免疫组化标准操作规程
免疫组化标准操作规程
免疫组化标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫组化实验的实验技术人员和研究生。
（基于基础操作的流程化程序。
）
二、操作规程
1）石蜡切片，常规脱蜡至水；
2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性；
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟；
4）候选步骤：采用抗原修复-微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。
自然冷却，再用3分钟×3次；
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。
倾去，勿洗；
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2至3小时或4℃过夜（最好复温）。
PBS 冲洗，3分钟×5次；
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟到1小时；
8）PBS 冲洗，3分钟×5次；
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或 37℃孵育30分钟到1小时；
10）PBS冲洗，3分钟×5次；
11）显色剂显色（DAB等）；
12）自来水充分冲洗；
13）可进行复染，脱水，透明；
14）选择适当的封片剂封片。
注意事项：本法仅适用于SP法，其它方法请参考相关说明书。
病理科业务学习免疫组化染色步骤
•切片取出后放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
• 取出放入3%过氧化氢水溶液中5-10分钟，以去除内源性 过氧化物酶。
• 取出放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
•取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，注意保持组织湿润状 态但表面不能有液体，要求抗体全部覆盖组织面，不能有气泡，以 使抗体能全部与组织接触。
•取出切片，擦干组织周围体后滴加DAB，显色时间5分钟左右， 如显色时间太短，阳性强度不够，阳性部位不突出，如显色时间过 长，背景着色较深，阳性部位对比差，均不利于诊断。
• 取出洗去DAB，放入苏木素中复染细胞核，一般时间为40 秒左右（依照苏木素新旧不同可适当增减时间）
• 分化、反蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
谢谢！
免疫组化染色步骤
免疫组化标准操作程序
1、常规石蜡切片厚度3～4微米，放入80℃烤片机烤片15分 钟； 2、切片脱蜡程序： 二甲苯I、II、III脱蜡各10分钟； 无水乙醇I、II各5分钟； 95%乙醇I、II各5分钟。 3、流水冲洗，待组织修复。
•组织修复采用高温高压法：待高压锅内EDTA修复液沸腾后，放入 切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，一般修复时间 为2.5-3分钟。
•滴加一抗后放入专用孵育盒内室温孵育1-2小时或4℃冰箱内过夜。 由于一抗孵育时间较长，因此一抗滴加量不宜过少。
•甩掉一抗，切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤， 防止因洗涤不净引起的非特异性染色。
•滴加辣根酶标记聚合物（基本要求同一抗），室温孵育时间为2025分钟。
•取出切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤，防止因洗 涤不净引起的非特异性染色。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程操作流程：1、脱蜡和水化脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤30-90分钟。
（1）置于二甲苯 I中浸泡 10分钟，在二甲苯I I中再浸泡 10分钟；（2）无水乙醇 I中浸泡5分钟，在无水乙醇I I中再浸泡5分钟；（3）95%乙醇中浸泡3-5分钟；（4）80%乙醇中浸泡3-5 分钟；（5）75%乙醇中浸泡3-5分钟；（6）蒸馏水中浸泡3-5分钟；2、去除内源性过氧化氢酶用蒸馏水或 PBS配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 10分钟，PBS/蒸馏水洗3次，每次3-5分钟。
3、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片（1）微波热修复：取一定量的抗原修复液于微波盒中，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档微波P-60继续处理10-20分钟；取出微波盒冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用PBS洗3-5次，每次5分钟。
（2）酶消化方法：常用0.1% 胰蛋白酶和0.4% 胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为10-30 分钟。
4、免疫组织化学染色（1）滴加正常山羊血清封闭液，37℃，30分钟。
（2）甩去多余液体，滴加一抗，37℃孵育1小时或4℃过夜（4℃过夜后在37℃复温30-45分钟）。
（3）PBS洗3次，每次5分钟。
（4）滴加二抗，孵育条件参见所用试剂盒。
（5）PBS洗3次，每次5分钟。
（6）DAB显色，在显微镜下掌握染色程度。
（7）自来水/蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；（8）脱水、透明、封片、镜检。
操作规程1、脱蜡和水化（1）脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤1-3小时，恒温箱温度不得高于70℃，恒温箱内不得长期（超过24小时）存放物品，烤片结束后且恒温箱内没有其他切片等物品，请及时关闭恒温箱，避免恒温箱使用时间过长。
