮洗（时间不严格2min），蒸馏水涮洗2次（时间自己把握）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
高压修复：修复液于高压锅内加热煮沸后关火，待放入组织玻片后等高压锅放气后，中小火煮沸2.5min。
自来水冷却10min左右，蒸馏水洗2次。
3. 每张切片于3%H2O2中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶的活性。
组化笔圈出组织，TBS（pH 7.4）冲洗4次，第一次短时涮洗，后三次每次时间3-5min。
若用胃蛋白酶修复，37℃10min。
4. 甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl一抗（完全覆盖组织），室温（22℃左右）下孵育55min或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. 蒸馏水涮洗2次，TBS(pH7.4)洗3-4次(时间不定)。
甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵25min。
（书上37℃30min）6. 蒸馏水涮洗2次，TBS(pH7.4)洗3-4次(时间不定)。
甩去TBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB，显微镜下观察10-15min （胞核胞质染色均一）。
7. 自来水中涮洗2次（棕黄色），放置于苏木素中复染1-2min，自来水中涮洗，之后可用0.1%HCl分化（75%乙醇配制）；温蒸馏水（40-50℃）放置2-3min返蓝(介于紫色和蓝色之间)。
8.梯度酒精脱水80%、95%×2、100%×2时间适当延长（2-3min）。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70％酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0。
1%HCl浸提两次,水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70％酒精3min、80％酒精3min、90％酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化操作规程
引言概述在免疫组化实验中，操作规程的制定和遵守对于获得稳定和准确的实验结果至关重要。
本文旨在介绍免疫组化操作规程的基本要点，以及在这些要点下的详细步骤和注意事项，以帮助研究人员在实验过程中取得良好的成果。
正文内容1.样本处理1.1采集样本1.1.1准备合适的样本收集工具1.1.2样本收集前的准备工作1.1.3样本收集技巧1.2样本保存与运输1.2.1样本保存条件1.2.2样本运输前的准备工作1.2.3样本运输技巧2.标本处理2.1标本固定2.1.1选择合适的固定剂2.1.2固定时间和温度的控制2.1.3固定过程中的操作技巧2.2组织切片制备2.2.1切片前准备工作2.2.2切片仪的选择和使用2.2.3切片制备的关键步骤3.免疫反应3.1抗原解蔽3.1.1解蔽试剂的选择和使用3.1.2解蔽时间和温度的控制3.1.3解蔽过程中的注意事项3.2抗体处理3.2.1抗体稀释比例的确定3.2.2抗体染色的时间和温度的控制3.2.3抗体处理过程的操作技巧3.3染色方法3.3.1直接染色法的步骤和注意事项3.3.2间接染色法的步骤和注意事项3.3.3特殊染色方法的选择和使用4.影像分析4.1显微镜检查4.1.1显微镜选择和调节4.1.2显微镜检查的技巧和注意事项4.2图像获取4.2.1数码相机的选择和设置4.2.2图像获取的技巧和注意事项4.3图像分析4.3.1图像处理软件的选择和使用4.3.2图像分析方法的选择和运用5.结果解释与报告5.1数据统计与分析5.1.1实验数据的整理与统计5.1.2数据分析的方法与工具5.2结果解释5.2.1实验结果的评估与解释5.2.2结果可能存在的误差和异常情况的识别与解决5.3报告撰写5.3.1报告结构和格式的要求5.3.2结果描述和讨论的撰写方法5.3.3参考文献的引用和列表的编写总结免疫组化操作规程在实验过程中起着至关重要的作用，本文详细介绍了样本处理、标本处理、免疫反应、影像分析以及结果解释与报告的相关内容。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定蛋白质、抗原或标记物在细胞或组织中的表达和分布情况。
它被广泛应用于病理学、生物学和医学研究中。
以下是一份免疫组化操作规程的示例，供参考。
一、实验前准备1.准备所需材料：组织切片、抗体、缓冲液等。
2.检查试剂和设备是否正常，确保实验所需材料的质量和有效性。
3.清洗工作台和实验器具，确保无细菌和异物。
4.根据实验需要，制定实验计划和操作流程，合理安排实验时间。
二、标本处理1.取出组织切片，将其置于洗涤缓冲液中浸泡，去除可能存在的阻碍抗体结合的物质。
2.如果组织切片需要去除蜡质包埋，可在60°C恒温水浴中使其溶解。
3.将样本置于蛋白酶解液中，进行抗原修复，以使抗原暴露。
三、抗体操作1.根据实验目的和样本特性选择合适的一抗和二抗。
2.确定一抗和二抗的工作浓度，一般根据厂家推荐进行稀释。
3. 将抗体加入到含有牛血清白蛋白和Triton X-100的缓冲液中，制成一抗溶液。
4.将一抗溶液加入组织切片上，使其充分覆盖，孵育时间根据抗体性质而定。
5.用洗涤缓冲液进行洗涤，去除未结合的抗体。
6.加入二抗，孵育一段时间以进行特异性结合。
7.再次用洗涤缓冲液进行洗涤。
