酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)要点
纤维素酶酶活测定
纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
空白对照用酶活的酶液作对照。
纤维素酶活力测定
山东大学实验报告2011年4月20日姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105一、实验目的1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法2、巩固使用分光光度计二、实验原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。
由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。
三、实验器材（1）722型分光光度计（2）恒温水浴（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）分析天平（7）试管架（8）胶头滴管（9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球四、实验材料（1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）；（2）3、5—二硝基水杨酸显色液；（3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）；（5）蒸馏水。
纤维素酶活力的测定
实验二十纤维素酶活力的测定一、目的学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。
二、原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1 X 1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成X纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料（1）纤维素酶制剂 500mg（2）新华定量滤纸 50mg / 份 4（3）脱脂棉花 50mg / 份 4（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg（5）水杨酸苷 500mg2．主要仪器（1）722 型或其他型号的可见分光光度计（2）恒温水浴 2 台（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）万分之一分析天平（7）恒温干燥箱（8）冰箱（9）试管架（10）胶头滴管（11）具塞刻度试管 20mL24（12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7（13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3（14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1（15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL13．试剂（均为分析纯）（1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。
4℃冰箱中保存（可用 12～15 天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热4 4 6 2水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04），6 5 2 3搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。
纤维素酶活的测定
8・・纤维素酶活的测定一纤维素酶活力单位定义在37°C、pH值为5. 50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的竣甲基纤维素钠溶液中降解lumol还原糖所需要的酶疑为一个酶活力单位Uo二测定原理纤维素酶能将竣甲基纤维素降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成疑又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以汁算反应液中的纤维素酶的活力。
三试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规左的三级水。
3. 1 葡萄糖溶液,c (CeHisOe) =10. Omg/ml称取无水匍萄糖1. 000g,加水溶解，定容至100mlo3.2乙酸溶液，c(CHsCOOH)=O. lmol/L吸取冰乙酸0.60ml,加水溶解,定容至100mlo3.3乙酸钠溶液，c (CHsCOONa) =0. 1 mol/L称取三水乙酸钠1.36g,加水溶解，圧容至100ml.3.4氢氧化钠溶液,c (NaOH) =200g/L称取氢氧化钠20. 0g,加水溶解，泄容至100ml o3.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c (CHsCOOH-CHaCOONa)称取三水乙酸钠11. 57g,加入冰醋酸0.85ml,加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值,如果pH偏离5.50,用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调至5. 50.3.6拔甲基纤维素钠溶液,0.8$ (w/v)称取竣甲基纤维素钠(Sigma C5678) 0. 40g,加入到盛有30ml3. 5缓冲溶液的饶杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至竣甲基纤维素钠完全溶解(在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml),停止搅拌，用3. 5缓溶将英左容至50ml,竣甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
(完整版)纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
纤维素酶活力的测定
目的本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。
本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。
但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。
鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。
1950 年Reese提出了C1-Cx概念。
C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。
再由Cx最终催化形成还原性单糖。
而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。
这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。
（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。
这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。
（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。
将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
纤维素酶活力的测定实验报告
生物化学实验报告题目：纤维素酶活力的测定-----3、5—二硝基水杨酸法姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科3班同组者：张刚刚时间：2011/4/22一、【实验目的】学习和掌握3、5—二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。
二、【试验原理】纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物,在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
实验中定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为1个酶活力单位。
N×OD值对应的葡萄糖量纤维素酶活力单位＝——————————————30×LN——酶液的稀释倍数30——糖化所用时间L——反应酶液毫升数三、【试验器材】比色管10支，5ml移液管，移液枪，500ml大烧杯，水浴锅，电炉，搅拌振荡器，722 型或其他型号的可见分光光度计。
四、【实验试剂】1．酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测（用PH4.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液配制）。
2．0.1mol/L PH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3．3、5—二硝基水杨酸显色液：称取10克3、5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
纤维素酶活力的测定(sdu)
纤维素酶活力的测定高熹 168615140001一、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
二、实验试剂1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。
三、实验器材1、紫外可见分光光度计2、胶头滴管3、水浴锅4、试管5、移液管四、实验步骤1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。
纤维素酶活力的测定
DNS与还原糖的反应
为了统一标准，目前通常用《中华人民共和国轻工行业标
准》QB 2 5 8 3 一2 0 0 3，以滤纸作为纤维素酶作用的底物。
纤维素酶水解滤纸释放的还原糖，与碱性条件下的DNS试
剂发生反应，生成红棕色的氨基化合物，该化合物在540nm下
有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关
系来计算纤维素酶的活力（FPA）。
滤纸 纤维素酶 葡萄糖 DNS试剂
氨基化合物 540nm 测定吸光值
50℃,1h
沸水浴10min (红棕色)
2.3 滤纸酶活力 Filter paper activity(FPA)
l g 固体酶( 或1mL 液体酶) ，在( ( 50℃ ,指定 pH条件下( 酸性 纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶 p H 6 . 0 ) , l h 水解滤纸底物，产生出相当于l m g葡萄糖的还原糖量，为1 个酶活力单位，以 u / g ( 或 u / m L )表示。
纤维素酶液中各种酶的作用方式图
2.2 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原
糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成 红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一 定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利 用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
2） 柠檬酸缓冲液，0.05 mol/LpH4.8( 适用于酸性纤维素酶)
称取一水柠檬酸4.83 g ,溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬 酸三钠7.94g ,用水定容至1000 mL 。调节溶液的pH到( 4.8 士0.05 ) 备用。
纤维素酶活的测定(优选.)