（2）使用通风橱内的二甲苯和梯度乙醇脱蜡，不得将二甲苯和梯度乙醇拿到通风橱外使用。
免疫组化标准操作程序
免疫组化标准操作程序
Elivision™plus免疫组化染色原理：Elivision™plus试剂盒将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。
一、染色步骤：
1、蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3*3分钟）。
2、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3、如有必要，每张切片加1滴或50ul3%过氧化氢溶液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
PBS冲洗3*3分钟。
4、甩去PBS,每张切片加1滴或50Ul的第一抗体，室温下孵育60分钟或4。
C过夜，具体参阅各种抗体的说明书。
5、PBS冲洗3*3分钟。
6、甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul聚合物增强剂（试剂A）,室温下孵育20分钟。
7、PBS冲洗3*3分钟。
8、甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,室温下孵育30分钟。
9、PBS冲洗3*3分钟。
10、甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC 显色液，显微镜下观察3-10分钟。
11、蒸储水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。
12、如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透
明）中性树胶封片；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。
二、染色结果：
镜下观察阳性显色为棕色或红色。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化操作规范
免疫组化操作规范第一、首先确定所下遗嘱能否收上费，一般有住院号的可以确定做免疫组化，最终以收费结果来确定，免疫组化需要用胶片来染色，特染用普通片就可以，所做项目用铅笔在载玻片的磨片上写对应的抗体名称。
第二、胃癌和肠癌套餐用全自动免疫组化仪来做，其他的用手工来操作，切好片子机染和手染分别摆放，机染的需要打好标签方便明天操作，核对医嘱信息是否和所切的片子相符，60℃过夜烤片。
第三、石蜡切片常规脱蜡至水，自来水冲洗干净浸泡在水中待用，不同的抗原做相应的修复，我科常规修复方法有柠檬酸缓冲液修复（2min）、EDTA缓冲液修复(15min)、胃蛋白酶修复和胰酶修复(37℃*30min)。
第四、修复结束后冷却10分钟后（可以用自来水降温），取出切片在相应的组织边缘画圈，然后把画好的切片背靠背放进染缸，染缸内盛有蒸馏水以防止干片。
HRP系统的抗体需要用过氧化氢来阻断，我科需要用3%过氧化氢在摇床上孵育 10分钟即可（3%过氧化氢配制方法：100mlPBS中加入3ml3%过氧化氢，以此类推），倒掉3%过氧化氢在用蒸馏水清洗2遍，然后加入PBS在摇床上洗 3min/2 次。
第五、把切片从染缸中取出放入湿盒中，滴加5%羊血清封闭液，在室温下孵育10分钟。
甩去羊血清（切勿清洗），滴加一抗工作液，室温孵育一个半小时。
甩去一抗工作液，把切片放入染缸中，用蒸馏水清洗2遍，用PBS浸泡下午上班后倒掉PBS，直接滴加二抗工作液，在室温下孵育20分钟。
第六、甩去二抗工作液，用蒸馏水清洗2遍，再用PBS缓冲液洗 3min/2 次。
每1ml DAB缓冲液中滴加1滴DAB，混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 5 分钟，具体颜色自己控制，自来水充分冲洗 , 苏木素复染，分化，返蓝，脱水 , 透明 , 封片。
第七、归类好片子，根据医嘱信息把片子送到医生手中，打印医嘱信息。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化操作规程
引言概述在免疫组化实验中，操作规程的制定和遵守对于获得稳定和准确的实验结果至关重要。
本文旨在介绍免疫组化操作规程的基本要点，以及在这些要点下的详细步骤和注意事项，以帮助研究人员在实验过程中取得良好的成果。
正文内容1.样本处理1.1采集样本1.1.1准备合适的样本收集工具1.1.2样本收集前的准备工作1.1.3样本收集技巧1.2样本保存与运输1.2.1样本保存条件1.2.2样本运输前的准备工作1.2.3样本运输技巧2.标本处理2.1标本固定2.1.1选择合适的固定剂2.1.2固定时间和温度的控制2.1.3固定过程中的操作技巧2.2组织切片制备2.2.1切片前准备工作2.2.2切片仪的选择和使用2.2.3切片制备的关键步骤3.免疫反应3.1抗原解蔽3.1.1解蔽试剂的选择和使用3.1.2解蔽时间和温度的控制3.1.3解蔽过程中的注意事项3.2抗体处理3.2.1抗体稀释比例的确定3.2.2抗体染色的时间和温度的控制3.2.3抗体处理过程的操作技巧3.3染色方法3.3.1直接染色法的步骤和注意事项3.3.2间接染色法的步骤和注意事项3.3.3特殊染色方法的选择和使用4.影像分析4.1显微镜检查4.1.1显微镜选择和调节4.1.2显微镜检查的技巧和注意事项4.2图像获取4.2.1数码相机的选择和设置4.2.2图像获取的技巧和注意事项4.3图像分析4.3.1图像处理软件的选择和使用4.3.2图像分析方法的选择和运用5.结果解释与报告5.1数据统计与分析5.1.1实验数据的整理与统计5.1.2数据分析的方法与工具5.2结果解释5.2.1实验结果的评估与解释5.2.2结果可能存在的误差和异常情况的识别与解决5.3报告撰写5.3.1报告结构和格式的要求5.3.2结果描述和讨论的撰写方法5.3.3参考文献的引用和列表的编写总结免疫组化操作规程在实验过程中起着至关重要的作用，本文详细介绍了样本处理、标本处理、免疫反应、影像分析以及结果解释与报告的相关内容。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定蛋白质、抗原或标记物在细胞或组织中的表达和分布情况。