四、染色和显微镜观察1.加入显色底物，使目标分子显示出颜色或荧光。
2.使用显微镜观察样本，以获得目标蛋白质的表达和分布信息。
3.根据需要进行图像获取和数据分析。
五、清洗和保存1.清洗实验用具和工作台，防止污染和交叉污染。
2.保存样本和显微镜图像的数据，方便后续分析和检索。
3.处理和处置废弃物，遵循相关安全和环保规定。
注意事项：1.实验操作时应穿戴实验服和手套，采取必要的安全措施，尽量避免直接接触有害试剂。
2.操作过程中严格按照冷链保存抗体，并避免其受到高温和臭氧等破坏因素。
3.各操作步骤中的温度、时间等参数应根据具体实验需要进行优化调整。
4.实验结果的解释需要结合正常组织和阴性对照进行比较和分析。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化基本原理及操作流程
免疫组化基本原理及操作流程免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，用于检测和定位特定的抗原或抗体在细胞或组织中的存在和分布。
免疫组化的基本原理是利用抗原与抗体之间的高度特异性结合来实现抗原的检测和定位。
免疫组化的基本操作流程如下：第一步：标本处理标本可以是细胞培养物、组织切片、血液等。
在进行免疫组化前，首先需要对标本进行适当的处理，以使得抗原能够得到良好的保存和定位。
处理方法包括固定、脱水、包埋等。
固定是将标本用适当的化学物质处理，使其固定在载玻片上，并保持其原有的形态和结构。
第二步：抗原检测与定位在标本处理完成后，可以开始进行抗原的检测和定位。
这一步需要使用特异性的抗体来与目标抗原结合。
抗体通常通过动物免疫技术获得，即将纯化的抗原注射到动物体内，激发其产生特异性的抗体。
抗体经过收集和纯化后，将其与抗原所在的标本接触，通过抗原与抗体的特异性结合来检测和定位抗原的存在和分布。
第三步：抗体检测抗体检测是免疫组化中至关重要的一步。
通常使用标记抗体来检测抗原的存在和定位。
标记抗体是一种与特定抗体共价结合的物质，它可以通过荧光染料、辣根过氧化物酶、生物素等标记物来实现抗原的检测和定位。
标记抗体通过特异性结合抗原，使得抗原能够在显微镜下观察到，并确定其存在的位置。
第四步：显色与观察在完成抗体检测后，需要进行显色以使抗原能够在显微镜下观察到。
显色方法包括使用荧光显色、暗场显色、免疫酶染色等。
其中，免疫酶染色是最常用的方法，它通过在抗体中添加酶标记物，如辣根过氧化物酶（HRP），再加入适当的显色底物，使其生成可见的色素沉淀。
经过显色后，使用显微镜观察标本，可见到抗原的存在和定位。
第五步：结果分析与解读在观察到显色结果后，需要对结果进行分析和解读。
根据显色的程度和分布情况，可以判断抗原的阳性与阴性。
阳性表示抗原在样品中存在，而阴性则表示抗原在样品中不存在。
结果的解读需要结合临床和实验的背景知识进行综合分析。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。
它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。
I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。
b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。
2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。
具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。
b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。
3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。
4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。
b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。
5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。
常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。
b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。
6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。
b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。
c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
主要试剂的配置（1） PBS缓冲液NaCl g磷酸氢二钠 g磷酸二氢钠 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）L柠檬酸盐溶液（PH ）A液：柠檬酸溶液(4℃保存)柠檬酸1000mlddH2OB液：柠檬酸钠溶液(4℃保存)柠檬酸钠1000mlddH2O900ml dH2O 缓冲液现用现配（1000ml mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)充分混合，调整PH ，充分混合，调整PH （3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)%Triton的配制Triton原液 ml液4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清 50µl%Triton 950µl4℃保存。