纤维素酶活的测定一纤维素酶活力单位定义在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
二测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。
三试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。
3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。
3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。
3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。
3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50.3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v）称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
纤维素酶活力测定
纤维素酶活力测定（3,5-二硝基水杨酸法）姓名：高超年级：13级生科三班学号：201300140020同组者：樊晓航一，实验目的：1，学习掌握光度计的使用；2，学习用 3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力二，实验原理：1、3,5-二硝基水杨酸法测纤维素酶活力的原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维素二糖、葡萄糖等还原糖，能将 3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙色的氨基化合物，利用比色法测定还原物生成量来表示酶的活力。
2、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖的原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。
在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈橘红色，在 540nm 处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可以测定样品中还原糖的含量。
三，实验器材：器材; 比色管、水浴锅、电炉、分光光度计、容量瓶 100ml、烧杯、移液枪试剂 :1、3,5-二硝基水杨酸试剂,2、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液，溶解后成胶装液，静置过夜，使用前摇匀。
3、酶液（10ug/ml）四，实验步骤：1 ，标准曲线的绘制：在还原糖实验中已做曲线如下：2，. 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。
其它操作同样品管。
3. 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml分别加入到三只比色管中标记为1，2，3，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml 显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm 测OD值4，测得的实验值如下;空白管：01号管：0.4262号管：0.4033号管：0.402五，试验结果分析：由三组平行实验结果，可用0.403带入计算得0.561mg/ml,所以在30分钟内生成的还原糖为14.022mg;酶活力计算公式为：（14.022×100）/30=46.74六，注意事项：1，在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。
本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。
过氧化氢溶液（3%）。
高锰酸钾溶液（002 mol/L）。
磷酸缓冲液（pH 70）。
2、实验仪器研钵。
离心机。
移液器。
分光光度计。
恒温水浴锅。
试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。
四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。
2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。
在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。
向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。
在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。
用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。
纤维素酶活力的测定实验报告
纤维素酶活力的测定实验报告实验名称：纤维素酶活力的测定实验目的：1.掌握测定纤维素酶活力的方法；2.了解纤维素酶的作用机制；3.探究不同条件对纤维素酶活力的影响。
实验原理：纤维素是植物细胞壁的主要组成部分之一，其主要成分是纤维素聚合物。
纤维素酶是一种能够水解纤维素的酶，通过降解纤维素将其转化为可利用的单糖。
纤维素酶活力可以通过测定其在特定条件下降解纤维素的速度来评估。
实验步骤：1.准备纤维素酶的测定液：将一定浓度的纤维素酶和适量的底物溶液混合。
2.将测定液分装到各个试管中，同时设置对照组。
3.将各个试管放置在恒温水浴中，控制温度为37℃。
4.在一定的时间间隔内，取出各个试管，加入一定量的酶停止液，停止反应。
5.将反应液和纤维素酶残余液通过离心仪离心，分离清除残余纤维素。
6. 取出上清液，加入Fehling试剂，进行加热反应。
7. 记录Fehling试剂发生颜色变化的时间，并用同样的方法测定对照组。
8.根据对照组的结果进行归一化处理，计算每个试管中的纤维素酶活力。
实验数据处理与结果分析：将实验数据整理成表格或图表，根据不同条件下的纤维素酶活力进行比较分析。
探究不同因素对纤维素酶活力的影响，如温度、pH值、底物浓度等。
分析结果可以得出，当温度和pH值处于一定范围内时，纤维素酶的活力最高。
底物浓度对纤维素酶活力也有一定影响，但超过一定浓度时，酶的反应速率将达到饱和状态。
实验结论：通过测定纤维素酶在不同条件下的活力1.温度和pH值对纤维素酶活力有显著影响，适宜的温度和pH值可以提高纤维素酶的活力。
2.底物浓度对纤维素酶活力也有一定影响，但过高浓度会使酶的反应速率达到饱和状态。
3.该实验结果可以对纤维素酶的应用提供参考，有助于优化纤维素酶的工业生产过程。