它被广泛应用于病理学、生物学和医学研究中。
以下是一份免疫组化操作规程的示例，供参考。
一、实验前准备1.准备所需材料：组织切片、抗体、缓冲液等。
2.检查试剂和设备是否正常，确保实验所需材料的质量和有效性。
3.清洗工作台和实验器具，确保无细菌和异物。
4.根据实验需要，制定实验计划和操作流程，合理安排实验时间。
二、标本处理1.取出组织切片，将其置于洗涤缓冲液中浸泡，去除可能存在的阻碍抗体结合的物质。
2.如果组织切片需要去除蜡质包埋，可在60°C恒温水浴中使其溶解。
3.将样本置于蛋白酶解液中，进行抗原修复，以使抗原暴露。
三、抗体操作1.根据实验目的和样本特性选择合适的一抗和二抗。
2.确定一抗和二抗的工作浓度，一般根据厂家推荐进行稀释。
3. 将抗体加入到含有牛血清白蛋白和Triton X-100的缓冲液中，制成一抗溶液。
4.将一抗溶液加入组织切片上，使其充分覆盖，孵育时间根据抗体性质而定。
5.用洗涤缓冲液进行洗涤，去除未结合的抗体。
6.加入二抗，孵育一段时间以进行特异性结合。
7.再次用洗涤缓冲液进行洗涤。
四、染色和显微镜观察1.加入显色底物，使目标分子显示出颜色或荧光。
2.使用显微镜观察样本，以获得目标蛋白质的表达和分布信息。
3.根据需要进行图像获取和数据分析。
五、清洗和保存1.清洗实验用具和工作台，防止污染和交叉污染。
2.保存样本和显微镜图像的数据，方便后续分析和检索。
3.处理和处置废弃物，遵循相关安全和环保规定。
注意事项：1.实验操作时应穿戴实验服和手套，采取必要的安全措施，尽量避免直接接触有害试剂。
2.操作过程中严格按照冷链保存抗体，并避免其受到高温和臭氧等破坏因素。
3.各操作步骤中的温度、时间等参数应根据具体实验需要进行优化调整。
4.实验结果的解释需要结合正常组织和阴性对照进行比较和分析。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。
它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。
I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。
b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。
2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。
具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。
b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。
3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。
4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。
b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。
5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。
常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。
b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。
6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。
b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。
c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。
免疫组化操作流程及注意事项
免疫组化操作流程及注意事项免疫组化是一种常用的生物技术方法，在医学、药物研发、疾病诊断等领域有着广泛的应用。
在进行免疫组化实验时，需要遵循一定的操作流程和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、实验前准备1.检查仪器和试剂：在进行实验前，需要检查使用的仪器和试剂是否正常工作，以避免实验出现错误。
2.样本处理：选择合适的样本来源，并根据实验要求进行样本处理和处理，如组织切片、蛋白抽提等操作。
3.实验区域准备：为了避免实验中的交叉污染，需要保持实验区域的清洁和干净，避免灰尘、细菌等干扰实验结果。
二、抗体处理1.抗体选择：根据实验需要选择合适的抗体，包括一抗和二抗，并进行正确的防止步骤。
2.抗体稀释：需要根据实验所需稀释抗体浓度，以确保实验中的可靠性和准确性。
3.透析：透析是为了去除抗体中的杂质和保持抗体的活性，可以使用多种透析方法，如葡萄糖、盐溶液透析等。
三、标记和显色1.标记：将选择好的一抗和二抗进行标记，例如利用荧光标记、酵素标记等。
2.显色：根据实验需要，将标记好的抗体显色，可以使用多种方法，如荧光染色、染色素染色、酶标记染色等。
四、防止步骤1.防止非特异性结合：在实验过程中需要使用防止多余的非特异性结合，如使用BSA、牛奶等进行防止。
2.防止地基自身活性：在实验中需要使用防止地基自身活性的方法，如将地基胶体蛋白进行处理。
3.防止非特异性染色：在实验中需要使用防止非特异性染色的方法，如对实验组和对照组进行多次染色。
五、实验数据分析1.图像采集：采用高清数码系统进行图像采集。
2.数据分析：使用统计软件进行实验数据的处理，进行可靠性检测、误差范围的确定、结果的图表化呈现等等。
以上就是免疫组化操作流程及注意事项的一些基本介绍，虽然操作流程较为复杂，但是只有遵循操作流程和注意事项，才能够稳定的获得实验结果并进行进一步的研究分析。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平、定位以及相互作用。
以下是免疫组化基本的操作流程：1.组织固定首先，需要对待检测的组织进行固定。
最常用的方法是将组织置于10%的缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24-48小时。
这个步骤的目的是保持组织的形态结构和维持蛋白质的空间位置。