免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ 5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中）。
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动物病理组织免疫组化制片操作规程
1、取材选材部位以病灶与正常组织交界处的组织标本为好，取材要完整，要尽可能注意到整个器官的结构特点。
大小一般是1cm×1 cm×0.5 cm为宜。
在夹取组织时不要用力压、挤、揉等以免损坏组织。
2、固定以10%中性福尔马林固定液（固定液的量应为组织块的10-20倍）固定时间24-36小时。
组织长时间固定，固定液中的福尔马林含有的杂质会产生一种酸，影响核的染色，整个组织显得非常陈旧。
3、全自动脱水机：包括脱水、透明、浸蜡等步骤
3.1、脱水组织经固定后，内含大量水分，须除尽水分才利于透明、浸蜡。
常用酒精为脱水剂，逐级提高酒精浓度，以防组织过度收缩、变脆或脱水不完全而影响制片效果。
脱水一般在室温下进行，由60%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精I、100%酒精II组成。
组织块在酒精中时间不宜过长，否则组织块容易变硬。
如切片后的蜡块中央呈灰白粗糙而不透亮，放置一段时间后蜡块中央出现一陷窝，此即表明组织脱水不够彻底，组织面暴露后水分蒸发，蜡块中央收缩形成陷窝，严重时难以切出完整切片。
注意定时更换新的脱水剂，一般在使用到1500个脱水盒(含组织块)后即可考虑更换脱水液。
3.2、透明在室温下，组织块采用二甲苯或TO透明剂中进行透明。
一般透明剂分为I、II两个试剂缸。
组织在二甲苯或TO透明剂中贮留时间必须严格掌握，时间稍长，则组织脆硬易碎；时间过短，石蜡不易渗透进去，使浸蜡不完全。
3.3、浸蜡恒温杯内温度应调至58-60℃为宜，使石蜡熔化完全。
石蜡分为I、II两个缸。
尽量控制组织块在石蜡中的浸泡时间，时间过长组织易碎；时间过短，石蜡未渗透进去，组织不能切片。
附：自动脱水机使用操作规程
4、包埋将温箱中熔化好的石蜡倒进包埋框内，迅速用热镊子将组织放入包埋模具内，将要切的面朝下并摆正位置，多块的小的组织应集中放在一起，处于一个水平面上，管状组织如血管、气管、肠道等须立起来包埋，然后压上塑料盒，再注入少量的石蜡液，将其移放室温下一定时间后，再转移至冰冻台上冰冻固定，待其蜡块完全凝结后，取出蜡块，修切去抱抱盒周边浓度余蜡。
5、在普通载玻片上涂一层合适的组织粘附液，或使用免疫组化专用载玻片。
6、切片在切片前，须对蜡块进行修切，如此才能适合于切片。
切片机装上锋利的切片刀(刀的斜度为5度)，调节器调在4-6微米厚度，调整蜡块切面使之与刀口平行。
左手平持毛笔，右手旋动切片机把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，切片切取一定长度之后，用毛笔或镊子轻轻取起石蜡切片，平铺于摊片机恒温水里，使石蜡切片展平。
7、裱片摊烘烤片机内水温保持在40-45℃，将切片光泽面向下铺于温水上。
等切片展开后用清洁的载玻片从水中捞出，拨正位置，把贴好切片的载玻片放在摊烘烤片机的烤片板上，烤干水分。
8、烤片把贴有切片的载玻片直立放在染片架上，送入59~63℃左右的温箱中烘烤4~6小时，直到蜡片融化，组织片成半透明状。
注意烤片温度的控制。
9、二甲苯或TO透明剂脱蜡，降梯度酒精洗脱，最后自来水冲洗。
10、将1500mL抗原修复液放入不锈钢高压锅中加热直至沸腾，盖上锅盖，但不盖紧、不关闭加压阀。
11、将染色架放入高压锅内，让切片完全浸没再修复液中，盖上锅盖，关闭加压阀。
12、计时月6min。
关闭电源，打开加压阀，并于其上加盖一湿毛巾。
高压蒸汽未放完严禁打开锅盖。
13、压力正常后，打开锅盖，取出高压锅内胆，放入预放好的冷水中冷却。
14、取出染色架，立即放入自来水中冲洗。
15、PBS冲洗。
16、3%H2O2液阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10min。
17、流水冲洗，PBS液洗，擦干切片组织周围表面水分，PAP笔划圈；
18、滴加稀释的正常血清孵育10min。
19、用最佳稀释浓度的一抗工作液孵育，室温或37℃下2~3小时。
PBS冲洗。
20、滴加生物素标记的羊抗兔/鼠二抗工作液，室温下孵育20min。
PBS冲洗。
21、滴加HRP标记的链霉亲和素(三抗)，室温下孵育20min。
PBS冲洗。
22、DBA显色工作液孵育3~10min。
PBS冲洗。
23、苏木素复染，脱水、透明盒封片。
结果：阳性物质在胞（浆）内呈棕黄色细颗粒状。
免疫组织化学染色结果判断：
细胞相应部位（细胞核、细胞浆、细胞膜等）出现黄色反应为阳性，以阳性对照成份阳性而检测部分无反应为阴性。
根据显色强度和阳性细胞数两项指标判断阳性等级。
按显色强度分为无色、淡黄，黄色、棕黄色，分别计为0、1、2、3分；按阳性细胞占同类细胞的比例分为0、<1/3、1/3~2/3、>2/3，分别计为0、1、2、3分。
将两项积分相乘，确定0分为阴性，1~3分为弱阳性，4~6分为中等阳性，9分为强阳性，分别计为—、+、++、+++。
注意事项：①操作过程中组织必须保持在湿润状态，不能干燥；②所加试剂以完全覆盖组织为度。