实验总结：通过本次实验，我们成功测定了纤维素酶的活力，并得出了温度、pH 值和底物浓度对其活力的影响。
实验结果对于纤维素酶的应用具有重要意义，可以为其在生物制造、生物能源等领域的应用提供参考。
酶工程实验报告一
酶工程实验报告一一、实验目的本次酶工程实验的主要目的是通过实际操作，深入了解酶的性质、作用机制以及酶的分离纯化和活性测定方法。
同时，培养我们的实验操作技能、观察分析能力和科学思维方法，为今后从事相关领域的研究和工作打下坚实的基础。
二、实验原理酶是一种具有生物催化功能的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够在温和的条件下高效地催化各种化学反应，具有高度的特异性和催化效率。
本实验中所涉及的酶主要是蛋白酶和淀粉酶。
蛋白酶能够水解蛋白质中的肽键，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
其活性可以通过测定水解产物的生成量或底物的消耗量来进行评估。
淀粉酶能够水解淀粉分子中的α-1,4 糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。
其活性通常通过测定淀粉的水解程度来确定，常用的方法是碘量法。
酶的分离纯化是基于酶与杂质在物理化学性质上的差异，如溶解度、分子大小、电荷性质等，采用一系列的分离技术，如沉淀、层析、电泳等，逐步去除杂质，获得高纯度的酶。
三、实验材料与设备1、实验材料蛋白酶提取液淀粉酶提取液酪蛋白淀粉溶液福林酚试剂碘液其他化学试剂2、实验设备离心机分光光度计恒温水浴锅移液器电泳仪层析柱四、实验步骤制备酪蛋白底物溶液：称取一定量的酪蛋白，用氢氧化钠溶液溶解，调节 pH 至适宜值，定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的蛋白酶提取液、酪蛋白底物溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入三氯乙酸溶液终止反应。
测定吸光度：离心去除沉淀，取上清液，加入福林酚试剂显色，在分光光度计上测定吸光度。
计算蛋白酶活性：根据标准曲线计算出反应生成的酪氨酸量，从而计算出蛋白酶的活性。
2、淀粉酶活性的测定制备淀粉溶液：称取一定量的淀粉，用缓冲液溶解，加热糊化，冷却后定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的淀粉酶提取液、淀粉溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入碘液终止反应。
实验八 纤维素酶活力测定实验
实验八纤维素酶酶活力的测定实验【实验目的】1、了解测定纤维酶活力及还原糖的原理。
2、掌握测定纤维酶活力及还原糖的方法。
3、获得部分纤维素酶。
【实验原理】纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称。
它包括C1、C X酶及纤维二糖酶（β—葡萄糖苷酶）。
作用方式：C1酶C X酶纤维二糖酶天然纤维素-----→直链纤维素----→纤维二糖---------→葡萄糖其中C1酶是使天然纤维素晶体都分链，起一个分离作用和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素。
C X酶不能水解天然纤维素，而能水解直链纤维素的β-1，4-葡萄糖酶键，生成纤维二糖，纤维二糖再经过纤维二糖酶水解成为葡萄糖。
本法以滤纸和羧甲基纤维素钠盐作为底物加入一定量的酶液，在一定的条件下起作用，然后观察滤纸的溃崩情况来判断C1酶活力的大小，同时，测定CMC 水解液中还原糖的含量用来表示C X酶活力的大小。
用羧甲基纤维素钠盐(CMC)作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，然后用DNS法测定还原糖的含量，从还原糖的数量来求得酶活力的大小。
纤维素分子是由β-葡萄糖从1，4键相连的长链，由于纤维素的分子间氢键数目极其多，因此不溶于水，在纤维素分子中β-葡萄糖上第2，3及5个碳原子都有一个游离的羧基，如羧基上的氢被羧甲基取代，由于羧基有着很强的亲水性，因此，CMC就能溶于水而成为胶状溶液。
羧甲基纤维素无论在结构上或是在性质上都很大程度地不同于纤维素。
因为它溶于水。
所以，非常容易被纤维素酶水解，在相同的条件下，同一纤维素酶水解CMC所产生的还原糖远大于水解纤维素所产生的还原糖，因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的数值总是比较高的，所以CMC的酶活力只能供参考。
测定还原糖的方法很多，只是采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法，比较简便，3，5-二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色，在一定还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比。
实验---纤维素酶活力的测定
实验纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）一、实验目的掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。
二、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。
三、主要仪器与试剂(一)实验仪器1. 25mL比色管2. 722型分光光度计3. 滴管4.水浴锅5.移液枪6.电炉(二)、试剂1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10.0 g 3,5-二硝基水杨酸，溶入200mL蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水至500mL，升温溶解后，加入重蒸苯酚2.0g，无水亚硫酸钠0.50g。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2. 0.1mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg，溶解后定容至100mL，此溶液含葡萄糖1.00mg/mL。
5. 纤维素酶液：将0.05g酶溶解定容至50 mL，从中取出1.0mL再定容至100mL，待检测用。
（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）四、实验步骤1.标准曲线的绘制：分别吸取0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00m L 葡萄糖标准液于6支25mL比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL，在沸水浴中煮沸显色10min，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。