2.制作切片将固定的组织切成5-10微米厚度的切片。
通常使用旋转切片机或者冰冻切片技术来进行切片。
切片后将其放置在载玻片上，通常是带有阳离子的载玻片，如聚胺脂涂层载玻片。
3.抗原恢复固定的组织样本通常会导致部分蛋白质的变性，从而减少抗体的结合能力。
为了恢复这些变性蛋白质的免疫原性，可以进行抗原恢复步骤。
这个步骤通常涉及将切片加热到一定温度，使用酶处理或者盐溶液处理。
常用的抗原恢复方法包括热蒸汽煮沸法、酶消化法等。
4.阻断非特异结合在进行抗体结合之前，需要对样本进行非特异结合的阻断。
这个步骤的目的是防止抗体发生非特异性的结合，从而降低假阳性结果的产生。
通常使用牛血清蛋白（BSA）、奶粉或者干酪蛋白等蛋白质来进行非特异结合的阻断。
5.抗体染色接下来，将切片与目标蛋白质特异性的一抗体一起孵育。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体使用什么抗体取决于试验的目的。
抗体与样本中的特定蛋白质结合后，形成抗原-抗体复合物。
6.检测与显色为了检测抗原-抗体复合物的形成，需要进行二次抗体结合。
二抗与一抗结合，并且经常标记有荧光素或着色剂，用以可视化抗原-抗体复合物。
常用的二抗有荧光标记物（如荧光素、荧光染料等）或酵素标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）。
7.盖片封装在检测和显色后，将玻片放在显微镜下进行观察和分析。
可以使用透明封装剂将玻片封装，以保护样本不受污染和光照损伤。
总结：免疫组化是一种重要的实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
它通过特异性抗体的结合能力来检测目标蛋白质的存在、定位和相互作用。
免疫组化标准操作规程
石蜡切片免疫组化二步法操作规程基于DAKO Real Envision Detection Kit1.65℃烤箱中烤片30min；2.二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸10min，后三缸涮过）；3.梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过）；4.自来水振洗；5.去离子水浸洗1次；6.抗原修复；7.PBS振洗三次；8.3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min；9.PBS振洗三次；10.一抗4℃孵育过夜；11.PBS振洗三次；12.滴加二抗聚合物，室温孵育30min；13.PBS振洗三次；14.滴加DAB，显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色时间；15.自来水冲洗一次；16.苏木素复染30sec；17.自来水清洗一次；18.盐酸酒精分化5sec；19.自来水冲洗30min返蓝；20.梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过）；21.二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸5min）；22.中性树胶封片。
石蜡切片免疫组化三步法操作规程基于DAKO LSAB2 System-HRP Detection Kit1.65℃烤箱中烤片30min；2.二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸10min，后三缸涮过）；3.梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过）；4.自来水振洗；5.去离子水浸洗1次；6.抗原修复；7.PBS振洗三次；8.3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min；9.PBS振洗三次；10.切片置于湿盒中，滴加封闭血清（白色滴瓶装）室温封闭孵育30min；11.甩去封闭血清（无需PBS清洗），滴加一抗4℃孵育过夜；12.PBS振洗三次；13.滴加二抗（黄色滴瓶装），室温孵育30min；14.PBS振洗三次；15.滴加HRP试剂（粉色滴瓶装），室温孵育30min；16.PBS振洗三次；17.滴加DAB，显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色时间；18.自来水冲洗一次；19.苏木素复染30sec；20.自来水清洗一次；21.盐酸酒精分化5sec；22.自来水冲洗30min返蓝；23.梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过）；24.二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸5min）；25.中性树胶封片。
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免疫组化标准操作规程(SOP)
名称：免疫组化标准操作规程(SOP)
关键词：免疫组化
目的：规范免疫组化操作
主要步骤:
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色步骤
Elivision Plus 法（二步法）
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）抗原修复；（视具体抗体情况决定是否要做修复，本抗体PCNA不需修复）；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟，以阻断内源型过氧化酶；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
8）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
9）PBS洗3次各5分钟；
10）甩去PBS液，滴加Ⅱ抗聚合物增强剂40～50μl，室温静置，或37℃半小时；
11）PBS洗3次各5分钟；
12）甩去PBS液，滴加酶标抗鼠/兔聚合物40～50μl，室温静置，或37℃半小时
13）PBS洗3次各5分钟
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。