以空白管调零，在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg数为横坐标，绘出标准曲线。
序号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标液0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.03,5-二硝基水杨酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 实验操作沸水浴加热10min，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定吸光度A550nm0.02.空白管的测定：在2支25mL试管中各加入1.0mL酶液，沸水浴5min，冷却后加3.0mL 0.5%CMC-Na，与样品管同时放入50℃水浴30min。
纤维素酶活力的测定实验报告
纤维素酶活力的测定实验报告1.实验目的本实验旨在通过测定纤维素酶的活力，了解其在不同条件下的活性及作用效果，为进一步研究纤维素酶的应用提供实验依据。
2.实验原理纤维素酶是一种能够分解纤维素为可溶性糖的酶，其活性高低直接影响着纤维素分解的效果。
本实验采用DNS法测定纤维素酶活力，该方法具有操作简便、准确性高等优点。
具体原理如下：在一定条件下，纤维素酶与底物反应产生可溶性糖，其含量可用DNS试剂进行显色反应，根据吸光度值计算可溶性糖的含量，进而求得纤维素酶活力。
3.实验步骤（1）实验准备：准备5mmol/LCMC-Na溶液、10mg/mLDNS溶液、100mmol/LNaOH溶液、纤维素酶溶液；取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、1mL 酶液、2mLNaOH溶液，混合后摇匀。
（2）设置对照：取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、2mLNaOH溶液混合后摇匀，作为对照溶液。
（3）反应：将酶液和对照液分别加入两支试管中，于50℃水浴中恒温20分钟。
（4）显色：取出试管，分别加入1mLDNS溶液，摇匀后再次置于50℃水浴中恒温20分钟。
（5）比色：取出试管，冷却至室温，分别以空白试剂为参比，于540nm波长处测定各管吸光度值。
4.实验结果根据实验数据可知，纤维素酶活力为20.33U/mL，对照液吸光度值为0.65。
5.实验分析通过实验结果可知，本实验条件下得到的纤维素酶活力为20.33U/mL，与文献报道值相符。
这说明本实验所选条件较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，实验过程中采用了DNS法测定可溶性糖含量，该方法具有较高的准确性，因此实验结果可靠。
6.实验结论本实验通过DNS法测定纤维素酶活力，得到了较为准确的实验结果。
这说明本实验所选条件和方法均较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，本实验也为进一步研究纤维素酶的应用提供了实验依据。
在实际应用中，可根据具体需求调整实验条件和方法，以获得更为准确的实验结果。
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)要点
3、实验原理及实验流程或装置示意图：
A 3滤纸酶活力(FPA)的测定原理:
纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。
A4.1.40.1%葡萄糖标准曲线的制作流程：如表一：
取7支试管，编号，按照下表进行操作：如表一所示
试管编号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖溶液体积（ml）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
葡萄糖含量（mg）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
缓冲液（ml）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
DNS (ml)
3
②柠檬酸钠缓冲液，同上。
③磷酸缓冲液，同上。
④CMC-Na溶液：称取2gCMC-Na,精确至1mg，缓缓加入相应的缓冲液约200mL并加热至800℃-900℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300 mL，用2 mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到(4.8士0.05)(酸性纤维素酶)或(6.0士0.05)(中性纤维素酶)，最后定容到300 mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。
⑥快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。
B2.3羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定用到的试剂和溶液：
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC）一目的：掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。
原理：纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。
二试剂：1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。
贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。
2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。
3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。
4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。
5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。
三仪器：分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
四方法步骤：1．标准曲线的绘制分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。
纤维素酶酶活测定
纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
空白对照用酶活的酶液作对照。
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本科学生实验报告
学号104120440姓名孙永升
学院生命科学学院专业、班级10生物技术
实验课程名称酶工程<实验>
教师及职称李俊俊<讲师>
开课学期2012至2013学年第二学期
填报时间2013年4月9日
云南师范大学教务处编印
实验名称
实验方式
小组成员
实验一、纤维素酶活力测定
小组合作
XX
XX
XX
XX
1、实验目的
1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；
1.2学习酶活力的测定方法；
1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；
1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；
2、实验仪器、试剂和溶液：
A2仪器：
A 2.1滤纸酶活力(FPA)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01 pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。
A4.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
②葡萄糖标准使用溶液：分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00 ,1. 00 ,1. 50 ,2. 00,2. 50,3.00,3 .50mL于10mL容量瓶中，用水定容至10 mL，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。
B 2.2滤纸酶活力(FPA)的测定中用到的试剂和溶液：
①DNS试剂：称取3,5一二硝基水杨酸(10士0.1) g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠l0g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
D 3.3.2粘度法1g固体酶(或1mL液体酶)，在(40士0.1)℃、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH6 .0，中性纤维素酶pH7.5)，水解羧甲基纤维素钠底物，使底物粘度降低而得到的相对于标准品的纤维素酶相对酶活力。简写为CMCA-VIS。
4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：
A 4葡萄糖标准曲线制备流程：A4.1绘制标准曲线的方法
lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。
D 3.3羧甲基纤维素酶活力( CMCA)
D 3.3.1还原糖法lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS。
⑥快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。
B2.3羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定用到的试剂和溶液：
①竣甲基纤维素钠(CMC-Na)：化学纯(上海光华化学试剂厂)在25℃,2 %水溶液，粘度800m Pa.s-1200mPa.so (每批羧甲基纤维素钠使用前用标准酶加以校正)。
②柠檬酸钠缓冲液，同上。
③磷酸缓冲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，同上。
④CMC-Na溶液：称取2gCMC-Na,精确至1mg，缓缓加入相应的缓冲液约200mL并加热至800℃-900℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300 mL，用2 mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到(4.8士0.05)(酸性纤维素酶)或(6.0士0.05)(中性纤维素酶)，最后定容到300 mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。
B 3羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定原理：
纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(狡甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。
⑤DNS试剂同上。
3、实验原理及实验流程或装置示意图：
A 3滤纸酶活力(FPA)的测定原理:
纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。
A 2.2羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1
B2试剂和溶液(除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)
B 2.1葡萄糖标准曲线制备：
①葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于( 103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,
②柠檬酸缓冲液，0.05 mol/L pH4 .8(适用于酸性纤维素酶)：称取一水柠檬酸4.83g,溶于约750mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000 mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。
③磷酸缓冲液，0.1mol/L pH6 .0 (适用于中性纤维素酶)：分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在10L去离子水中。调节溶液的pH到(6.0士0.05)备用。溶液在室温可保存一个月。
C 3实验流程:
葡萄糖标准曲线制作 滤纸酶活力(FPA)的测定 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定
D 3酶活定义
D 3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。
D 3.2滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)